外泌體與非癡呆型血管性認(rèn)知障礙的研究進(jìn)展

梁紫君，鄭 娜，張雪兒綜述，安紅偉審校

0 引 言

隨著我國人口老齡化的加劇、腦卒中發(fā)病率的提高，血管性認(rèn)知障礙(vascular cognitive impairment, VCI)的發(fā)病率顯著增加，引起廣泛關(guān)注和重視。VCI是指與腦血管疾病相關(guān)的所有形式的認(rèn)知障礙，可分為3種亞型：非癡呆型血管性認(rèn)知障礙(vascular cognitive impairment no dementia, VCIND)、血管性癡呆(vascular dementia, VaD)和混合性癡呆[1]。VCIND是VCI的早期階段，其認(rèn)知障礙還未達(dá)到癡呆水平。VCIND是我國最常見的輕度認(rèn)知功能障礙亞型，占總病例的42.0%[2]。有研究報(bào)道，50%的VCIND患者在5年的隨訪中發(fā)展為癡呆[3]。另外，Tang等[4]對香港大學(xué)附屬地區(qū)醫(yī)院的328例急性腦梗死患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)有180例在3個(gè)月后患VCIND；對其中的143例VCIND患者進(jìn)行15個(gè)月的隨訪，發(fā)現(xiàn)29例受試者可從認(rèn)知障礙(非癡呆癥)恢復(fù)到正常認(rèn)知狀態(tài)(返回者)，不返回者和進(jìn)展為癡呆癥的受試者分別為98例和16例。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和干預(yù)VCIND，可延緩VCI進(jìn)程，對提高患者生存質(zhì)量、減輕家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)，具有極大的必要性和重要性。

近年來，外泌體逐漸成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)，越來越多研究表明其各系統(tǒng)疾病的診斷、預(yù)后判斷和治療等方面均表現(xiàn)出作為生物標(biāo)志物的巨大潛力。因此，了解外泌體及其所攜帶分子對神經(jīng)血管的作用機(jī)制，根據(jù)外泌體的性質(zhì)挖掘其潛在的應(yīng)用價(jià)值，這有望在VCIND的診療方面發(fā)揮極大的優(yōu)勢。本文外泌體與VCIND研究進(jìn)展作一綜述。

1 外泌體概述

1.1 生物學(xué)特性1987年，Johnstone等[5]在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟過程中，發(fā)現(xiàn)了一種可分泌到細(xì)胞外面的膜型囊泡，并將其命名為外泌體。外泌體是細(xì)胞通過“內(nèi)吞-融合-外排”等調(diào)控過程而形成的胞外納米級多泡體，其本質(zhì)是一種直徑約為30～150 nm的脂質(zhì)雙層囊泡。目前已證實(shí)外泌體內(nèi)含物主要包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等多種生物活性成分。外泌體中普遍存在的蛋白質(zhì)包括四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)和熱休克蛋白70等, 這些蛋白質(zhì)常作為外泌體標(biāo)記物。外泌體富含膽固醇、磷脂、磷脂酰絲氨酸和前列腺素等脂質(zhì)，包含的核酸主要有mRNA、miRNA、DNA等。由于miRNA在基因表達(dá)中重要的調(diào)節(jié)作用，所以外泌體miRNA也被廣泛研究。2007年Valadi等[6]首先發(fā)現(xiàn)了外泌體中存在miRNA，并且可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中從而發(fā)揮相關(guān)的作用。外泌體已被發(fā)現(xiàn)可由多種細(xì)胞產(chǎn)生并釋放，還可從血液、腦脊液、唾液、尿液、精漿等多種人體體液中檢測和分離，在許多疾病的研究中顯示出重要的潛在價(jià)值[7-8]。

1.2 生物學(xué)功能作為細(xì)胞-細(xì)胞交流媒介，外泌體最為重要的生理作用是細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)傳遞，其作用機(jī)制為：外泌體可作為一種信號(hào)復(fù)合體通過受體介導(dǎo)直接刺激靶細(xì)胞；外泌體可轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、核酸等生物活性成分進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，通過影響靶細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路，從而改變受體細(xì)胞表型和影響細(xì)胞功能狀態(tài)[9]。外泌體在體液中高度穩(wěn)定，具有來源廣泛、易獲取、具有非侵襲性的優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體具有穿越血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)的能力[10]，在神經(jīng)保護(hù)及可塑性、血管新生、免疫應(yīng)答等方面具有重要的生物學(xué)功能。因此，我們可通過獲取其分子內(nèi)容物研究大量原始細(xì)胞生理和病理狀態(tài)下信息。

2 外泌體在VCIND發(fā)生發(fā)展中的作用

VCIND多有腦血管危險(xiǎn)因素(如高血壓、糖尿病和高血脂癥等)，或有明顯(如腦梗死和腦出血等)或不明顯的腦血管病史(如白質(zhì)疏松和慢性腦缺血)，與血管性腦組織損傷存在密切關(guān)系。而這些危險(xiǎn)因素和腦血管病的發(fā)生可引起或加重VCIND，影響著VCIND的發(fā)生與發(fā)展。VCIND有著各種復(fù)雜的生理病理機(jī)制，神經(jīng)血管單元的概念的出現(xiàn)讓我們以大腦的整體性的視覺來看待VCIND這一疾病。神經(jīng)血管單元(neurovascular unit, NVU)是由神經(jīng)元、血管細(xì)胞(即內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞)、膠質(zhì)細(xì)胞(即星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)組成。NVU控制BBB滲透性和腦血流量，并維持神經(jīng)元環(huán)境的化學(xué)成分，這是神經(jīng)元回路正常運(yùn)作所必需的[11]。各組分之間緊密聯(lián)系，組分的完整性對大腦功能的正常發(fā)揮具有重要意義。外泌體在NVU中對信號(hào)傳遞有著重要作用，通過作用于靶細(xì)胞而促進(jìn)疾病的發(fā)生與恢復(fù)，而這些信號(hào)傳遞通路中可能存在VCIND治療和藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。

2.1 外泌體與缺血后神經(jīng)損傷當(dāng)腦血管堵塞或破裂時(shí)，形成血液循環(huán)障礙，誘發(fā)腦組織由于缺血缺氧而死亡，最終可導(dǎo)致認(rèn)知障礙的發(fā)生。星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中BBB結(jié)構(gòu)的主要成分，并參與BBB完整性和血流量的調(diào)節(jié)，其功能受到腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)條件下培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，從而加劇BBB破壞，減少局部腦血流量，導(dǎo)致梗塞體積增加和神經(jīng)功能缺損[12]。Zhang等[13]在創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，外泌體可顯著增加大腦缺血病變邊緣區(qū)和齒狀回新生內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量，以及提高齒狀回新生的未成熟和成熟神經(jīng)元的數(shù)量，減少神經(jīng)炎癥，促進(jìn)神經(jīng)血管的重塑，從而改善認(rèn)知功能。以上研究結(jié)果表明，外泌體參與缺血后神經(jīng)損傷的的調(diào)節(jié)。

2.2 外泌體與神經(jīng)可塑性及保護(hù)作用在缺血缺氧環(huán)境刺激下，外泌體可通過促進(jìn)神經(jīng)突起再生而參與神經(jīng)細(xì)胞重塑，減少神經(jīng)細(xì)胞變性，對受損神經(jīng)進(jìn)行修復(fù)和保護(hù)。有研究顯示，使用過表達(dá)miR-133b的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體，能促進(jìn)OGD情況下星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的二次釋放，明顯促進(jìn)大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠大腦神經(jīng)軸突的生長和伸長，提高腦卒中后的神經(jīng)可塑性和促進(jìn)功能恢復(fù)[14]。同時(shí)，缺氧缺血產(chǎn)生的炎性作用會(huì)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放外泌體，其中起到保護(hù)作用的除miRNA還有外泌體所攜帶的蛋白質(zhì)，如朊蛋白可提高神經(jīng)元在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的存活率，從而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用[15]。

2.3 外泌體促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)與血管性認(rèn)知障礙相關(guān)[16]。有研究表明，頸動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)造成血管狹窄而導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)異常和腦供血不足，與VCI密切相關(guān)，是VCI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[17]。在一項(xiàng)探討急性缺血性卒中患者頸動(dòng)脈狹窄與認(rèn)知障礙之間的潛在聯(lián)系的橫斷面研究中，頸動(dòng)脈高度狹窄患者患認(rèn)知障礙的可能性是無頸動(dòng)脈狹窄患者的1.49倍，而且其認(rèn)知障礙與右頸動(dòng)脈高度狹窄更相關(guān)[18]。而高血壓、糖尿病、高血脂癥、高同型半胱氨酸等腦血管疾病危險(xiǎn)因素均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮破壞而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，造成腦血管狹窄或閉塞，局部腦血流量減低，導(dǎo)致大腦的新陳代謝受到損害而影響VCIND的發(fā)生和發(fā)展。

作為VCI、VCIND的重要病理原因，動(dòng)脈粥樣硬化是一種血管壁的慢性炎性反應(yīng)性疾病，主要病理表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤，脂質(zhì)沉積，細(xì)胞增殖和凋亡；最初形成脂紋，最終形成脂質(zhì)粥樣斑塊，斑塊的出血、破裂可引起腦血管損壞而導(dǎo)致認(rèn)知障礙。有研究表明，外泌體作為血細(xì)胞和血管組織之間交流的媒介，參與AS的介導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等過程[19]。CD137修飾的內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體(CD137-Exo)通過NF-КB途徑介導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子IL-6表達(dá)，觸發(fā)Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)AS的形成[20]。另外，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的外泌體介導(dǎo)KLF5誘導(dǎo)的miR-155從平滑肌細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移，破壞緊密連接和內(nèi)皮屏障的完整性，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[21]。此外，含有miR-223，miR-339和miR-21的活化的血小板源性外泌體可以轉(zhuǎn)移到VSMC中并抑制血小板衍生的生長因子受體β的表達(dá)，誘導(dǎo)血小板聚集，介導(dǎo)凝血途徑，從而促進(jìn)AS的形成[22]。炎癥反應(yīng)是AS的重要病理過程，因此及時(shí)抗炎可以延緩AS所致的疾病進(jìn)程，降低相應(yīng)器官功能的損害。有研究發(fā)現(xiàn)，分子工程M2巨噬細(xì)胞衍生的外泌體通過表面結(jié)合的趨化因子受體和從抗炎M2巨噬細(xì)胞釋放的抗炎細(xì)胞因子，表現(xiàn)出良好的趨炎和抗炎作用；此外，被包裹的5-氨基乙酰丙酸己酯鹽酸鹽可進(jìn)行血紅素的內(nèi)源性生物合成和代謝，產(chǎn)生抗炎的一氧化碳和膽紅素，從而進(jìn)一步增強(qiáng)抗炎作用并最終緩解AS[23]。以上研究結(jié)果表明，外泌體對AS有著重要的參與作用。

2.4 外泌體促進(jìn)血管新生和修復(fù)外泌體參與腦血管損傷后的血管修復(fù)和血管再生過程。Xu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元通過分泌含有miR-132的外泌體作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞中Eef2k基因，進(jìn)而抑制Eef2k基因的表達(dá)從而上調(diào)血管連接蛋白Cdh5分子表達(dá)，調(diào)節(jié)血管完整性。在局灶性腦缺血小鼠模型中，下調(diào)腦血管中miR-15a的水平，可提高成纖維細(xì)胞生長因子2和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)水平，從而促進(jìn)缺血性腦卒中后周邊區(qū)域的血管生成[25]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體分泌的δ樣蛋白4，能刺激周細(xì)胞上的Notch3受體，維持腦血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)血管形成[26]。

2.5 外泌體與Aβ及tau蛋白的關(guān)系β-淀粉樣蛋白(β- amyloid, Aβ)的異常沉積和tau蛋白過磷酸化是阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)的主要病理學(xué)特征。研究發(fā)現(xiàn)，腦血管疾病與AD之間有著密切的關(guān)系[27]，且血管性認(rèn)知障礙與AD有著重疊的危險(xiǎn)因素及病理改變(如Aβ聚集和tau纏結(jié)等)。有研究表明，缺血誘導(dǎo)的Aβ42/ tau病理改變可能與腦卒中后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[28]。由此猜測，在缺血缺氧的條件下，神經(jīng)血管單元受到破壞，引起Aβ的異常沉積和tau蛋白磷酸化改變而造成神經(jīng)退行性變，導(dǎo)致認(rèn)知功能減退。外泌體可自由穿過血腦屏障，能攜帶來源細(xì)胞的某些特異性物質(zhì)穩(wěn)定存在血液等體液中，這對研究血漿外泌體與認(rèn)知障礙之間的關(guān)系有很大的價(jià)值。

近年來大量研究表明外泌體可通過調(diào)節(jié)Aβ的沉積和tau蛋白磷酸化，從而影響認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展。在體外實(shí)驗(yàn)中，小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體中的miR-124-3p(EXO-124))可通過靶向Rela基因，發(fā)揮促進(jìn)Aβ分解的作用，從而抑制Aβ異常[29]。神經(jīng)纖維纏結(jié)是tau蛋白過度磷酸化造成的。有研究表明，AD患者中的外泌體可通過不同的機(jī)制招募與神經(jīng)退行性變相關(guān)的線粒體蛋白和軸突發(fā)生蛋白，促進(jìn)tau蛋白過磷酸化[30]。此外，Mullins等[31]研究發(fā)現(xiàn)外泌體可通過胰島素抵抗途徑參與神經(jīng)元凋亡；與對照組相比，在AD患者中神經(jīng)源性的血漿外泌體含有更高的pSer312-IRS-1(無效胰島素信號(hào)蛋白)和更低的p-panTyr-IRS-1(有效胰島素信號(hào)蛋白)，前者與腦體積成負(fù)相關(guān)，可引起Aβ沉積和tau異常磷酸化。這些研究表明，外泌體可通過不同的途徑參與β-淀粉樣蛋白和tau蛋白的調(diào)節(jié)，影響認(rèn)知障礙的進(jìn)展。

3 外泌體在VCIND診斷中的潛在應(yīng)用

研究表明，外泌體不僅與VCIND的發(fā)生演進(jìn)密切相關(guān)，而且在診斷中也發(fā)揮著重要作用。近年來，越來越多的研究表明外泌體具有作為疾病的早期診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物的潛在優(yōu)勢。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，外泌體能夠成為診斷標(biāo)志物可能有以下幾方面的原因[32]：第一，在疾病過程中，外泌體的內(nèi)容物(核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))會(huì)發(fā)生變化；第二，外泌體可無創(chuàng)性地從易獲得的血液、尿液等體液中分離出來，這有利于疾病早期診斷的檢測；第三，外泌體可通過BBB，可提供有關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的信息；第四，外泌體具有比較穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu)，保護(hù)其內(nèi)含物質(zhì)不容易降解，而且外泌體高度穩(wěn)定，可長期保存；第五，不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不同的特性，根據(jù)其特性可判斷外泌體的組織細(xì)胞來源。

有研究發(fā)現(xiàn)，無癥狀性頸動(dòng)脈狹窄(管腔狹窄率> 50%)患者的血漿外泌體miR-199b-3p、miR-27b-3p、miR-130a-3p、miR-221-3p和miR-24-3p明顯增高，可作為無癥狀性頸動(dòng)脈狹窄進(jìn)展的生物標(biāo)志物[33]。趙維納等[34]通過采集68例VCI患者血樣，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-29c表達(dá)量越高，MoCA評分越低，F(xiàn)A、VitB12 水平越低，Hcy、CRP水平越高，認(rèn)知功能損傷越嚴(yán)重，這提示血漿外泌體miR-29c具有作為VCI診斷候選生物標(biāo)志物的潛能。Kenny等[35]研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA Let-7b和miRNA-206的表達(dá)水平在輕度認(rèn)知障礙(mild cognitive impairment, MCI)和AD患者的血漿中均升高，其中前者水平升高可用于識(shí)別MCI患者，而后者與認(rèn)知功能衰退和記憶缺陷有很強(qiáng)的相關(guān)性，5年的縱向隨訪發(fā)現(xiàn)miRNA-206在癡呆癥發(fā)病前增加，因此miRNA-206血漿水平的變化可用于預(yù)測MCI階段認(rèn)知功能下降和癡呆的進(jìn)展。黃菁菁等[36]通過分析比較有癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的老年患者和無癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的老年患者血漿中MiRNA210的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)前者血漿中MiRNA210的表達(dá)水平明顯高于后者。另外有研究發(fā)現(xiàn)，血液中神經(jīng)源性外泌體中的提取物P-S396-tau、P-T181-tau和Aβ1-42的水平可預(yù)測阿爾茨海默病的發(fā)生，最長可在臨床發(fā)病前10年出現(xiàn)陽性表達(dá)[37]。

綜上所述，外泌體及其相關(guān)成分可為探索VCIND診斷的分子標(biāo)志物提供依據(jù)，在VCIND診斷和預(yù)防方面具有潛在價(jià)值。

4 外泌體在VCIND治療中的潛在作用

有關(guān)外泌體對VCIND治療方面的研究目前尚處于基礎(chǔ)研究階段。一系列研究表明，外泌體能通過血腦屏障，具有將分子特異性物質(zhì)輸送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的潛力，有望成為一種新型治療性運(yùn)載工具。Toyama等[38]通過建立血管認(rèn)知障礙的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)TNFα-miR-501-3p-ZO-1軸在腦低灌注引起的工作記憶障礙和腦白質(zhì)損傷的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。因此抑制miR-501-3p有可能成為治療慢性腦低灌注所致血管性認(rèn)知障礙的一種潛在新療法。由此推測，以與損害血腦屏障相關(guān)的miRNA作為作用靶點(diǎn)，可以通過改善BBB功能障礙來改善認(rèn)知障礙。另外，間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞具有強(qiáng)大的外泌體產(chǎn)生和釋放能力。已有大量研究證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞可通過分泌相關(guān)外泌體因子促進(jìn)腦損傷后的血管生成、神經(jīng)發(fā)生和白質(zhì)重塑，而經(jīng)改造的造血干細(xì)胞分泌的外泌體可促進(jìn)梗死區(qū)域周圍的血管新生及神經(jīng)功能恢復(fù)[39]。

5 結(jié) 語

近年來，越來越多的研究證實(shí)外泌體在血管性認(rèn)知障礙的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，且研究主要集中在腦缺血后的損傷修復(fù)機(jī)制方面。外泌體在VCIND中的診療方面展示出極大的應(yīng)用潛力，但研究仍處于起步階段，依然存在很多問題尚未解決，如外泌體攜帶的特異性內(nèi)容物對VCIND的作用機(jī)制尚未完全闡明；目前外泌體中的RNA研究主要集中在miRNA，其他特異性RNA的發(fā)現(xiàn)很少等。探索外泌體與VCIND疾病之間的關(guān)系，將會(huì)為VCIND的發(fā)病機(jī)制提供新的思路，為VCIND的診療和預(yù)防帶來新的希望。