膽道閉鎖無創(chuàng)診斷現(xiàn)狀與研究進展

程 珍 綜述 吳宙光 葉泳欽 審校

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是新生兒梗阻性黃疸的常見病因，其主要病理特征為肝內(nèi)外膽管進行性炎癥和肝纖維化。BA的病因及發(fā)病機制尚不明確，如不及時治療，患者多在2歲內(nèi)死于肝硬化、肝衰竭。1959年，日本學者Morio Kasai創(chuàng)立了肝門空腸吻合術（Kasai手術），該術式為目前治療BA的首選手術方式，可延緩肝臟纖維化進程，提高自體肝存活率。而早期Kasai手術是影響預后的關鍵因素，因此早期診斷BA是臨床上極為迫切的工作。目前，術中膽道造影及肝組織活檢是公認的BA診斷金標準，但二者屬于有創(chuàng)診斷方法［1］。美國兒科學會建議開展更多研究以制定規(guī)范的策略，從而盡早發(fā)現(xiàn)BA［2］。近年來小兒外科領域致力于探尋行之有效，且靈敏度、特異度高的無創(chuàng)早期診斷模式?，F(xiàn)圍繞大便比色卡，糞便、尿液、血液來源的標記物及影像學檢查等無創(chuàng)診斷方法的研究進展進行綜述。

一、早期篩查

（一）大便比色卡

大便比色卡（stool color card，SCC）是一種簡單、經(jīng)濟的早期無創(chuàng)篩查方法，可于患者出生時將SCC附于母嬰健康手冊上。BA患者的大便多為白陶土樣便，父母可依據(jù)SCC對嬰兒大便顏色進行比對，早期篩查出黃疸不明顯的BA及其他嬰兒膽汁淤積性疾病。該方法最早由日本的Matsui和IshiKawa發(fā)起并實施［3］。其后，中國臺灣于2004年推出更為全面與普及的SCC早期篩查BA方案，該方案診斷BA的靈敏度、特異度分別為89.7%和99.9%，陽性預測值、陰性預測值分別為28.6%和99.9%［4］。目前SCC在美國、日本、加拿大等國家均取得較為滿意的篩查效果。在中國大陸地區(qū)，Zheng等［5］對深圳地區(qū)的研究結果顯示：通過實施該篩查方案，BA診斷年齡從（80±12）天降至（56±15）天。近年來信息化、大數(shù)據(jù)及人工智能的進一步發(fā)展，SCC由最初的圖片人工識別發(fā)展到數(shù)字圖像分析，再發(fā)展至通過智能手機應用程序比對，其進步有助于家長對患者大便進行監(jiān)測，使SCC篩查更易于廣泛開展［6，7］。也有研究表明，SCC可降低BA患者Kasai手術日齡，提高自體肝生存率，從而改善預后［5，8］。

（二）糞便來源標記物

腸道菌群的相關研究是目前各學科的研究熱點。腸桿菌科（enterobacteriaceae）是一種促炎、有潛在致病性的分類單元，膽汁酸是調(diào)節(jié)腸道菌群的主要因子［9］。BA患者因膽道梗阻，導致膽鹽及膽汁酸無法排泄于腸道，可致腸道菌群紊亂。腸桿菌科的豐度在肝硬化患者糞膽汁酸水平下降時較高，而正常健康人腸道的菌群以雙歧桿菌、乳桿菌居多［10］。Wang等［11］研究發(fā)現(xiàn)BA患者腸道菌群的豐度和結構有顯著改變；在微生物門水平，BA患者變形菌門豐度升高，而擬桿菌門豐度降低。在屬水平，BA患者體內(nèi)多種潛在的致病菌如鏈球菌、克雷伯桿菌大量增殖，而產(chǎn)丁酸鹽細菌、雙歧桿菌數(shù)量減少，因而鏈球菌與擬桿菌豐度比這一指標診斷BA效能較高（曲線下面積＝0.96，P＜0.001）。但目前腸道菌群的紊亂情況尚缺乏大數(shù)據(jù)支持，收集糞便樣本，研究腸道菌群與BA免疫機制之間的關聯(lián)性，有望通過腸道菌群的改變早期識別BA，為改善BA患者預后提供一定理論依據(jù)。

（三）尿液來源標記物

膽汁酸通常以與牛磺酸或甘氨酸相結合的形式，通過尿液排出體外，尿液中硫酸化膽汁酸（urine sour bile acid，USBA）的水平是判斷兒童膽汁淤積程度的高度敏感指標。Shinka等［12］采用質(zhì)譜分析方法將BA患者與膽汁淤積癥患者的尿液進行分析，發(fā)現(xiàn)BA患者尿液中硫酸化?；悄懰崴斤@著增高，認為測定硫酸化?；悄懰峥赡苁呛Y查新生兒BA的一種有效方法。此外，當尿膽素原水平在0.32 mg／dL以下時，可以區(qū)分BA與其他非BA導致的膽汁淤積癥，其靈敏度、特異度分別為88%、73%；且當該臨界值與GGT相結合鑒別BA與其他膽汁淤積性疾病時，靈敏度、特異度分別為80%、100%，表明兩種指標結合時診斷的準確性有所提高，此方法值得在發(fā)展中國家推廣［13］。而后Suzuki等［14］通過酶學分析法對大樣本尿液標本進行測定，發(fā)現(xiàn)當USBA高于55.0μmol／g時，需與其他膽汁淤積癥患者進行鑒別。USBA試驗可區(qū)分母乳喂養(yǎng)與其他肝臟疾病引起的持續(xù)性黃疸。Li等［15］采用氣相色譜－質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）對101名受試者的尿液樣本進行非靶向代謝組學分析，鑒定出41種明顯改變的代謝物，其結果表明在不同的肝臟疾病中，尿液的成分會發(fā)生變化，個別尿液代謝物如N-乙酰-d-甘氨酸（N-acetyl-Dmannosamine，ManNAc）和α-氨基己二酸（alpha-aminoadipic acid，α-AAA）在區(qū)別BA患者和嬰兒肝炎綜合征（infantile hepatitis syndrome，HIS）方面具有較高的靈敏度和特異度，可作為鑒別診斷BA和兒童肝炎綜合征的潛在生物標志物。采用水溶性尿硫酸膽汁酸直接酶法測定尿液中USBA水平具有簡單、無創(chuàng)、廉價、敏感的優(yōu)勢，但其代謝物的改變僅用于鑒別BA與其他原因引起的膽道疾病，不能對BA進行早期精確診斷。

（四）血液來源標記物

1.膽紅素：膽紅素檢測方便快捷，是目前肝功能指標中較常用于早期篩查BA的血液生化指標。Powell等［16］于2003年率先報道通過測定新生兒血液中結合膽紅素水平早期篩查BA，該研究發(fā)現(xiàn)在血清膽紅素水平升高（≥300 mg／mL）的情況下，當直接膽紅素升高占總膽紅素的15%時，應排除嬰兒膽汁淤積性疾病；而當直接膽紅素水平占總膽紅素的50%以上時，應高度懷疑BA［17］。近年來，Harpavat等［18］采用兩步策略對BA篩查效果進行評估：在南德克薩斯出生的124 385名嬰兒中，有123 279名（99%）在出生后60 h內(nèi)接受了結合膽紅素或直接膽紅素檢測，結果顯示該方法的靈敏度為100%（95%CI：56%～100%），特異度為99.9%（95%CI：99.9%～99.9%），陽性預測值為5.9%（95%CI：2.6%～12.2%）。膽紅素的測定簡單易行，直接膽紅素水平有助于BA患者的早期診斷，目前也常作為術后隨訪的重要指標之一［18］。然而，膽紅素升高作為一種早期識別手段，其陽性預測值較低，臨床上仍需結合膽道造影來明確診斷。

2.谷氨酰轉移酶：谷氨酰轉移酶（gammaglutamyl transpeptidase，GGT）是評估膽管系統(tǒng)損傷程度的敏感指標，GGT增高常提示膽管梗阻。GGT活性檢測廣泛應用于BA的輔助診斷。據(jù)報道，不同截斷水平GGT診斷BA的準確性各不相同，當GGT＞300 U／L或每日增加6 U／L可用于區(qū)分BA和其他新生兒膽汁淤積癥，準確率分別為85%和88%［19］。當臨界值為286 U／L時，GGT鑒別BA的靈敏度及特異度分別為76.7%和80%［20］。此外，GGT對BA診斷的參考范圍與年齡密切相關，Rendon-Macias等［21］通過研究不同年齡段GGT對BA的診斷效能，在加入年齡相關的影響因素后，可提高GGT診斷BA的準確性。Chen等［19］對1 649例患者進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)BA組患者術前總膽紅素、直接膽紅素和GGT水平顯著升高（P＜0.05），而非BA組堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平較高（P＝0.0003），TB、DB、GGT和ALP的ROC曲線下面積分別為0.584、0.614、0.843和0.398；將不同年齡患者進行分組，分別測定GGT的水平和診斷效能時發(fā)現(xiàn)，對于日齡120天以內(nèi)的患者，GGT水平有利于BA的診斷；因此，年齡是GGT診斷BA的重要考量因素，這與Rendon-Macias等［21］得到的結論一致。Li等［15］采用Logistic回歸分析鑒別BA和新生兒肝炎綜合征患者的臨床指標和兩組之間的代謝物差異，GGT和ALP的曲線下面積分別為0.876和0.822。這與Russo［22］前期研究結果一致。此外，Dong等［23］回顧性分析了1 728例新生兒梗阻性黃疸的資料，其中包括1 512例BA患者，發(fā)現(xiàn)GGT和BA相關的其他危險因素（包括體重、性別、DB和ALP）聯(lián)合進行診斷時，診斷效能顯著提高。綜上所述，GGT作為一種診斷價值較高的無創(chuàng)檢測標志物，應結合其截斷水平、年齡等因素，以提高診斷BA的準確率。GGT與其他生物標志物（如MMP-7）聯(lián)合應用可提高診斷的準確性［24，25］。

（五）血清來源標記物

1.基質(zhì)金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7） MMP-7是一種通過細胞外基質(zhì)分解參與細胞間信號傳遞的蛋白酶，肝細胞中主要由膽管上皮細胞、Kupffer細胞產(chǎn)生MMP-7［26］。其水平的變化主要反映肝臟纖維化程度，可用于BA的早期診斷。Jiang等［26］研究發(fā)現(xiàn)BA患者血清MMP-7水平明顯高于有膽汁淤積的非BA患者，選擇MMP-7水平52.85 ng／mL作為臨界點時，可將BA與其他引起膽汁淤積的疾病加以區(qū)分，其靈敏度為95.19%，特異度為93.07%，陰性預測值為91.43%。同時，有多項研究表明，MMP-7與膽汁淤積的標記物谷氨酰轉肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT）聯(lián)合使用時，診斷準確率可達95%，大大提高了早期診斷的準確性［24，25］。血清MMP-7（單獨或聯(lián)合GGT）可作為BA早期無創(chuàng)診斷的生物標志物，同時MMP-7可用于預測BA的預后，并可能成為治療BA的潛在生物學靶點。目前，國內(nèi)已有醫(yī)療中心通過檢測血清MMP-7水平進行BA的診斷，但該方法能否代替術中膽道造影，尚需更大樣本量及更多的臨床試驗來驗證。此外，其他MMPs在BA患者血清中也有一定升高，例如MMP-2、MMP-3、MMP-9等，但其升高程度及診斷價值遠不如MMP-7［27，28］。

2.RNAs：MicroRNAs是近來研究BA發(fā)病機制的“明星分子”，其在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起作用，BA患者血清中可能含有高靈敏度和高特異度的miRNA生物標志物。Zahm等［29］將BA與其他形式的新生兒高膽紅素血癥患者進行比較，發(fā)現(xiàn)miR-200a、miR-200b、miR-429在BA患者中的表達皆上調(diào)，具有一定的診斷價值。另一方面，在另一項具有潛在診斷價值的研究中也報道了miR-4429的下調(diào)和miR-4689的上調(diào)［30］。此外，Peng等［31］通過二代測序，與膽汁淤積患者及健康對照組對比，發(fā)現(xiàn)BA患者血漿中的miR-140-3p下調(diào)，有一定的診斷價值。有趣的是，該研究試圖驗證之前已報道的在人類和BA模型中可能存在miR-200家族、miR-21、miR-29a以及miR-222，但只有miR-200家族的上調(diào)被證實。BA的發(fā)病與免疫系統(tǒng)的失調(diào)密切相關，而microRNA可通過多種靶基因及信號通路影響B(tài)A的發(fā)生發(fā)展及肝纖維化［32］。microRNA成為近年來研究的熱點，在BA的診斷及預后方面體現(xiàn)出一定的價值，可通過測定其水平來預測肝纖維化程度［33］。

此外，LncRNA參與BA發(fā)病機制的研究也在不斷深入。近年來，Xiao等［34］研究指出，LncRNA H19可通過調(diào)控S1PR2／SphK2和let-7／HMGA2軸在BA膽管細胞增殖及淤膽性肝損傷中發(fā)揮關鍵作用，LncRNA H19可能是BA非侵入性診斷的生物標志物和潛在治療靶點。Nuerzhati等［35］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA ANXA2P3和ANXA2可能對肝損傷有保護作用，被認為是BA患者的生物標志物。然而，由于缺乏臨床大樣本驗證，RNAs目前仍停留在BA病因研究層面，極少應用于臨床診斷。基于MicroRNAs在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，未來有望成為BA早期篩查項目之一。

二、影像學早期診斷

（一）超聲檢查

超聲作為一種無創(chuàng)、簡便的診斷方法，廣泛應用于BA患者的早期診斷。肝門三角形條索征（triangular cord sign，TCS）和膽囊畸形為超聲診斷BA的兩個重要特征，其中膽囊畸形主要指膽囊缺如、體積小、形態(tài)不規(guī)則、膽囊壁異常、膽囊空虛等［36］。Takamizawa等［37］研究也發(fā)現(xiàn)，結合肝門三角形條索征、膽囊長徑及膽囊收縮率可較準確地診斷BA，該研究團隊將具有TCS≥3 mm、膽囊長徑＜15 mm、膽囊收縮率＜68%（＜12周）或＜25%（≥12周）特征者判定為陽性；并指出當TCS及膽囊長徑均為陽性時，診斷BA的陽性預測值可達98%，而當三者均為陰性時，可完全排除BA。但也有研究指出，超聲三角條索征象無法提示BA病情的進展［38］。近年來，有研究提出肝門增大淋巴結的存在是無創(chuàng)診斷BA的另一個高度敏感征象，通過肝門部增大的淋巴結、膽囊分型及肝門三角形纖維塊，多數(shù)BA可被識別［39］。此外，Wu等［40］報告了瞬時彈性成像在BA和膽汁淤積患者鑒別診斷及隨訪中的應用，與其他膽汁淤積患者相比，BA患者METAVIR肝組織學評分和肝臟硬度（liver stiffness measurement，LSM）值明顯偏高，建議可以采取瞬時彈性成像這種非侵入性方法進行鑒別診斷［41］。隨著研究的深入，實時剪切波彈性成像（ultrasound shear wave elastography，SWE）輔助超聲也被證明可用于BA與其他膽汁淤積性疾病的鑒別［42，43］。

Jonathan等［44］對28例3月齡以下嬰兒膽汁淤積癥（直接膽紅素＞2 mg／dL）和13例可能的BA患者進行前瞻性研究，比較二維超聲、點超聲橫波彈性成像及實驗室檢測之間的診斷效能。該研究增加了肝臟橫波速度測量，以探究超聲SWE對BA及其他膽汁淤積癥患者間的鑒別能力，超聲彈性成像時的中位年齡為37天（24～52天），在BA及非BA患者之間無差異（P＝0.19），而在BA陽性和陰性受試者之間有顯著差異。BA患者的肝纖維化程度可通過實時剪切波彈性成像（shear wave elastography，SWE）輔助超聲來反映，表現(xiàn)出較高的靈敏度及特異度，值得進一步推廣［45］。Wang等［46］通過建立大鼠膽管結扎模型，發(fā)現(xiàn)定量超聲造影不僅能反映肝動脈增生，還能反映Kupffer細胞的增加。該研究團隊猜測，定量超聲造影可能是診斷BA的一種有價值的非侵入性檢查方法。

（二）肝膽核素顯像

以往研究表明，放射性肝膽核素顯像診斷BA具有較高的靈敏度（98.7%），但特異度較低（33%～80%）［47］。患者檢查前需口服苯巴比妥肝酶誘導劑、使用99m锝標記的亞氨基二乙酸衍生物行腸道內(nèi)顯影或腸道、膽囊顯影。據(jù)報道，苯巴比妥增強肝膽顯像在BA診斷中具有較高的準確性（靈敏度100%，特異度93%，準確性94.6%），但此檢查所需時間較長，且具有一定的放射性風險，同時檢查結果的判讀影響因素較多，在臨床工作中應用受限。

（三）MRCP和MRI

MRCP是一種無創(chuàng)傷的膽胰管成像方法，具有安全、簡便、無需造影劑等優(yōu)點。MRCP能清楚顯示患者擴張的肝內(nèi)、肝外膽道系統(tǒng)，可進行多方位、多角度的觀測。MRCP對于BA的診斷價值并不大，但是對先天性膽管擴張癥具有較高的診斷準確性。近年來，有報道基于MRI的BA診斷決策樹模型使BA與其他嬰幼兒膽汁淤積癥的鑒別診斷準確率得到提高，靈敏度為97.3%，特異度為94.8%，準確率為96.2%。目前，將MRCP及MRI聯(lián)合應用于BA的診斷得到一定的發(fā)展，但部分導致膽汁分泌異常的因素可致肝外膽道樹識別不佳，對BA的診斷造成一定的干擾。同時該檢查較為昂貴，相比超聲其應用有一定的局限性。