動物細(xì)胞骨架微絲標(biāo)記與觀察綜合性實驗的探索*

李奇志 楊業(yè)秋 夏 姝 楊建國

（1 華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國家級生命科學(xué)與技術(shù)虛擬仿真實驗教學(xué)中心 湖北武漢 430074 2 江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院 湖北武漢 430056 3 武漢大學(xué)中南醫(yī)院心胸外科 湖北武漢 430070）

細(xì)胞骨架是指真核細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)架體系，它對于細(xì)胞的形狀、細(xì)胞的運動、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運輸、染色體的分離和細(xì)胞分裂等起著重要的作用。細(xì)胞骨架由微管、微絲和中間纖維組成。其中,由肌動蛋白組成的微絲是真核細(xì)胞中含量最豐富的一種蛋白復(fù)合體，其動態(tài)變化在細(xì)胞遷移、胞質(zhì)分裂、囊泡運輸、細(xì)胞吞噬等多個過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［1－3］。

在細(xì)胞生物學(xué)本科教學(xué)中，細(xì)胞骨架往往成為講解研究技術(shù)等的示例,實驗教學(xué)中更是入選率最高的實驗內(nèi)容［4］。傳統(tǒng)的實驗教學(xué)多選用“考馬斯亮藍染色標(biāo)記細(xì)胞骨架實驗”即采用非特異方法顯示洋蔥細(xì)胞內(nèi)的微絲束。該實驗在一定程度上可幫助學(xué)生加深對細(xì)胞骨架的認(rèn)識，并了解染色方法和步驟，但存在諸多缺陷，例如，考馬斯亮藍染色法不能對特異性地區(qū)分細(xì)胞骨架的具體組分。華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院以當(dāng)前較先進的實驗技術(shù)為基石，設(shè)計了動物細(xì)胞骨架微絲標(biāo)記的綜合性實驗，在實驗設(shè)計中考慮到醫(yī)學(xué)生的專業(yè)特點，將實驗材料洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞換成體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞。保留非特異性蛋白質(zhì)染料考馬斯亮藍染色的同時，增加了用特異性熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽熒光探針染色肌動蛋白，并用細(xì)胞松弛素B 處理細(xì)胞后觀察微絲的變化。

（E-mail: zhangji@nwnu.edu.cn）

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝母細(xì)胞瘤HepG2（以下簡稱HepG2）細(xì)胞系由華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院基因工程和基因組學(xué)聯(lián)合實驗室捐贈、大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6（以下簡稱C6）細(xì)胞系由武漢大學(xué)中南醫(yī)院心胸外科教研室捐贈、SD 大鼠新生乳鼠（購于湖北省疾控中心）原代培養(yǎng)細(xì)胞（所有動物實驗操作均符合華中科技大學(xué)實驗動物倫理委員會有關(guān)條例規(guī)定）。

1.2 試劑和儀器 DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購自HyClone 公司；細(xì)胞松弛素B、DAPI、FITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽和Cy3 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽購自南京凱基生物公司；新生小牛血清和胎牛血清購自中國杭州四季青生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

6 cm 培養(yǎng)皿（Gibco 公司）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（ESCO，CCL-170B-8-NF）、倒置顯微鏡（Nikon，TS-100）、熒光顯微鏡（Nikon，Ni-U）。

1.3 動物細(xì)胞系傳代培養(yǎng) 將HepG2 細(xì)胞系按104～105個／mL 濃度接種在6 cm 的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入2 mL 的含8%小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，輕輕吹打使細(xì)胞分散均勻，再加入一定體積的上述完全培養(yǎng)基使終體積達到5 mL，在每個培養(yǎng)皿中放入3 片無菌蓋玻片（經(jīng)160℃、2 h 干烤滅菌）作為細(xì)胞爬片；培養(yǎng)皿放入37℃、5% CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

C6 細(xì)胞系的完全培養(yǎng)基是含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，操作步驟同上。

1.4 動物細(xì)胞原代培養(yǎng) 無菌條件下取大鼠乳鼠皮膚約2 cm2，置于培養(yǎng)皿中，用0.01 mol／L PBS 反復(fù)洗滌后,剪成1～2 mm2的小塊，0.25%胰蛋白酶中37℃水浴30 min，800 r／min 離心10 min后，以1×105個／mL 細(xì)胞接種于6 cm 的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中加入含8%小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，并放入無菌蓋玻片作為細(xì)胞爬片；培養(yǎng)皿在37℃、5% CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 考馬斯亮蘭染色法 考馬斯亮藍R250 顯示細(xì)胞內(nèi)微絲的方法［5］：吸去培養(yǎng)皿中陳舊的培養(yǎng)基，用0.01 mol／L PBS 洗滌培養(yǎng)皿中長有細(xì)胞的爬片后，1% Triton X-100 37 ℃處理30 min，M 緩沖液洗滌細(xì)胞爬片，在3 %戊二醇中固定10 min，以0.01 mol／L PBS 洗滌，用濾紙吸去多余液體，0.2%考馬斯亮藍R250 染色15 min，PBS 洗滌,最后將細(xì)胞爬片倒置于載玻片上用PBS 液封片并鏡下觀察。

1.6 FITC-鬼筆環(huán)肽熒光標(biāo)記法［6］大鼠乳鼠原代細(xì)胞骨架微絲的熒光染色具體步驟如下：吸去培養(yǎng)皿中陳舊的培養(yǎng)基，用0.01 mol／L PBS 洗滌培養(yǎng)皿中長有細(xì)胞的爬片后，3.7%甲醛固定10 min，PBS 洗3 次，每次5 min；0.1% Triton X-100 透化處理15 min，PBS 洗滌；FITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽室溫避光反應(yīng)40 min；PBS 洗去未結(jié)合的熒光染料，最后，用甘油封片將細(xì)胞爬片倒扣置于載玻片上并鏡下觀察。

1.7 熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽和DAPI 分別標(biāo)記體外培養(yǎng)細(xì)胞 HepG2 細(xì)胞骨架微絲和細(xì)胞核的熒光染色具體步驟如下：吸去培養(yǎng)皿中陳舊的培養(yǎng)基，經(jīng)0.01 mol／L PBS 洗滌培養(yǎng)皿中長有細(xì)胞的爬片后，4%的多聚甲醛固定，用0.1% Triton X-100室溫處理5 min，1%的BSA 孵育30 min 后，用5U Cy3 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽于室溫暗處理20 min，并100 ng／mL 的DAPI，室溫暗處理5 min。PBS 清洗細(xì)胞和細(xì)胞封片同1.6。

大鼠乳鼠原代細(xì)胞骨架微絲的熒光染色同1.6，細(xì)胞核熒光染色用100 ng／mL 的DAPI，室溫暗處理5 min，PBS 清洗細(xì)胞和細(xì)胞封片同1.6。

1.8 細(xì)胞松弛素B 處理HepG2 細(xì)胞 在培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1 mg／mL（DMSO 配制）的細(xì)胞松弛素B 溶液，使終濃度為10 μg／mL，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，對照組細(xì)胞相應(yīng)用等量生理鹽水和DMSO 處理［7］，實驗組和對照組都在15 min 和30 min 后進行考馬斯亮藍染色。將細(xì)胞松弛素B 處理過的細(xì)胞爬片用PBS 液洗細(xì)胞5 次后，繼續(xù)培養(yǎng)90 min 后進行考馬斯亮藍染色并觀察。

2 結(jié)果

2.1 HepG2、C6 細(xì)胞系和原代細(xì)胞考馬斯亮藍R250 染色（圖1）

圖1 經(jīng)典方法考馬斯亮藍染液將微絲被染成藍色

2.2 熒光探針標(biāo)記原代培養(yǎng)細(xì)胞（圖2）

圖2 FITC-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動蛋白在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光

2.3 雙熒光探針標(biāo)記體外培養(yǎng)的原代大鼠皮膚細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞系（圖3）

圖3 細(xì)胞的肌動蛋白和細(xì)胞核分別被鬼筆環(huán)肽和DAPI 熒光探針標(biāo)記

2.4 細(xì)胞松弛素B 處理細(xì)胞前、后微絲的變化和細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變（圖4）

圖4 細(xì)胞松弛素B 處理前后HepG2 細(xì)胞微絲和細(xì)胞形態(tài)的變化

3 實驗教學(xué)探討

3.1 細(xì)胞骨架標(biāo)記方法的優(yōu)、缺點比較 在本教學(xué)中用2 種方法標(biāo)記細(xì)胞骨架微絲：考馬斯亮藍染色法和鬼筆環(huán)肽標(biāo)記法標(biāo)記法?？捡R斯亮藍R250染色法具有成本低、可用普通光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果的優(yōu)點；考馬斯亮藍R250 可染各種蛋白，并非特異染微絲，不能區(qū)分骨架蛋白的成分；但在該實驗條件下，微管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，有些類型的纖維太細(xì)，光學(xué)顯微鏡下無法分辨，因此，觀察到的主要是由微絲組成的直徑約40 nm 應(yīng)力纖維（圖1、圖4）。鬼筆環(huán)肽標(biāo)記法中鬼筆環(huán)肽與肌動蛋白結(jié)合，能特異顯示微絲并且靈敏度極高（圖2、圖3）；該方法在處理細(xì)胞時用的固定和通透細(xì)胞膜沒有完全去除細(xì)胞膜及其他非骨架成分，維持了骨架形態(tài)的完整性，相對真實地反映了骨架的自然狀態(tài)，也是科學(xué)研究的主流方法之一；但由于需要與熒光素結(jié)合，觀察結(jié)果時需要熒光顯微鏡，且價格相對比較貴，因此在實驗教學(xué)有時會受到限制。

3.2 根據(jù)學(xué)情背景不同的教學(xué)設(shè)計 華中科技大學(xué)生命學(xué)院每年承擔(dān)同濟基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院9 個專業(yè)20多個班級的本科生、臨床醫(yī)學(xué)8年制及留學(xué)生MBBS（Bachelor of Medicine ＆ Bachelor of Surgery）的醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)；同時每年還有生物技術(shù)、生物信息和生物科學(xué)近10 個班細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)任務(wù)。根據(jù)各專業(yè)特點開設(shè)高質(zhì)量有專業(yè)特色的實驗課程是學(xué)院課程改革探索的主要重點，該實驗項目就是在這樣的改革背景下探索實施的。實驗內(nèi)容涉及細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞熒光標(biāo)記技術(shù)，根據(jù)各專業(yè)的特點在多方面進行了實驗優(yōu)化。例如，細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)容的選擇是根據(jù)專業(yè)特點不同而不同。細(xì)胞培養(yǎng)作為細(xì)胞生物學(xué)實驗中最具有代表性的技術(shù)，其關(guān)鍵在于無菌操作。因此，根據(jù)無菌操作的難易程度，將操作步驟復(fù)雜、過程繁多的動物細(xì)胞原代培養(yǎng)安排在臨床醫(yī)學(xué)8年制的實驗中；而臨床醫(yī)學(xué)5年制、預(yù)防醫(yī)學(xué)等專業(yè)選擇操作相對簡單的傳代細(xì)胞培養(yǎng)，并且選用體積較大、鋪展較好、貼壁牢固的HepG2 或HeLa 細(xì)胞系；臨床醫(yī)學(xué)6年制選用操作動作要求更加輕柔的C6細(xì)胞系；對生物學(xué)專業(yè)的學(xué)生，由于他們比醫(yī)學(xué)生高一年級（醫(yī)學(xué)生和生物學(xué)專業(yè)學(xué)生分別是第2 學(xué)期和第3 學(xué)期學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)的課程）同時動手能力也較強，因此，在實驗中將這幾種細(xì)胞按學(xué)生分組全部分配給各組學(xué)生培養(yǎng)。教師在上課時展示不同的專業(yè)學(xué)生培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)果，探討不同細(xì)胞內(nèi)微絲的分布特征、微絲的數(shù)量及構(gòu)型在細(xì)胞之間的差異，使學(xué)生對微絲的理解更加深入和全面，知識面得到很大的拓展。

實驗設(shè)計還必需考慮由于實驗學(xué)生人數(shù)多會造成實驗安全性難以把控、實驗者的參與熱情和實驗的成功率受到影響，因此，選擇適合于學(xué)生當(dāng)前學(xué)情的實驗材料不僅可增加實驗的成功率,而且可增加學(xué)生的科研訓(xùn)練機會,使學(xué)生獲得成就感,增加學(xué)習(xí)的興趣和自信心。筆者對實驗材料進行如下改進。首先，對用于細(xì)胞爬片的蓋玻片的滅菌方法進行了改進。改進前常規(guī)將蓋玻片浸泡在醫(yī)用酒精里，細(xì)胞培養(yǎng)接種細(xì)胞時將泡在酒精里的蓋玻片在酒精燈上燒后再置于培養(yǎng)皿里做細(xì)胞爬片。這種方法在操作者不熟練時容易發(fā)生起火的安全事故，而且蓋玻片在酒精燈上燒的時間不長，在培養(yǎng)時間長達1 周時這種滅菌效果并不理想。因此改進方法是將做細(xì)胞爬片的蓋玻片在干烤箱里160℃、2 h 滅菌處理，這樣既避免了沾有酒精的蓋玻片在酒精燈上燒也保證了滅菌效果。其次，實驗中將常規(guī)用多孔板傳代細(xì)胞換成每位學(xué)生用一個6 cm 的培養(yǎng)皿，在教學(xué)中教師講述粘附細(xì)胞生長的特點。粘附細(xì)胞在蓋玻片上、下面都能貼壁生長，貼附在蓋玻片上面的細(xì)胞比下面的生長得更快、更好，鼓勵學(xué)生大膽同時仔細(xì)地將2～3 片滅菌蓋玻片放在培養(yǎng)皿中，盡量不要重合，即使有重合對實驗結(jié)果不會有大的影響。這樣的實驗設(shè)計既增加了學(xué)生的操作機會，學(xué)生也更能理解培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點，同時還能避免多位學(xué)生用一塊多孔板可能造成的交叉污染。最后，教學(xué)中將學(xué)生細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基、PBS 和胰蛋白酶等都換成小包裝，例如，培養(yǎng)基和PBS 裝在可重復(fù)利用的10 mL 離心管中，胰蛋白酶裝在1.5 mL的EP 管中，每班學(xué)生利用課余時間分裝這些試劑。這樣在很大程度上避免了眾多學(xué)生參與的細(xì)胞培養(yǎng)可能出現(xiàn)的交叉污染，而且能保證每個學(xué)生的實驗結(jié)果都是用自己的材料完成，學(xué)生更能獲得成就感。

3.3 在實驗內(nèi)容的安排上體現(xiàn)綜合實驗設(shè)計思想 目前，大多數(shù)高校本科細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)每個專業(yè)每周開設(shè)1 次課，時長為4 學(xué)時。學(xué)生無法持續(xù)地進行實驗，因此，實驗內(nèi)容的安排盡量選擇能單獨設(shè)課同時又彼此銜接?；诖耍P者設(shè)計出2 個有機聯(lián)系且逐步遞進的實驗階段,讓學(xué)生能從細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞骨架微絲標(biāo)記及觀察入手,逐步了解細(xì)胞骨架微絲在生長過程中的形態(tài)表現(xiàn)。第1 階段進行的是4 學(xué)時的動物細(xì)胞培養(yǎng)實驗內(nèi)容，實驗教學(xué)時教師將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞提供給學(xué)生，按每班2 人一組提供3.5 cm 培養(yǎng)皿作為母瓶細(xì)胞。該階段的教學(xué)重點在于無菌操作技術(shù)、細(xì)胞計數(shù)和死活細(xì)胞的鑒定。學(xué)生需在細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)每2 人一組進行無菌操作,并按照教師要求的濃度進行細(xì)胞計數(shù)，每位學(xué)生都要將細(xì)胞接種在6 cm 的培養(yǎng)皿中，無菌的蓋玻片也是學(xué)生在接種細(xì)胞過程中自己置于培養(yǎng)皿中作為爬片細(xì)胞。這樣既能保證在下一周第2 階段4 學(xué)時實驗課細(xì)胞的密度，同時，學(xué)生又能用自己培養(yǎng)的細(xì)胞爬片做細(xì)胞骨架微絲標(biāo)記實驗。第2 階段的實驗內(nèi)容是對培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞骨架微絲進行標(biāo)記后，在普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下進行觀察，該階段教學(xué)的重點和難點在于熒光標(biāo)記和利用熒光顯微鏡的使用。2 個部分的教學(xué)實驗涵蓋了細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞計數(shù)、熒光標(biāo)記和熒光顯微鏡檢測技術(shù)等內(nèi)容。這種實驗內(nèi)容有機編排和設(shè)計增強了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和對科學(xué)實驗系統(tǒng)性和嚴(yán)謹(jǐn)性的認(rèn)識，又能使學(xué)生體會到實驗具有高度的連貫性和整體性，極大地提高了學(xué)習(xí)興趣和積極性。

3.4 科學(xué)前沿性和綜合研究性 該實驗項目涉及熒光顯微鏡技術(shù)和藥物對培養(yǎng)細(xì)胞的影響。熒光顯微鏡不僅是生命學(xué)科不可缺少的研究工具，也是多學(xué)科發(fā)展的綜合成果，所涉及的物理學(xué)和電子學(xué)理論知識深奧繁瑣。因此，顯微技術(shù)實驗教學(xué)的內(nèi)容設(shè)計應(yīng)盡量讓學(xué)生在有限的課堂時間里形象、直觀地學(xué)習(xí)和掌握這門技術(shù)。筆者在實驗教學(xué)中調(diào)整并增加了需要使用熒光顯微鏡的內(nèi)容，學(xué)生2 人一組選擇實驗內(nèi)容進行制片與觀察,這樣極大提高了使用熒光顯微鏡的機會。本實驗教學(xué)選用FITC 和Cy3 2 種最常用的熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，F(xiàn)ITC 和Cy3 在相應(yīng)的激發(fā)光下分別發(fā)出綠色和紅色熒光；同時也用DAPI 標(biāo)記了細(xì)胞核，DAPI 在紫外激發(fā)光下發(fā)出藍色熒光（圖3）。這樣的實驗設(shè)計讓學(xué)生熟悉熒光顯微鏡激發(fā)光與熒光波長的關(guān)系、濾光片的選擇方法。學(xué)生在觀察到色彩斑斕的細(xì)胞世界同時，也能了解熒光顯微鏡的設(shè)計原理、結(jié)構(gòu)功能及使用方法，同時避免讓學(xué)生僅停留于感性認(rèn)識階段，能讓學(xué)生體驗到科技創(chuàng)新成果的優(yōu)越性和現(xiàn)實存在，還能掌握熒光顯微鏡數(shù)字成像系統(tǒng)采集和處理分析圖像等技能，為后期實驗教學(xué)和科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

實驗所用的試劑鬼筆環(huán)肽和細(xì)胞松弛素B 是研究微絲骨架最常用的藥物。鬼筆環(huán)肽是一種從有毒菌中提取的真菌毒素［6］。鬼筆環(huán)肽可特異性與絲狀肌動蛋白結(jié)合，用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色技術(shù)是近年來研究固定細(xì)胞微絲骨架的傳統(tǒng)技術(shù)手段，應(yīng)用這些技術(shù)已使得科學(xué)家在微絲骨架的研究方面取得了很大進展［8-9］。細(xì)胞松弛素B 作為第1 個用于研究細(xì)胞骨架的藥物，主要作用是促進肌動蛋白絲的解聚及抑制單體肌動蛋白聚集［10-11］。細(xì)胞松弛素為真菌的代謝產(chǎn)物,可與微絲正端結(jié)合,抑制其聚合,導(dǎo)致微絲解聚,并能抑制各種依賴于微絲的運動,具有抗腫瘤的潛能［3］。在本實驗項目中用細(xì)胞松弛素B 處理HepG2 細(xì)胞，微絲解聚后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)是否皺縮；再用緩沖液洗脫細(xì)胞松弛素B 后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)是否恢復(fù)，如實驗結(jié)果中圖4所示。學(xué)生完成整個實驗過程也是對教材細(xì)胞骨架運動形態(tài)的模型“人工再現(xiàn)”，并且對微絲構(gòu)成細(xì)胞支架、維持細(xì)胞形態(tài)的功能理解得更加深刻。通過這樣設(shè)計的實驗教學(xué)改革，讓學(xué)生了解和掌握高新技術(shù)，在一定程度上增強其對科學(xué)研究和創(chuàng)新的信心。同時提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和積極性，加深了對細(xì)胞生物學(xué)進展相關(guān)內(nèi)容的理解和掌握，培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)造性思維能力，發(fā)揮主觀能動性，提高學(xué)習(xí)效率。