知百安神口服液制備工藝優(yōu)化及穩(wěn)定性研究

虞慧華，李靜嫻，江春霞，龐 濤，陳萬生，樸淑娟 （海軍軍醫(yī)大學(xué)：. 長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433, . 長(zhǎng)征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003）

目前全球抑郁癥的發(fā)病率為4.2%，中國(guó)已達(dá)6.9%，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，抑郁癥已成為導(dǎo)致人類死亡和致殘的第二大類疾病[1]。百合知母湯始見于張仲景的《金匱要略·百合狐惑陰陽毒病脈證并治第三篇》，由知母和百合兩味中藥組成，兩藥配伍有養(yǎng)陰清熱、除煩潤(rùn)燥之效，以潤(rùn)養(yǎng)心肺為大法，主治百合病[2]。百合病與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的失眠多夢(mèng)和抑郁癥有很大關(guān)聯(lián)[3]，而百合知母湯也已成為中醫(yī)藥治療抑郁癥、失眠、焦慮等精神神經(jīng)性疾病的經(jīng)典方藥[4]。知百安神口服液來源于經(jīng)典古方百合知母湯，按照方中百合與知母2∶1 配比制備而成，在海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院臨床使用多年，用于抑郁癥、失眠等癥的治療，療效顯著。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以主要成分芒果苷的含量為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)知百安神口服液制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行穩(wěn)定性研究，為其質(zhì)量控制、工業(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1 200 系列高效液相色譜儀（Agilent，美國(guó)）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）；CPA225D 十萬分之一天平（Sartorius，德國(guó)）；WL-901 渦旋振蕩混合器（其林貝爾儀器制造有限公司，海門）；SK7200H 型超聲儀（科導(dǎo)超聲儀器有限公司，上海）；SHH-250SD 藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（重慶永生實(shí)驗(yàn)儀器廠，溫度：15～65 ℃，±2 ℃，濕度：15%～95%，±5%）。

1.2 試藥

知百安神口服液（中藥材購(gòu)自銅陵禾田中藥飲片股份有限公司，口服液由海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院制劑室制備）；芒果苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111607-201503，含量98.4%）；甲醇、乙腈、二氯甲烷為色譜純?cè)噭∕erck，德國(guó)）；甲酸為分析純?cè)噭▏?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 芒果苷的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1；檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm；流速1 ml/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為5 μl。理論塔板數(shù)按芒果苷計(jì)算應(yīng)不低于20 000。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

取芒果苷對(duì)照品適量，精密稱定，用70%乙醇溶液溶解并稀釋制成每1 ml 中含0.15 mg 芒果苷的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密量取知百安神口服液10 ml，用10 ml 二氯甲烷萃取，震搖，靜置，待完全分離。精密量取水相4 ml，加水定容至25 ml，經(jīng)0.45 μm 薄膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取芒果苷對(duì)照品適量，精密稱定，用70%乙醇溶液溶解并稀釋，制成每1 ml 中含1.04 mg 芒果苷的溶液，作為對(duì)照品母液，采用逐級(jí)稀釋的方法，將芒果苷配制成208、156、104、78、52、26、10.4 μg/ml的對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為Y=16.56X-5.412（r=0.999 9），結(jié)果表明芒果苷在10.4～208 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，計(jì)算得到芒果苷峰面積的RSD 為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取知百安神口服液（批號(hào)：120208）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到芒果苷含量的RSD 為0.72%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取知百安神口服液（批號(hào)：120208）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算得到芒果苷含量的RSD 為1.18%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取知百安神口服液（批號(hào)：120208）6 份，每份5 ml，分別加入104 μg/ml 的芒果苷對(duì)照品溶液各5 ml，混勻，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算得芒果苷的平均加樣回收率為99.47%，RSD 為0.86%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 提取方法的選擇

水提醇沉法是廣泛應(yīng)用于中藥的提取方法，其操作方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，更適合于規(guī)模化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)大生產(chǎn)實(shí)際情況對(duì)制備工藝采用正交設(shè)計(jì)，擬對(duì)中藥水醇提取法影響較大的因素即提取加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)和醇沉濃度為影響因素進(jìn)行考察，但參照文獻(xiàn)[5]發(fā)現(xiàn)，提取次數(shù)不適合加入到正交設(shè)計(jì)中，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合工藝化大生產(chǎn)能源等消耗考慮，確定提取次數(shù)為2 次，可達(dá)到提取要求。因此，參照L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，加水量為藥材總量的6、10、12 倍，提取時(shí)間為1、2、3 h，醇沉濃度為40%、60%、80%，以芒果苷的含量為檢測(cè)指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝，見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

2.3 知百安神口服液正交試驗(yàn)結(jié)果

按處方稱取各味藥材共9 份，按表2 條件進(jìn)行提取，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果折合知百安神口服液芒果苷的含量（μg/ml），結(jié)果見表3。

從正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，A、B、C 三因素影響大小排序?yàn)镃＞B＞A，即醇沉濃度為最大影響因素，經(jīng)過極差分析并結(jié)合能源成本和工業(yè)操作的簡(jiǎn)便有效性，確定最佳工藝為A2B1C2，即10 倍量水煎煮1 h，以60%醇濃度為醇沉濃度。

結(jié)合課題組前期研究和以上試驗(yàn)結(jié)果，知百安神口服液制備工藝的一般流程為：稱取百合667 g、知母333 g，加10 倍量水煎煮2 次，每次1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.24（50 ℃）的清膏，加入乙醇使含醇量達(dá)60%，4 ℃靜置72 h，濾過，加單糖漿200 ml，加水至1 000 ml，攪勻、煮沸、放冷、濾過、灌封、滅菌即得。

依據(jù)上述優(yōu)化的工藝，于本院制劑室擴(kuò)大生產(chǎn)，依據(jù)“2.1”項(xiàng)下芒果苷的測(cè)定方法對(duì)3 批（批號(hào)：170406、180104、180713）中試產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)芒果苷的含量分別為780.9、657.7、621.0 μg/ml。

2.4 知百安神口服液穩(wěn)定性研究

根據(jù)制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則（《中國(guó)藥典》2020 年版四部制劑通則9000）及口服溶液劑（《中國(guó)藥典》2020 年版四部制劑通則0123）有關(guān)規(guī)定，取3 批知百安神口服液（批號(hào)：170406-1、170406-2、170406-3），在溫度（40±2）℃、相對(duì)濕度（75±5）%的條件下放置6 個(gè)月進(jìn)行加速試驗(yàn)，于第0、1、2、3、6 個(gè)月末分別取樣，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目檢測(cè)。另取3 批知百安神口服液（批號(hào)：170406、180104、180713），在溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度（60±10）%的條件下放置12 個(gè)月進(jìn)行長(zhǎng)期試驗(yàn)，分別于第0、3、6、9、12 個(gè)月取樣，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)。穩(wěn)定性加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)結(jié)果提示，知百安神口服液在12 個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表4、表5。

表4 知百安神口服液穩(wěn)定性加速試驗(yàn)結(jié)果

表5 知百安神口服液穩(wěn)定性長(zhǎng)期試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本課題組在前期研究工作中對(duì)知百安神口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了系統(tǒng)研究[6]，筆者選取芒果苷作為工藝研究的指標(biāo)及所用芒果苷的含量測(cè)定方法，即以前期研究工作為基礎(chǔ)進(jìn)行。

前期工作中發(fā)現(xiàn)，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，該口服液的pH 值變化較大，發(fā)現(xiàn)原因是口服液瓶蓋中的膠塞材質(zhì)為天然橡膠，天然橡膠塞長(zhǎng)時(shí)間與藥液接觸會(huì)對(duì)藥液pH 值產(chǎn)生影響，更換為硅膠塞后，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示口服液的pH 值可保持穩(wěn)定，本研究中采用的均為更換后的現(xiàn)行包裝。

文獻(xiàn)報(bào)道[7]芒果苷可能受溶液pH 值和溫度的影響而不穩(wěn)定，知百安神口服液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)。從結(jié)果可以看出，芒果苷在水溶液的狀態(tài)下，3 個(gè)月內(nèi)含量可穩(wěn)定在10%以內(nèi)，超過3 個(gè)月會(huì)加速降解?！吨袊?guó)藥典》2020 年版對(duì)知母含量測(cè)定要求是檢測(cè)芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量，但知母皂苷BⅡ需要應(yīng)用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，由于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的檢測(cè)誤差較大，并不適用于制劑工藝考察。考慮到芒果苷是知百安神口服液的主要成分[6]，且制劑工藝考察周期并不長(zhǎng)（不超過1 個(gè)月），芒果苷又利于快速便捷檢測(cè)，因此，選擇芒果苷作為指標(biāo)成分，優(yōu)化知百安神口服液的提取工藝，而利用穩(wěn)定性考察結(jié)果制訂制劑的有效期則需考察多種檢驗(yàn)因素，還需進(jìn)一步研究。