基于COI基因的光倒刺鲃群體遺傳多樣性與遺傳分化研究

李文俊 李強 韓崇 李隴旭 易祖盛 桂林 鐘良明

摘要 [目的]全面了解光倒刺鲃的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為其種質(zhì)資源保護和利用提供科學(xué)依據(jù)。[方法]采用自行設(shè)計的引物對9條水系共209尾光倒刺鲃樣本的線粒體COI基因序列進行測定與分析，并探討其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平。[結(jié)果]在209條COI基因序列中，共檢測到12個單倍型，單倍型多樣性為0.80 核苷酸多樣性為0.008 2。單倍型系統(tǒng)樹顯示，所有群體聚成2支，東江群體的全部樣本及北江、贛江和九龍江水系的部分樣本組成Ⅰ支，其余樣本組成Ⅱ支。單倍型網(wǎng)絡(luò)分析顯示，東江群體單倍型與北江、贛江和九龍江部分個體關(guān)系較近，但與其他個體關(guān)系相對較遠(yuǎn);珠江水系大部分群體與長江、錢塘江、九龍江大部分群體分布于不同的分支。AMOVA分析表明，光倒刺鲃COI基因序列變異主要來自地理區(qū)內(nèi)群體間，占82.33%。錯配分析及中性檢驗顯示，大多數(shù)群體相對穩(wěn)定，未發(fā)生過群體擴張。[結(jié)論]光倒刺鲃群體的遺傳多樣性總體偏低，應(yīng)加強對其種質(zhì)資源的保護;東江水系與珠江水系其他群體既存在一定隔離，又存在著基因交流;珠江水系群體與長江水系群體間分化明顯。

關(guān)鍵詞 光倒刺鲃;COI基因;遺傳多樣性;遺傳分化

中圖分類號 S-917.4? 文獻標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）22-0125-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.030

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Genetic Diversity and Genetic Differentiation of Spinibarbus hollandi Based on COI gene

LI Wen-jun， LI Qiang， HAN Chong et al

（School of Life Science， Guangzhou University， Guangzhou，Guangdong 510006）

Abstract [Objective] To understand the genetic diversity and genetic structure of Spinibarbus hollandi more comprehensively， and provide scientific basis for the conservation and utilization of its wild germplasm resources.[Method] The mitochondrial COI gene sequences of 209 S. hollandi samples from 9 rivers were determined and analyzed with designed primers， and its genetic diversity and genetic differentiation level were discussed. [Result] Among 209 COI gene sequences， 12 haplotypes were detected， with haplotype diversity of 0.801 0 and nucleotide diversity of 0.008 2. Phylogenetic tree of haplotypes showed that all haplotypes gathered into two branches （branches 1： all the samples Dongjiang population and some individuals of Beijiang， Ganjiang and Jiulong River）. Network analysis of haplotypes showed that haplotype of Dongjiang population was closely related to some individuals in Beijiang， Ganjiang and Jiulong River， but far related to other individuals. The majority of the population of the Pearl River distributed in different branches compared with the majority of the population of the Yangtze River， Qiantang River， and Jiulong River. AMOVA analysis showed that the variation of COI gene sequences of S. hollandi was mainly from within groups， accounting for 82.33%. Mismatch analysis and neutral test showed that most populations were relatively stable without population expansion. [Conclusion] The genetic diversity of S. hollandi population is generally low， so the protection of its germplasm resources should be strengthened. There is not only certain isolation but also gene exchange between Dongjiang population and other populations in the Pearl River. There is obvious differentiation of populations between the Pearl River and the Yangtze River.

Key words Spinibarbus hollandi;Cytochrome oxidase subunit I sequence;Genetic diversity;Genetic differentiation

魚類線粒體DNA已成為研究魚類進化遺傳與系統(tǒng)演化關(guān)系的重要分子標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究[1]。而細(xì)胞色素氧化酶亞基I（cytochrome oxidase subunit I，COI）為線粒體13個蛋白編碼基因中研究最為清楚的基因之一，其進化速率較低，包含的遺傳進化信息量大，已被廣泛應(yīng)用于種群分析、系統(tǒng)發(fā)育和種類鑒別等研究領(lǐng)域[2-3]。光倒刺鲃（Spinibarbus hollandi）隸屬鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鲃亞科（Barbinae）倒刺鲃屬（Spinibarbus），分布于華東及華南諸水系[4-5]，是一種重要的名優(yōu)經(jīng)濟魚類。隨著光倒刺鲃的人工馴養(yǎng)及繁育技術(shù)獲得成功及多年的推廣養(yǎng)殖，現(xiàn)已成為華南及華東等地重要的養(yǎng)殖魚類之一。近年來，由于過度捕撈、環(huán)境污染及水利工程建設(shè)等原因，光倒刺鲃自然資源量不斷減少。然而，目前有關(guān)光倒刺鲃群體遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及親緣地理等方面的研究較少[6-8]。該研究采集了9個群體的光倒刺鲃樣本，對其線粒體COI基因序列進行了測定與分析，旨在全面了解其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為其種質(zhì)資源保護和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

所用樣品于2019年5—12月采自廣西、廣東、湖南、江西、福建和浙江等地。將所有個體按所采樣的水系進行群體劃分。各采樣點和樣品信息見圖1和表1。

1.2 DNA提取及測序

基因組DNA使用DNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，上海）提取。PCR擴增采用自行設(shè)計的引物進行，其序列分別為L：5′- GGGCTGATAGGAAGAGGACTT -3′;H：5′- GATGAGTTGGACAGGACGATT -3′。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：PCR Master Mix 12.5 μL，10 mmol/L引物各1.0 μL、模板DNA 3.0 μL及ddH2O 7.5 μL混合。擴增程序：①94 ℃預(yù)變性3 min;②94 ℃變性30 s，③55 ℃退火30 s;④72 ℃延伸90 s，重復(fù)35次;72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程股份有限公司純化并測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過DNASTAR程序?qū)π蛄羞M行拼接，使用Muscle軟件進行比對分析。利用MEGA 6.0軟件計算群體遺傳距離，基于鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建單倍型系統(tǒng)樹[9]。使用軟件DNAsp 5.0[10]和Arlequin 3.5[11]統(tǒng)

計各群體的核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）與單倍型多樣性（haplotype diversity，h），進行錯配分布（mismatch distribution）分析、中性檢驗以及分子變異分析（AMOVA）。使用Network 10.0軟件構(gòu)建各單倍型之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

在209個COI序列中，共檢測到12個單倍型。有4個為多群體共享的單倍型，其余為單個群體特有單倍型。單倍型多樣性為0.80 核苷酸多樣性為0.008 2（表2）。其中，北江、贛江及資江群體的單倍型多樣性高于其他群體，均大于0.500，其他群體的單倍型多樣性較低。此外，北江、贛江及九龍江群體的核苷酸多樣性較其他群體高，π值均大于0.004 0，而其他群體的核苷酸多樣性較低，π值均在0.001 0以下。

2.2 遺傳距離及遺傳分化水平

遺傳距離分析可知（表3），東江群體與其他群體的遺傳距離均相對較高。除北江群體外，東江與其他群體間遺傳距離均大于0.015 0，北江與其他群體間遺傳距離次之。遺傳分化分析顯示，北江群體與其他群體間遺傳分化指數(shù)均較低，小于0.500 0;除北江群體外，東江群體與其他群體的遺傳分化指數(shù)均較高;錢塘江群體與北江、贛江及九龍江的遺傳分化指數(shù)較低，與其他群體的遺傳分化指數(shù)均較高。

2.3 親緣關(guān)系

對12個單倍型進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。從圖2可見，所有光倒刺鲃群體聚成2個支系。其中東江群體與部分北江、贛江和九龍江群體的個體組成了支系Ⅰ。而在支系Ⅱ中，又可分為A和B 2個姐妹支系。A支為珠江水系的樣本，包含柳江、郁江的全部樣本及北江的部分樣本;B群則包含資江、錢塘江的全部樣本及贛江和九龍江的大部分樣本。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）也可分為3個分支。其中長江水系的資江和贛江群體、錢塘江群體及九龍江的部分單倍型共同聚為分支 而珠江水系（柳江、桂江及郁江群體的所有單倍型及北江群體的部分單倍型）單獨聚為分支3。東江群體與部分北江和贛江個體共享的單倍型H1與九龍江的單倍型H12聚為分支 兩者親緣關(guān)系較近，遺傳變異僅3步，但與其他分支單倍型的變異達(dá)到16步以上。以上表明東江群體與其他群體相比，存在較明顯的遺傳分化，但同時又與部分北江、贛江和九龍江的部分個體存在較近的親緣關(guān)系;另外，珠江水系與長江、九龍江和錢塘江水系之間也存在較明顯的分化。

2.4 分子變異分析

為了解光倒刺鲃種群分子變異的分布模式，根據(jù)水域分布將光倒刺鲃群體分成珠江、長江、九龍江和錢塘江4個地理區(qū)，進行分子變異分析。分析表明，光倒刺鲃地理區(qū)之間變異占-20.72%，地理區(qū)內(nèi)群體間占82.33%，群體內(nèi)的變異占38.39%。這說明光倒刺鲃COI基因的遺傳分化主要來自地理區(qū)內(nèi)的群體之間。

2.5 種群動態(tài)分析

對各群體進行中性檢驗分析發(fā)現(xiàn)，在Tajimas D檢驗中，郁江和柳江的Tajimas D值均為負(fù)值且統(tǒng)計檢驗均顯著（P<0.05），其余群體為正值或為負(fù)值，但統(tǒng)計檢驗不顯著;而在Fus Fs檢驗統(tǒng)計中，除郁江群體的Fus Fs值為顯著的負(fù)值（P<0.05）外，其余群體為正值或負(fù)值，但統(tǒng)計檢驗不顯著，說明郁江群體可能發(fā)生過擴張。在錯配分析中，郁江群體的歧點分布圖呈現(xiàn)單峰型，進一步說明郁江群體經(jīng)歷過擴張。因此，綜上可知郁江群體可能發(fā)生過擴張，而全部群體和其他各個群體相對穩(wěn)定，未發(fā)生過擴張。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 光倒刺鲃的遺傳多樣性。

遺傳多樣性是物種適應(yīng)性和進化的基礎(chǔ)，種內(nèi)的遺傳多樣性與該物種對環(huán)境的適應(yīng)能力呈正向線性關(guān)系[12]。核苷酸多樣性和單倍型多樣性是衡量一個群體mtDNA變異程度的重要指標(biāo)[13]。該研究基于COI序列的光倒刺鲃核苷酸多樣性π值為0.008 ?整體遺傳多樣性較低，與同區(qū)域或鄰近區(qū)域的黃尾鲴（Xenocypris davidi）[14]和銀鲴（Xenocypris argentea）[15]等魚類相仿。所有群體比較而言，北江、贛江和九龍江群體的核苷酸多樣性相對較高，而東江、桂江、郁江、資江和錢塘江群體的核苷酸多樣性均較低。造成光倒刺鲃群體遺傳多樣性較低的原因可能有：①光倒刺鲃為產(chǎn)區(qū)重要的經(jīng)濟魚類，但部分水域不合理捕撈行為尚未得到遏制，可能使光倒刺鲃的群體數(shù)量大幅下降，影響了其遺傳多樣性;②隨著各個流域中建設(shè)大量水利工程，造成魚類棲息地嚴(yán)重萎縮和破碎化分布，阻隔了各水系間基因交流，也可能導(dǎo)致光倒刺鲃群體遺傳多樣性進一步降低。除此之外，河流水質(zhì)污染也是影響魚類多樣性的重要因素。光倒刺鲃為產(chǎn)區(qū)重要的經(jīng)濟魚類具有較大的經(jīng)濟價值，為了持續(xù)利用其種質(zhì)資源，應(yīng)積極保護其種內(nèi)遺傳多樣性。目前，我國已經(jīng)建立了多個光倒刺鲃國家級種質(zhì)資源保護區(qū)[16]，這有助于光倒刺鲃種質(zhì)資源的保護。

3.1.2 群體間的遺傳分化。

光倒刺鲃的遺傳分化水平分析顯示，東江與其他群體間遺傳分化指數(shù)較高。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，東江水系樣本與北江、贛江和九龍江水系的部分樣本組成了獨立的分支Ⅰ。東江除了與北江、贛江以及九龍江部分個體關(guān)系較近外，與其他群體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，單倍型間的變異達(dá)到16步以上。結(jié)果表明，東江群體與其他群體之間存在較明顯的遺傳分化，同時與北江、贛江和九龍江部分個體間的遺傳關(guān)系也較近。Yang 等[17]在對銀鮈（Squalidus argentatus）的研究發(fā)現(xiàn)，東江、韓江與九龍江群體為一個單系群，與華南地區(qū)其他群體不同，這與該研究的結(jié)果相似。從地理分布上看，東江被獅子洋與北江和西江隔離。在間冰期時由于海平面上升，東江與北江隔離，光倒刺鲃作為溪流魚類難以進行基因交流，使得東江群體與北江、西江群體發(fā)生了分化，而這3條河流在冰期海平面大幅下降時又發(fā)生了匯聚[18-19]，使得東江與北江的群體得以交流。另一方面，東江水系群體與贛江水系和九龍江群體的部分個體關(guān)系較近。這可能由于東江水系與贛江水系緊鄰，水系間的襲奪及連接事件使得2個水系部分個體存在較近的親緣關(guān)系;九龍江水系群體部分個體可能由東江群體擴散而來，而隨著華南大陸東部蓮花山脈的隆起，進而阻隔了兩者間的遺傳交流。東江群體與其流域兩側(cè)水系的群體既存在一定程度的隔離，又存在著基因交流。這種較為獨特的魚類遺傳分化格局，可從其魚類組成特征得到印證。東江水系既有其特有的魚類，如三線擬鲿（Pseudobagrus trilineatus）、白線紋胸鮡（Glyptothorax pallozonum）等[20-21]，又有珠江水系特有魚類，如沙花鰍（Cobitis arenae）[22]、北江光唇魚[23]等，還有與韓江及九龍江等水系共同特有的魚類，如裸腹原纓口鰍（Vanmanenia gymnetrus）[21]、帶刺光唇魚（Acrossocheilus spinifer）[24]等。

該研究的系統(tǒng)樹與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析表明，光倒刺鲃的珠江與長江水系的群體分別位于不同分支，說明它們之間存在一定的遺傳分化。筆者對光倒刺鲃形態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，珠江水系群體與長江、錢塘江等水系的群體在體色、體型等性狀上存在著一定差異，珠江群體的特點為體青綠色，腹鰭及臀鰭金黃色，體型較高等;長江、錢塘江等的特點為體青灰色，腹鰭及臀鰭紅色，體型較長等。造成這些差異的原因可能是南嶺的隆起[25]，限制了其南北兩側(cè)水系群體的基因交流，經(jīng)過長期的性狀差異積累，使得南嶺兩側(cè)的群體產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化。因而，復(fù)雜的地形地貌可能導(dǎo)致光倒刺鲃形成了較明顯的地理差異，對應(yīng)群體應(yīng)分別作為獨立管理單元進行保護利用。

3.2 結(jié)論

該研究對9個群體光倒刺鲃的209條COI 基因研究表明，光倒刺鲃群體的遺傳多樣性總體偏低，應(yīng)加強對其種質(zhì)資源的保護;東江水系與其他群體既存在一定隔離，又存在著基因交流，同時珠江水系群體與長江水系等群體間具有分化明顯，地形地貌的衍化對光倒刺鲃種群分化產(chǎn)生一定影響。

參考文獻

[1] 劉云國.水產(chǎn)生物 DNA 分子標(biāo)記技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2009：59-62.

[2] 畢相東，楊雷，侯俊利，等.COⅠ基因在海洋動物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)科學(xué)，2008，27（2）：105-108.

[3] 張鳳英，馬凌波，施兆鴻，等.3種鯧屬魚類線粒體COⅠ基因序列變異及系統(tǒng)進化[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2008，15（3）：392-399.

[4] 樂佩琦.中國動物志：硬骨魚綱 鯉形目（下卷）[M].北京：科學(xué)出版社，2000：38-41.

[5] 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，華南師范大學(xué)，暨南大學(xué)，等.廣東淡水魚類志[M].廣州：廣東科技出版社，1991：140-141.

[6] 黃種持，黃柳婷，林學(xué)文，等.黑脊倒刺鲃線粒體DNA多樣性分析[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，38（2）：259-26 220.

[7] 藍(lán)昭軍，李強，舒琥，等.基于線粒體細(xì)胞色素b基因的光倒刺鲃遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)研究[J].海洋與湖沼，201 47（6）：1158-1165.

[8] 唐瓊英，楊秀平，劉煥章.刺鲃基于線粒體細(xì)胞色素b基因的生物地理學(xué)過程[J].水生生物學(xué)報，200 27（4）：352-356.

[9] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular biology and evolution，201 28（10）：2731-2739.

[10] LIBRADO P，ROZAS J.DnaSP v5：A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J].Bioinformatics，2009，25（11）：1451-1452.

[11] EXCOFFIER L，LAVAL G，SCHNEIDER S.Arlequin（version 3.0）：An integrated software package for population genetics data analysis[J].Evolutionary bioinformatics online，2007，1：47-50.

[12] 胡靜，侯新遠(yuǎn)，尹紹武，等.基于mtDNA COⅠ和Cytb基因序列對南中國海不同海域波紋唇魚群體遺傳多樣性的研究[J].水生生物學(xué)報，201 38（6）：1008-1016.

[13] LIU Y H，ZHANG M H.Population genetic diversity of roe deer（Capreolus pygargus）in mountains of Heilongjiang Province[J].Zoological research，2009，30（2）：113-120.

[14] 張宏，趙良杰，胡忠軍，等.千島湖和長江黃尾鲴種群的遺傳變異研究[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報，201 24（1）：12-19.

[15] 劉軍，趙良杰，劉其根，等.不同水系銀鲴自然群體線粒體COI基因遺傳變異研究[J].淡水漁業(yè)，201 45（6）：3-8，21.

[16] 羅剛，張勝茂，鄒國華.國家重點保護經(jīng)濟水生動植物圖譜[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2017.

[17] YANG J Q，TANG W Q，LIAO T Y，et al.Phylogeographical analysis on Squalidus argentatus recapitulates historical landscapes and drainage evolution on the island of Taiwan and mainland China[J].International journal of molecular sciences，201 13（2）：1405-1425.

[18] WANG L，SARNTHEIN M，ERLENKEUSER H，et al.East Asian monsoon climate during the Late Pleistocene：High-resolution sediment records from the South China Sea[J].Marine geology，1999，156（1/2/3/4）：245-284.

[19] LIU Z F，TRENTESAUX A，CLEMENS S C，et al.Clay mineral assemblages in the northern South China Sea：Implications for East Asian monsoon evolution over the past 2 million years[J].Marine geology，200 201（1/2/3）：133-146.

[20] 褚新洛，鄭葆珊，戴定遠(yuǎn).中國動物志：硬骨魚綱 鲇形目[M].北京：科學(xué)出版社，1999：51-68.

[21] 葉富良，楊萍，宋蓓玲.東江魚類區(qū)系研究[J].湛江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，199 11（2）：1-7.

[22] 肖武漢，張亞平.魚類線粒體DNA的遺傳與進化[J].水生生物學(xué)報，2000，24（4）：384-391.

[23] 林小濤，張潔.東江魚類生態(tài)及原色圖譜[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2013：109-120.

[24] 藍(lán)昭軍，黃小林，趙俊.珠江水系魚類一新紀(jì)錄——帶刺光唇魚（鯉形目：鯉科）[J].動物學(xué)雜志，201 50（3）：390-395.

[25] 地質(zhì)礦產(chǎn)部《南嶺項目》構(gòu)造專題組.南嶺區(qū)域構(gòu)造特征及控巖控礦構(gòu)造研究[M].北京：地質(zhì)出版社，1988.