外泌體miRNA在心血管疾病中的研究進(jìn)展

孫碩 康品方，2 張恒

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院心腦血管病研究中心，安徽 蚌埠 233000)

外泌體(exosome)是多數(shù)細(xì)胞分泌的直徑40～150 nm的微小囊泡，具有相對穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)。近期發(fā)現(xiàn)，外泌體中含有可作為信號(hào)因子的特異性蛋白、脂質(zhì)和核酸等，影響其他細(xì)胞的活性和功能，參與人體的生理與病理過程[1]，在心血管疾病的預(yù)防、診斷和治療等多方面發(fā)揮重要作用。其主要作用是物質(zhì)傳遞與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這依賴于其內(nèi)含豐富的遺傳學(xué)信息，包括微小RNA(miRNA)、競爭性內(nèi)源RNA、信使RNA(mRNA)和DNA等。miRNA被雙層膜狀結(jié)構(gòu)包裹，穩(wěn)定性更高。前期研究發(fā)現(xiàn)外泌體中的miRNA較分泌外泌體的體液或細(xì)胞的miRNA表達(dá)水平更高[2]，因此，對外泌體中miRNA的測序研究具有更高的臨床價(jià)值。外泌體miRNA參與到多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中，包括血管生成、免疫應(yīng)答、腫瘤增殖侵襲和抗原表達(dá)等[3]。現(xiàn)就外泌體miRNA在心血管疾病病理過程中的最新研究做一概述。

1 外泌體的發(fā)現(xiàn)與生成

胞外囊泡的產(chǎn)生是由胞外物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)攝入一些蛋白質(zhì)、核酸片段和肽類等活性因子后再被分泌至胞外的一系列過程，由于目前很難純化和細(xì)分外泌體亞群，通常得到的是直徑<200 nm的囊泡，因此越來越多的人開始稱之為小細(xì)胞外囊泡。外泌體最早是在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變時(shí)發(fā)現(xiàn)的[4]，1987年被命名為“exosome”。血小板、T/B細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹突細(xì)胞等均可分泌外泌體進(jìn)入體液中，參與胞間通訊，共同維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

自2007年[5]首次在外泌體中發(fā)現(xiàn)mRNA和miRNA后，外泌體miRNA和各種疾病的相關(guān)性研究便逐年增多。miRNA是根據(jù)堿基互補(bǔ)原則直接調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)控細(xì)胞行為的小RNA分子。外源性RNA傳遞是一種有效的細(xì)胞信號(hào)傳遞方法，這一過程也必然會(huì)影響受體細(xì)胞的生物學(xué)功能，因此，某些miRNA可能作為生物標(biāo)志物，對疾病的診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息[6]。隨著高通量測序方法的逐漸成熟，大量的基因片段測序成為可能，也使得外泌體和基因組學(xué)的結(jié)合成為近年的研究熱點(diǎn)。外泌體自身的組分會(huì)隨著胞內(nèi)物質(zhì)的釋放和內(nèi)環(huán)境的變化而發(fā)生特異性的改變，這些特征為其作為疾病的診斷工具提供了可能性。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)各種干細(xì)胞、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)等衍生的外泌體在促進(jìn)血管再生和修復(fù)受損心臟等方面發(fā)揮著重要的作用[7]。

2 外泌體和心血管疾病

2.1 外泌體miRNA和動(dòng)脈粥樣硬化

血管鈣化在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性腎臟病和糖尿病等疾病中常見，血管壁僵硬和順應(yīng)性下降可顯著增加心肌缺血、斑塊破裂和心力衰竭等風(fēng)險(xiǎn)。目前有研究證實(shí)胞外囊泡是病理性血管鈣化的新參與者，調(diào)節(jié)平滑肌的分化和鈣磷代謝，促進(jìn)血管鈣化[8]。成骨相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)加速血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變，是血管鈣化的重要病理過程[9]。研究發(fā)現(xiàn)，高級糖基化終產(chǎn)物牛血清白蛋白通過抑制miR-146a，增加了硫氧還蛋白互作蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生和血管平滑肌的鈣化，糖基化終產(chǎn)物牛血清白蛋白預(yù)處理或miR-146a轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可通過下調(diào)硫氧還蛋白互作蛋白基因來部分抑制血管平滑肌的鈣化[10]。ECs外泌體攜帶的miR-195過度表達(dá)5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控大鼠頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，氟西汀(5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑)干預(yù)可抑制大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜新生物的形成[11]。在正常狀態(tài)下，外泌體發(fā)揮生理功能，維持穩(wěn)態(tài)，但在病理環(huán)境中，由于細(xì)胞骨架方向的改變或囊泡運(yùn)輸和貨物裝載過程中的損傷，某些小囊泡產(chǎn)生了促進(jìn)分化的潛能[12]。

ECs的外泌體可能是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中破壞微鈣化穩(wěn)態(tài)的重要介質(zhì)。粥樣硬化起源于ECs損傷，先后合并脂質(zhì)沉積、纖維增生和鈣質(zhì)沉著等，最終導(dǎo)致動(dòng)脈管壁增厚變硬，管腔縮小[13]。ECs衍生微粒miR-19b可通過調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3，激活血管周圍脂肪組織低水平促炎狀態(tài)，促進(jìn)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化[14]。有些外泌體的miRNA通過介導(dǎo)ECs與平滑肌細(xì)胞之間的信息交換，活躍在動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段。Zernecke等[15]發(fā)現(xiàn)ECs衍生的小囊泡通過富集miR-126向附近細(xì)胞傳遞警報(bào)信號(hào)，靶向抑制負(fù)調(diào)節(jié)因子G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)子16，使趨化因子12“解鎖”，從而驅(qū)動(dòng)趨化因子受體4的表達(dá)。同時(shí)，miR-126可調(diào)節(jié)ECs對血管內(nèi)皮生長因子的反應(yīng)來調(diào)控血管的完整性和側(cè)支血管生成，具有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用。

暴露在層流中的ECs經(jīng)歷高度的剪切應(yīng)力形成湍流，通?？拷鼜澋篮头植嫣?，會(huì)產(chǎn)生較低的內(nèi)皮剪切應(yīng)力，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2在這一過程起重要作用。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2誘導(dǎo)外泌體富集miRNA(主要為miR-143/145)，轉(zhuǎn)移到平滑肌細(xì)胞中，降低靶基因表達(dá)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[16]。Pan等[17]發(fā)現(xiàn)與小鼠ECs相比，細(xì)胞鈣化模型的外泌體中顯著上調(diào)和下調(diào)miRNA分別有987和92個(gè)。差異miRNA的靶基因參與了多種生物學(xué)過程，如發(fā)育、代謝、細(xì)胞成分和生物發(fā)生，以及蛋白激酶B等多種信號(hào)通路。綜上所述，外泌體在ECs鈣化過程中主要發(fā)揮信使作用。

2.2 外泌體miRNA和心肌損傷及壞死

當(dāng)冠狀動(dòng)脈狹窄到一定程度，心肌供需平衡被打破，血流量不能滿足心肌代謝的需要，引起心肌缺血即心絞痛和心律失常等癥狀，持續(xù)的嚴(yán)重心肌缺血可引起心肌梗死。斑塊中細(xì)胞釋放的炎癥物質(zhì)會(huì)破壞纖維帽的完整性，管腔內(nèi)壓力或心肌搏動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力等均可能造成血栓脫落或斑塊破裂，阻塞下游血管，引起急性心絞痛或心肌梗死。心肌損傷可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，外泌體通過運(yùn)輸包括miRNA和蛋白質(zhì)等細(xì)胞質(zhì)成分，促進(jìn)細(xì)胞間通信[18]。

既往研究表明血液循環(huán)中外泌體miRNA譜的改變有助于心肌損傷及修復(fù)的發(fā)生和發(fā)展，是心臟微環(huán)境的重要組成部分。缺氧會(huì)刺激心臟ECs分泌富含miR-126和miR-210的外泌體，通過激動(dòng)PI3K/Akt途徑增強(qiáng)心臟祖細(xì)胞對低氧應(yīng)激的抵抗力[19]。低氧狀態(tài)下的心臟祖細(xì)胞外泌體含有較豐富的miRNA，如miR-17、miR-292和miR-199a等，能誘導(dǎo)ECs的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成，降低結(jié)締組織生長因子、波形絲蛋白、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原水平，增強(qiáng)修復(fù)作用[20]。某些miRNA，如miR-29b、miR-323-5p、miR-455和miR-466等，在心肌細(xì)胞的外泌體中高度富集，調(diào)節(jié)了糖尿病心臟組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)[21]，促進(jìn)ECs的增殖及毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成，保護(hù)氧化損傷的心肌細(xì)胞。miR-144則在缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞中下調(diào)，心肌細(xì)胞內(nèi)miR-144含量可被遠(yuǎn)距離缺血調(diào)節(jié)所調(diào)控[22]。miR-144通過激活PI3K/Akt和p44/p42 MAPK信號(hào)，緩解雷帕霉素對心肌細(xì)胞的損傷，刺激細(xì)胞自噬來增強(qiáng)心臟保護(hù)作用[23]。

也有研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死時(shí)，心肌細(xì)胞分泌外泌體可介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)。Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)心肌梗死組來源H9c2細(xì)胞，與心肌缺血再灌注損傷模型組和假手術(shù)組相比，miR-203水平顯著降低，而過表達(dá)miR-203可通過增加B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，降低B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白，裂解胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9來減弱梗死誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，明顯改善心肌梗死后大鼠心功能，縮小梗死面積。miR-203還可通過調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B來阻止心肌細(xì)胞梗死后的凋亡過程，具有減輕急性缺血對心肌組織的損傷，減少線粒體介導(dǎo)的凋亡的作用，可能是急性心肌梗死治療的潛在靶點(diǎn)。肌鈣蛋白是目前臨床常用的檢測心肌細(xì)胞損傷的指標(biāo)，但并不是特異性指標(biāo)，也可在慢性腎功能衰竭、肺栓塞和非心臟手術(shù)等多種病理狀態(tài)下高表達(dá)。在急性心肌梗死中，有些miRNA在血液中迅速出現(xiàn)，其中miR-1、miR-133a/b、miR-208a和miR-499表達(dá)尤為特異[25]。這表明心肌細(xì)胞來源的外泌體可能較肌鈣蛋白更早在血液中被檢測，有希望作為急性心肌梗死早期診斷的標(biāo)志物。

2.3 外泌體miRNA和心肌重構(gòu)

在心肌肥厚的代償過程中，心肌細(xì)胞、膠原纖維網(wǎng)和胞外基質(zhì)等均發(fā)生相應(yīng)的變化，即心室重塑，是心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的基本病理機(jī)制。外泌體可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，改變局部微環(huán)境，促進(jìn)局部微血管網(wǎng)絡(luò)的形成和再生來修復(fù)受損的心肌組織。Yang等[26]發(fā)現(xiàn)低氧可誘導(dǎo)miR-30a上調(diào)，并向外泌體富集，抑制miR-30a可增加心肌細(xì)胞自噬相關(guān)因子beclin-1、Atg 12和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)，從而增強(qiáng)缺氧后心肌細(xì)胞的自噬反應(yīng)。低氧心肌細(xì)胞外泌體通過旁分泌方式轉(zhuǎn)運(yùn)miR-30a來調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的自噬。Yang等[27]發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌纖維化模型中，心肌細(xì)胞衍生外泌體miR-208a顯著上調(diào)。

由心肌細(xì)胞衍生的外泌體miRNA可通過靶向下游mRNA來調(diào)節(jié)心臟功能[28]，介導(dǎo)心肌修復(fù)和修復(fù)后的細(xì)胞間通訊，如let-7i-5p、miR-21-5p、miR-27A、miR-28-3p、miR-34a、miR-143、miR-222和miR-378-3p等。Qiao等[29]給急性心肌梗死模型小鼠心肌內(nèi)注射正常供體心臟來源外泌體，可改善心臟結(jié)構(gòu)和功能，而注射心力衰竭供體來源外泌體則加重了心功能的惡化和左心室重塑，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-21-5p通過PTEN/Akt途徑促進(jìn)血管生成和心肌細(xì)胞存活。miR-21*在心肌結(jié)構(gòu)和功能的組織中起重要作用，抑制血管緊張素Ⅱ所致心肌肥厚。小鼠miR-21*水平可延緩心肌細(xì)胞的肥大生長[30]。為了加速心肌細(xì)胞損傷恢復(fù)，心臟成纖維細(xì)胞可分泌含有miR-21、miR-208a和miR-499等的外泌體，使心肌代償性肥厚，穩(wěn)定心臟泵血功能[31]。但因缺乏適當(dāng)?shù)目刂?，這些外泌體的過度產(chǎn)生也可能會(huì)促進(jìn)心肌肥大的發(fā)展。通過對心房顫動(dòng)和竇性心律患者血漿外泌體進(jìn)行高通量測序，Wang等[32]發(fā)現(xiàn)4種差異血漿外泌體miRNA，即miR-483-5p、miR-142-5p、miR-223-3p和miR-483-5p，與心房顫動(dòng)獨(dú)立相關(guān)，這些miRNA及其靶基因影響心房功能和結(jié)構(gòu)，參與氧化應(yīng)激和纖維化途徑，對心肌細(xì)胞重塑具有重要作用。

由心臟祖細(xì)胞衍生的外泌體可刺激ECs遷移，這可能有助于心臟修復(fù)和梗死心臟組織的新生血管化，也有研究表明外泌體也能通過促進(jìn)ECs遷移、增殖和單核細(xì)胞活化達(dá)到內(nèi)皮修復(fù)的目的[6]。對缺血性心臟病和慢性心力衰竭患者，這些發(fā)現(xiàn)有望發(fā)展新的治療策略。

3 結(jié)語

心血管疾病占全世界人口死因1/3左右。鑒于死亡率高，需采取新的預(yù)防和干預(yù)心血管疾病的策略。外泌體含有多種信號(hào)分子，通過結(jié)合、融合或內(nèi)吞參與細(xì)胞間物質(zhì)的傳遞和信息交換[5]。外泌體介導(dǎo)靶細(xì)胞的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的病理和生理過程，在各種疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，外泌體miRNA在心血管疾病診療方面有廣闊的前景。