利用POE策略進行基于真實科研情境的PCR實驗教學*

付 鑫 （北京市十一學校 北京 100039）

POE教學模式是20世紀90年代初由White R.T.與Gunstone R.F.基于概念轉(zhuǎn)變理論和人本建構(gòu)主義理論提出的課程組織形式。該教學模式將課程分為預測（predict）、觀察（observe）和解釋（explain）3 個階段，往往借助實驗為教學內(nèi)容背景，引導學生根據(jù)前科學概念預測實驗結(jié)果、觀察真實實驗現(xiàn)象、利用學科知識解釋實驗現(xiàn)象，實現(xiàn)錯誤概念的轉(zhuǎn)化，建立科學的生物學概念［1］。通過對課程內(nèi)容進行合理的POE 教學設計，同時滲透生物學科學研究的思想方法，培養(yǎng)學生的實驗探究能力，充分尊重了學生的認識發(fā)展規(guī)律［2］。

在分子水平的生物學研究中，PCR（聚合酶鏈式反應）是最常用的技術之一。新課標的“教學提示”明確提出了“利用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增DNA 片段并完成電泳鑒定”的要求。在基因工程等微觀領域的生物學研究與實踐中，PCR 實現(xiàn)了擴增目的基因及更為廣泛的應用。選取載脂蛋白E（ApoE）和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）2 個代謝相關蛋白基因的功能研究為背景，融入基因敲除技術，帶領學生通過預測、觀察和解釋等環(huán)節(jié)，通過PCR實驗對敲除小鼠的基因型進行檢測，實現(xiàn)遺傳學、基因工程等高中生物學概念的綜合運用。在實驗中，學生有機會像科學家一樣明確研究問題、設計實驗方案、分析實驗結(jié)果，實現(xiàn)2017年修訂版生物學課程標準提出的“教學過程重實踐”的課程理念。

1 建立研究情境

教師以學案的方式展示研究情境，帶領學生通過小組討論的方式分析基因敲除的原理和小鼠遺傳雜交的后代基因型，確定本節(jié)課實驗的主題——用PCR 鑒定敲除小鼠雜交后代的基因型。

載脂蛋白E 能幫助膽固醇在血液中轉(zhuǎn)運，該基因表達異常會造成小鼠血漿中總膽固醇和甘油三酯濃度異常升高，造成高血脂。通過基因定位，研究人員確定該基因位于小鼠7 號染色體上［3］。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白基因位于小鼠8 號染色體上，該基因在軟骨細胞中表達量較高，表達異常會導致軟骨發(fā)育不全，常用于骨代謝研究［4］。

1.1 獲得單基因敲除嵌合體小鼠 哺乳動物的基因敲除經(jīng)常利用同源重組原理實現(xiàn)［5］（圖1）。根據(jù)待敲除基因的序列設計1 段含有插入序列和標記基因的同源DNA 片段，將其與運載體連接構(gòu)建出重組DNA 分子，并利用顯微注射或電轉(zhuǎn)染等方法導入小鼠胚胎干細胞。由于重組DNA 分子上具有待敲除基因的同源序列，在重組酶的作用下，同源片段將會替換受體細胞中的野生型基因，從而實現(xiàn)單基因敲除。將經(jīng)過上述處理的干細胞注入野生型小鼠早期胚胎，培養(yǎng)成為小鼠個體，由于發(fā)育過程包含基因敲除的干細胞及野生型小鼠胚胎細胞2 個來源，因此，將其稱為單基因敲除“嵌合體”小鼠。

圖1 獲得基因敲除嵌合體小鼠的操作步驟［5］

1.2 獲得單基因敲除純合子小鼠 利用嵌合體小鼠與野生型小鼠進行雜交，F(xiàn)1代小鼠中將包括單基因敲除雜合子和野生型2 種類型。由于同源DNA 片段中含有的標記基因能影響小鼠毛色，因此，可通過表型對F1小鼠進行鑒定。將鑒定出的雜合子小鼠相互雜交，F(xiàn)2代小鼠中將出現(xiàn)野生型、單基因敲除雜合子和單基因敲除純合子3 種類型，由于敲除基因為隱性，預測雜合子表現(xiàn)為野生型性狀（圖2）。

圖2 由基因敲除嵌合體小鼠獲得敲除純合子小鼠的操作步驟［6］

1.3 利用PCR 的方法篩選雙基因敲除小鼠 為獲得雙基因敲除小鼠用于代謝研究，將上述ApoE、COMP單基因敲除小鼠多代雜交，獲得子代小鼠。由于單基因敲除小鼠中包含純合子、雜合子，子代小鼠可能出現(xiàn)野生型、單敲除和雙敲除等不同類型。這些小鼠很難從表型直接判斷出基因型，需要從分子水平通過比較野生型基因與帶有插入序列的同源片段的結(jié)構(gòu)差異，利用PCR 的方法鑒定出雙基因敲除純合子小鼠［6］。

2 實驗教學流程

2.1 提出問題并預測 在學生通過閱讀，了解研究情境之后，教師需要引導學生明確本實驗的核心問題：如何利用PCR 技術測定基因型？學生可通過小組討論，用繪制實驗方案流程圖的方式明確實驗思路（圖3）。

圖3 實驗方案流程圖

為達成實驗目的，學生需要解決3 個關鍵問題：①如何設計區(qū)分目的基因與敲除基因的特異性引物？②雜交后代小鼠有哪些可能的基因型？③PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果可能產(chǎn)生哪些條帶，如何通過電泳條帶推測對應小鼠的基因型？針對這些問題，教師可通過便攜電子設備播放視頻及同伴啟發(fā)等方式幫助學生梳理PCR 與電泳技術的基本原理，并引導學生重新研讀情境中的信息，幫助學生區(qū)別野生型基因與敲除基因結(jié)構(gòu)的差異，正確設計PCR 的特異性引物（圖4），并預測小鼠DNA樣本PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

圖4 PCR 的引物設計

學生的錯誤概念往往集中在對基因敲除效果的預測及小鼠雜交實驗結(jié)果的分析。第1，學生由于沒有正確理解基因敲除過程中以干細胞為敲除受體的意義，會對研究情境中“嵌合體”的概念產(chǎn)生疑問，將其等同于敲除“雜合子”；第2，學生無法意識到敲除的結(jié)果只能改變1 對等位基因中的1 個，對F1代產(chǎn)生“雜合子”而非敲除“純合子”產(chǎn)生疑問。第3，研究為獲得雙敲除小鼠，將2 種單基因敲除小鼠進行多代雜交，學生不能清晰地利用自由組合定律分析這一雙因子雜交實驗結(jié)果。這些錯誤概念都可能導致學生產(chǎn)生錯誤的預測，此時教師不必急于糾正學生的錯誤，而是引導小組學生根據(jù)各自的分析思路大膽預測，并收集所有成員的預測結(jié)果，以期在實驗過后“解釋”環(huán)節(jié)對錯誤概念的轉(zhuǎn)化。

2.2 進行實驗并觀察 教師指導學生按照如下步驟進行實驗：1）配制PCR 體系：根據(jù)表1所示，利用微量移液器按照從多到少的順序，依次在25 μL 的PCR 管中加入PCR Mixture、ddH2O、DNA模板和3 種引物，于500 r／min 離心5 min 混勻；2）進行PCR：根據(jù)表2所示設置PCR 程序，將PCR樣品至于PCR 儀中，開啟程序；3）制備電泳膠：稱取1.5 g 瓊脂糖溶于100 mL 1×TAE 電泳緩沖液中，在微波爐中加熱熔化，待凝固前加入5 μL GoldView熒光染料，混勻?qū)腚娪灸z模具，冷卻凝固；4）電泳并觀察結(jié)果：待PCR 完成，取4 μL 產(chǎn)物，加入1 μL 6×上樣緩沖液在封口膜上混合均勻，加入到凝膠孔中，每塊凝膠選擇1 條泳道加入3 μL DNA Marker，100 V 電壓下電泳20～30 min，利用紫外線凝膠成像儀進行觀察。

表1 ApoE 與COMP 基因的PCR 體系

表2 ApoE 與COMP 基因的PCR 程序

本實驗可采用快速PCR 試劑盒，教師在課前對試劑進行預處理，提前將DNA 聚合酶、含Mg2+的PCR 體系緩沖液、dNTPs 混合，形成PCR Mixture，指導學生根據(jù)說明在25 μL 的PCR 管中構(gòu)建PCR 體系。在學生動手操作之前，教師需對微量移液器的使用進行培訓，確保PCR 體系中各種試劑的含量準確。

2.3 分析結(jié)果并解釋 教師將凝膠成像儀檢測結(jié)果進行匯總，展現(xiàn)給全班學生（圖5），結(jié)果先由小組進行討論分析，確定條帶位置，若條帶明顯則分析小鼠樣本基因型及表型，條帶不明顯或位置異常則進行歸因分析（表3）。

圖5 學生實驗結(jié)果示例

表3 學生實驗結(jié)果分析

在此過程中，學生首先結(jié)合電泳成像結(jié)果，比較野生型基因與敲除基因的片段長度差異，分析電泳結(jié)果對應的小鼠基因型（圖6）。學生利用這一結(jié)果，重新對基因敲除過程和雜交實驗進行回顧和分析，在互相啟發(fā)和教師的引導下，對“預測”階段產(chǎn)生的錯誤概念進行轉(zhuǎn)化。第1，基于同源重組的基因敲除發(fā)生在干細胞中，能將干細胞中野生型等位基因中的1 個替換，形成雜合子。將雜合子干細胞導入野生型小鼠胚胎，發(fā)育形成的小鼠個體中存在2 種基因型（野生型和單基因敲除雜合子的細胞），因此稱為“嵌合體”。第2，為獲得單基因敲除純合子小鼠，研究人員將嵌合體小鼠與野生型小鼠雜交，F(xiàn)1代小鼠將會出現(xiàn)野生型和單基因敲除雜合子2 種類型，將雜合子小鼠雜交后才能獲得單基因敲除純合子。第3，根據(jù)研究情境所述，ApoE基因和COMP基因位于不同的染色體上，符合自由組合定律。利用2 種單基因敲除小鼠進行多代雜交，每對基因獨立遺傳，在子代中會出現(xiàn)野生型、單基因敲除雜合子、單基因敲除純合子3 種類型，只有敲除純合子表現(xiàn)為高血脂、軟骨病等異常性狀。利用圖6的分析結(jié)果，分別判斷來源于同一只小鼠樣本2 個基因的基因型，可篩選出雙基因敲除純合子小鼠。在形成正確的科學概念和分析思路后，學生能通過實驗結(jié)果推測小鼠樣本的基因型和表型（表3），從而解決本實驗的核心問題，達成研究目標。

圖6 電泳結(jié)果對應的基因型分析

通過對實驗結(jié)果的分析，部分學生實驗結(jié)果不佳，主要原因包括PCR 體系構(gòu)建有誤造成非特異性擴增、電泳電壓過大造成拖尾嚴重、電泳時間過短造成條帶分離不佳等。

解釋階段是對預測階段的回應，同時也是對實驗操作、觀察階段的檢驗。在預測階段產(chǎn)生錯誤概念的學生會發(fā)現(xiàn)真實的實驗結(jié)果無法與自己的預測相吻合，在小組合作與教師引導之下，他們會追根溯源，從研究情境的理解、基因敲除和PCR技術的原理、遺傳分析的方法等角度發(fā)現(xiàn)并轉(zhuǎn)化自己的錯誤概念，形成科學的實驗探究思路及相關概念。由于學生的接觸微觀實驗的機會很少，在操作過程中存在不少失誤，給實驗帶來誤差，通過對實驗結(jié)果的科學分析，對誤差進行歸因，是提升學生解決實際問題的能力、培養(yǎng)批判性思維的良好途徑。

3 教學反思

本實驗通過建立真實的科研情境，將高中生物學教材中“照方抓藥”的體驗式實驗改造成為具有實踐性和綜合性的探究性實驗。在實驗過程中，學生有機會像科學家一樣設計實驗思路、預測實驗結(jié)果、解釋實驗現(xiàn)象、進行誤差分析、形成實驗結(jié)論。一方面對高中生物學有關遺傳和生物技術相關概念進行了整合，另一方面培養(yǎng)學生運用科學思維方法認識事物、解決實際問題的科學思維和科學探究能力，落實了核心素養(yǎng)。POE 教學策略在明確研究核心問題的基礎上，充分發(fā)揮學生的主動性，以學生的預測為開端，經(jīng)過實驗、觀察、結(jié)果分析與解釋，讓學生在實踐過程中發(fā)現(xiàn)、轉(zhuǎn)化自己的錯誤概念，形成科學的知識與思維體系。由于實驗中選取的小鼠樣本未知，因此，不一定真實得到雙敲除小鼠，這也反映了科學研究的真實性，引導學生尊重實驗事實的科研精神。