基于pH 梯度法的鹽酸普萘洛爾立方液晶納米粒的制備

曾令軍，陳 旭，張靈娜，張佳良，宋洪濤，周 欣 （中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院藥劑科，福建 福州 350025）

鹽酸普萘洛爾（propranolol hydrochloride，PPL）是治療嬰幼兒血管瘤的一線和首選藥物[1]。口服鹽酸普萘洛爾療效確切，但其存在首過(guò)效應(yīng)強(qiáng)、生物利用度低、半衰期短等問(wèn)題，且不良反應(yīng)發(fā)生率高[2]。普通鹽酸普萘洛爾外用制劑只對(duì)淺表型血管瘤有效，對(duì)深部型和復(fù)合型血管瘤的治療仍需結(jié)合口服給藥。諸多研究表明，立方液晶（cubosomes，Cubs）可顯著提高經(jīng)皮給藥制劑的皮膚滲透性，且能提高其在皮膚尤其是皮膚真皮層的藥物滯留量，有望能提高鹽酸普萘洛爾外用制劑對(duì)深部型和復(fù)合型血管瘤的療效[3～5]。因此，課題組擬基于立方液晶載藥技術(shù)將鹽酸普萘洛爾制備成一種納米經(jīng)皮給藥制劑，以期能降低或避免口服給藥帶來(lái)的高不良反應(yīng)發(fā)生率，提高鹽酸普萘洛爾的治療效果和患者依從性。前期實(shí)驗(yàn)中，課題組篩選了鹽酸普萘洛爾立方液晶納米粒（PPL-Cubs）的制備方法，并通過(guò)單因素考察結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)化了其最佳處方和制備工藝，結(jié)果制得的PPL-Cubs 包封率低（約50%），遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定的80%。立方液晶為多層囊泡結(jié)構(gòu)，類似于多囊脂質(zhì)體，其可能與脂質(zhì)體同樣存在對(duì)水溶性化合物包封率較低的問(wèn)題。鑒于前期研究表明，鹽酸普萘洛爾在不同pH 磷酸鹽緩沖液下的溶解度存在極大差異，因此，本研究擬在立方液晶常規(guī)制備的基礎(chǔ)上，引入“pH 梯度法”的載藥思路，制備PPL-Cubs，以期提高其包封率。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；DV215CD 型分析天平（美國(guó)奧豪斯公司）；AL204 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；DF-101B 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；高壓均質(zhì)機(jī)（意大利NIRO-SAVI S.P.A.公司）；NICOMP 380 ZLS 激光粒度測(cè)定儀（美國(guó)PSS 粒度儀公司）；超濾離心管（100KD，Millipore）。

1.2 試藥

鹽酸普萘洛爾（含量99.9%，常州亞邦制藥有限公司）；單油酸甘油酯（法國(guó)GATTEFOSSé公司）；泊洛沙姆407（德國(guó)BASF 公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 包封率的測(cè)定

取PPL-Cubs 適量，裝入超濾離心管中，于4 000 r/min 離心10 min，收集離心液，采用課題組前期建立的鹽酸普萘洛爾含量測(cè)定方法測(cè)定離心液中游離藥物濃度C游離；取未透析的PPL-Cubs，測(cè)定藥物濃度C總；根據(jù)公式EE（%）=[(C總-C游離)/ C總]×100%計(jì)算PPL-Cubs 的包封率。

2.2 PPL-Cubs 的制備

2.2.1 注入法

精密稱取單油酸甘油酯9 g 和泊洛沙姆407 1.5 g，加入10 ml 無(wú)水乙醇，20 ℃水浴下攪拌溶解，為A 相；精密稱取鹽酸普萘洛爾3.5 g，加入86 g純化水，20 ℃水浴下攪拌溶解，為B 相。于20 ℃水浴及600 r/min 攪拌速度下，將A 相緩慢地滴加至B 相中，待磁力攪拌1 h 后加入適量純化水使總質(zhì)量為100 g，再在800 bar 壓力下高壓均質(zhì)7 次，得PPL-Cubs。

2.2.2 pH 梯度法

精密稱取單油酸甘油酯適量，40 ℃水浴加熱使融化，為A 相；精密稱取泊洛沙姆407 適量，加入適量純化水，40 ℃水浴加熱使溶解，并用1%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 至酸性，為B 相；于40 ℃水浴及600 r/min攪拌速度下，將A 相緩慢滴加到B 相中，待磁力攪拌30 min 后，得空白立方液晶納米粒粗品；取空白立方液晶納米粒粗品，高壓均質(zhì)數(shù)次，得空白立方液晶納米粒（B-Cubs）。取鹽酸普萘洛爾溶解于適量純化水中，得鹽酸普萘洛爾水溶液；將鹽酸普萘洛爾水溶液加入一定比例的B-Cubs 中，攪拌均勻，并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至一定值，于一定溫度下持續(xù)攪拌一定時(shí)間，再放置至室溫，即得PPLCubs。

2.3 B-Cubs 的制備工藝優(yōu)化

前期試驗(yàn)結(jié)果表明，磁力攪拌速度、時(shí)間、溫度、內(nèi)水相pH 值對(duì)B-Cubs 的粒徑基本無(wú)影響，高壓均質(zhì)壓力及均質(zhì)次數(shù)是影響其粒徑的主要因素，故擬進(jìn)一步優(yōu)化高壓均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)。

2.3.1 高壓均質(zhì)壓力的考察

按照“2.2.2”項(xiàng)下方法，取空白立方液晶納米粒粗品，分別在400、600、800、900、1 000 bar 下高壓均質(zhì)7 次，測(cè)定制得B-Cubs 的粒徑及多分散指數(shù)（見(jiàn)表1）。結(jié)果表明，隨高壓均質(zhì)壓力的提高，制得B-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)均逐漸減小，當(dāng)均質(zhì)壓力≥900 bar 時(shí)，B-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)變化較小，故確定高壓均質(zhì)壓力為900 bar。

表1 高壓均質(zhì)壓力的考察（n=3）

2.3.2 高壓均質(zhì)次數(shù)的考察

按照“2.2.2”項(xiàng)下方法，取空白立方液晶納米粒粗品，分別在900 bar 下高壓均質(zhì)3、5、7、9 次，測(cè)定制得B-Cubs 的粒徑及多分散指數(shù)（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明，隨高壓均質(zhì)次數(shù)的增加，制得B-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)均逐漸減小，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)≥7 次時(shí)，B-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)變化較小，故確定高壓均質(zhì)次數(shù)為7 次。

表2 高壓均質(zhì)次數(shù)的考察（n=3）

2.4 B-Cubs 的處方優(yōu)化

2.4.1 單油酸甘油酯用量的考察

基于優(yōu)化的B-Cubs 最佳制備工藝，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法，固定泊洛沙姆407 用量為5%，內(nèi)水相pH 為3.0，考察單油酸甘油酯用量（15%、20%、25%、30%、35%）對(duì)制得B-Cubs 粒徑及多分散指數(shù)的影響（見(jiàn)表3）。結(jié)果表明，隨單油酸甘油酯用量的增加，制得的B-Cubs 粒徑呈先減小后增大趨勢(shì)，多分散指數(shù)則不斷降低，當(dāng)單油酸甘油酯用量為25%時(shí)，制得的B-Cubs 具有最小的粒徑和較適宜的多分散指數(shù)，故確定單油酸甘油酯用量為25%。

表3 單油酸甘油酯用量的考察（n=3）

2.4.2 泊洛沙姆407 用量的考察

基于優(yōu)化的B-Cubs 最佳制備工藝，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法，固定單油酸甘油酯用量為25%，內(nèi)水相pH 為3.0，考察泊洛沙姆407 用量（3%、4%、5%、6%、7%）對(duì)制得B-Cubs 粒徑及多分散指數(shù)的影響（見(jiàn)表4）。結(jié)果表明，制得的B-Cubs 粒徑隨泊洛沙姆407 用量的增加逐漸降低，多分散指數(shù)變化無(wú)明顯規(guī)律，但均較?。ǎ?.1）；當(dāng)泊洛沙姆407 用量≥5%時(shí)，粒徑變化幅度降低，故確定泊洛沙姆407 用量為5%。

表4 泊洛沙姆407 用量的考察（n=3）

2.5 PPL-Cubs 的包封率影響因素考察

2.5.1 外水相pH 值的考察

根據(jù)前期鹽酸普萘洛爾在不同pH 的PBS 中溶解度測(cè)定結(jié)果可知（見(jiàn)表5），鹽酸普萘洛爾在pH≥8.5 時(shí)溶解度顯著下降。按照“2.2.2”項(xiàng)下方法，制備內(nèi)水相pH 為3.0 的B-Cubs，并按載體/藥物比（以單油酸甘油酯/鹽酸普萘洛爾計(jì)）為6∶1的比例與B-Cubs 和鹽酸普萘洛爾水溶液進(jìn)行混合，以10%氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)外水相pH 至7.5、8.0、8.5、9.0，于20 ℃水?。ㄝd藥溫度）下600 r/min磁力攪拌15 min（載藥時(shí)間），制得PPL-Cubs 中藥物濃度為1%，測(cè)定對(duì)包封率等參數(shù)影響（見(jiàn)表6）。結(jié)果表明，PPL-Cubs 的包封率隨外水相pH 值的提高逐漸增加，當(dāng)外水相pH 值≥8.5 時(shí)，包封率增加趨勢(shì)漸小；外水相pH 值對(duì)PPL-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)無(wú)明顯影響。

表5 鹽酸普萘洛爾在不同pH PBS 中的溶解度（n=3）

表6 外水相pH 值的考察（n=3）

2.5.2 內(nèi)水相pH 值的考察

按照“2.5.1”項(xiàng)下方法，固定外水相pH 為8.5 時(shí)，分別考察內(nèi)水相pH（3.0、4.0、5.0、6.0）對(duì)制得PPL-Cubs 包封率等參數(shù)的影響（見(jiàn)表7）。結(jié)果表明，不同內(nèi)水相pH 的B-Cubs 對(duì)制得的PPL-Cubs包封率無(wú)明顯差異，對(duì)PPL-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)亦無(wú)明顯影響。

表7 內(nèi)水相pH 值的考察（n=3）

2.5.3 載體/藥物的考察

按照“2.5.1”項(xiàng)下方法，固定外水相pH 為8.5 時(shí)，分別考察載體/藥物（5∶1、6∶1、7∶1、8∶1）對(duì)制得PPL-Cubs 包封率等參數(shù)的影響（見(jiàn)表8）。結(jié)果表明，當(dāng)載體/藥物≥6 時(shí)，PPL-Cubs 的包封率不再增加；載體/藥物比值對(duì)PPL-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)無(wú)明顯影響。

表8 載體/藥物的考察（n=3）

2.5.4 載藥溫度的考察

按照“2.5.1”項(xiàng)下方法，固定外水相pH 為8.5 時(shí)，分別考察載藥溫度（20、30、40、50 ℃）對(duì)制得PPLCubs 包封率等參數(shù)的影響（見(jiàn)表9）。結(jié)果表明，載藥溫度對(duì)PPL-Cubs 的包封率、粒徑和多分散指數(shù)無(wú)明顯影響。

表9 載藥溫度的考察（n=3）

2.5.5 載藥時(shí)間的考察

按照“2.5.1”項(xiàng)下方法，固定外水相pH 為8.5 時(shí)，分別考察載藥時(shí)間（15、30、45、60 min）對(duì)制得PPL-Cubs 包封率等參數(shù)的影響（見(jiàn)表10）。結(jié)果表明，載藥時(shí)間對(duì)PPL-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)無(wú)明顯影響。

表10 載藥時(shí)間的考察（n=3）

2.5.6 B-Cubs 粒徑和多分散指數(shù)的考察

通過(guò)調(diào)整高壓均質(zhì)壓力，制備不同粒徑B-Cubs。按照“2.5.1”項(xiàng)下方法，固定外水相pH 為8.5，分別考察B-Cubs 粒徑和多分散指數(shù)對(duì)制得PPL-Cubs包封率等參數(shù)的影響（見(jiàn)表11）。結(jié)果表明，BCubs 的粒徑和多分散指數(shù)不影響所制得PPLCubs 的包封率，但B-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)基本決定了制得PPL-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)。

表11 B-Cubs 粒徑和多分散指數(shù)的考察（n=3）

2.5.7 PPL-Cubs 藥物濃度的考察

按照“2.5.1”項(xiàng)下方法，固定外水相pH 為8.5，分別考察藥物濃度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）對(duì)制得PPL-Cubs 包封率等參數(shù)的影響（見(jiàn)表12）。結(jié)果表明，隨著PPL-Cubs 中藥物濃度的提高，包封率呈逐漸增加趨勢(shì)，當(dāng)藥物濃度≥1%時(shí)，包封率增加趨勢(shì)變慢。

表12 PPL-Cubs 中藥物濃度的考察（n=3）

2.6 pH 梯度法制備PPL-Cubs 的最優(yōu)處方及制備工藝

精密稱取單油酸甘油酯25.0 g，40 ℃水浴加熱使融化，為A 相；精密稱取泊洛沙姆407 5.0 g，加入70 g 純化水，40 ℃水浴加熱使溶解，并用1%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 至3.0，為B 相；于40 ℃水浴及600 r/min 攪拌速度下，將A 相緩慢滴加到B 相中，待磁力攪拌30 min 后，再在900 bar 下高壓均質(zhì)7 次，得B-Cubs。取鹽酸普萘洛爾1 g，溶解于適量純化水中，得鹽酸普萘洛爾水溶液；將鹽酸普萘洛爾水溶液加入24 g B-Cubs 中，攪拌均勻，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至8.5，于20 ℃水浴持續(xù)攪拌15 min，再放置至室溫，即得PPL-Cubs

3 討論

立方液晶納米粒常用的制備方法包括注入法、熔融-分散法、熱處理法、噴霧干燥法等[6]。試驗(yàn)前期以粒徑、包封率等為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選了最佳制備方法為注入法，并優(yōu)化了其最佳處方制備工藝，結(jié)果制得的載藥立方液晶納米粒包封率較低（約50%）[7]。立方液晶是兩親性脂質(zhì)分子分散在過(guò)量水中形成的含雙連續(xù)水區(qū)和閉合脂質(zhì)雙分子層的蜂窩狀液晶結(jié)構(gòu)；水溶性分子被包封于立方液晶水道中，脂溶性分子被包封于脂質(zhì)雙層膜中，兩親性分子則貫穿其中。鹽酸普萘洛爾在酸性環(huán)境下具有較高的溶解性，常規(guī)方法制得的鹽酸普萘洛爾立方液晶納米粒pH 約為3.5，如何讓其具有進(jìn)入立方液晶載體內(nèi)相的“動(dòng)力”是提高載藥立方液晶納米粒包封率的關(guān)鍵。因此，本研究引入“pH 梯度法”，通過(guò)創(chuàng)造高溶解度內(nèi)環(huán)境（低pH 值內(nèi)水相）和低溶解度外環(huán)境（高pH 值外水相），給鹽酸普萘洛爾提供進(jìn)入立方液晶載體內(nèi)相的“動(dòng)力”。離子化的鹽酸普萘洛爾在調(diào)節(jié)pH 的過(guò)程中逐漸變?yōu)榉肿有螒B(tài)的普萘洛爾而進(jìn)入脂質(zhì)區(qū)，脂質(zhì)區(qū)的普萘洛爾分子接觸內(nèi)水相酸性環(huán)境而被離子化，內(nèi)水相中離子化的鹽酸普萘洛爾無(wú)法再通過(guò)脂質(zhì)區(qū)而被捕獲于內(nèi)水相。結(jié)果表明，pH 梯度法顯著提高了PPL-Cubs 的包封率，包封率達(dá)到90%。