關(guān)于“煙草花葉病毒的感染和重建實驗”的幾個疑惑點探析*

盛國躍 （浙江省金華市教育教學研究中心 浙江金華 321017）

煙草花葉病毒的感染和重建實驗，是證明核酸是遺傳物質(zhì)的證據(jù)鏈中關(guān)鍵的一環(huán)。學生在學習時，經(jīng)常會對該實驗中的幾個操作產(chǎn)生疑惑。其原因有2 個：其一，在經(jīng)全國中小學教材審定委員會2004年及2019年初審通過的各個版本的高中生物學教材對這一實驗的介紹都很少，例如，人教版教材只是簡單說明了實驗的結(jié)論，蘇教版教材只以“知識海洋”的方式作了簡介，浙科版教材雖然對該實驗的著墨相對較多，但也基本未提及具體的操作過程；其二，與生物學教學相關(guān)的期刊中，此方面的相關(guān)論文也極少。本文以浙科版教材為例對學生經(jīng)常產(chǎn)生的3 個疑惑點進行探析。

1 使煙草花葉病毒感染煙草的操作方法

1.1 疑惑：如何進行煙草花葉病毒感染煙草的操作

在浙科版高中生物學教材中多次提及“感染”操作，例如，“用RNA 和蛋白質(zhì)分別去感染煙草”“分別來自不同病毒株系的RNA 和蛋白質(zhì)混合后感染煙草”等［1］。但教材中并未提及“感染”的具體操作方法，在其他章節(jié)中也未出現(xiàn)可供參考的內(nèi)容，這讓許多學生對此產(chǎn)生疑惑。

1.2 探索：從原始文獻中尋找答案

疑惑的價值在于激發(fā)學生探索的欲望，并指引學生完成探索過程。文獻檢索是解決來源于科學史的疑惑的有效方法之一。為了解決這一疑惑，學生在教師的引導下進行了2 個階段的文獻檢索。第1 階段的檢索過程如下：①在中國知網(wǎng)中以“煙草花葉病毒”為關(guān)鍵詞，以中等教育（各類各科教學法、教學參考書、輔導用書）為范圍，進行檢索，共檢索到38 篇相關(guān)文獻，但這些文獻均不能解決這一疑惑；②以“煙草花葉病毒”為關(guān)鍵詞，在中國知網(wǎng)中擴大范圍進行檢索，檢索到的部分文獻中指出可通過摩擦接種的方法使煙草花葉病毒感染煙草。然而這一階段的檢索結(jié)果并未使全體學生信服，因為，部分學生認為科學研究在一定程度上依賴當時的科技水平，現(xiàn)代的操作技術(shù)在Fraenkel-Conrat H.、Williams R.C.等科學家所處的時代不一定適用。想要了解科學家在當時進行改實驗時的操作方法，就必須查閱他們關(guān)于此實驗最初發(fā)表的文獻?；诖苏归_第2 階段的檢索過程如下：①在中國知網(wǎng)、國家科技圖書文獻中心等網(wǎng)站中進行Fraenkel-Conrat H.、Williams R.C.等科學家的姓名檢索，未檢索到相關(guān)文獻。②利用聯(lián)合計算機圖書館中心 （Online Computer Library Center，OCLC） 進行科學家姓名檢索，檢索到了“Recons－titution of active tobacco mosaic virus from Its inactive protein and nucleic acid components”“Virus reconstitution：Ⅱ.Combination of protein and nucleic acid from different strains”等2 篇原始論文。這2 篇論文證實了“煙草花葉病毒的感染和重建實驗”中采用是摩擦接種的方法（注：下文中疑惑點的探索過程與該探索過程基本相同，故在下文中不再贅述）。

1.3 解析：感染操作采用常規(guī)的摩擦接種法

煙草花葉病毒有很多類型，不同類型的侵染方式不同，但它們都無特殊的吸附結(jié)構(gòu)，故只能以被動方式侵入，例如，借助昆蟲的刺吸式口器或植物天然傷口侵入。其中TMV 可通過相鄰葉片摩擦形成的輕微傷口侵入。在自然條件下被煙草花葉病毒侵染后的種子、葉片等是主要侵染源。煙株發(fā)生感染的主要時期是苗期至現(xiàn)蕾期，此時煙株抵抗煙草花葉病的能力弱，易感病。在本實驗中，使煙草花葉病毒感染煙草的常規(guī)方法是摩擦接種。具體的操作是選取生長期、長勢相同的煙草若干，在葉片表面噴灑金剛砂，用刷子蘸取病毒液輕輕摩擦，重復幾次［2］。接種后需用清水輕輕沖洗葉片葉面，以利于植株發(fā)病。由于TMV 發(fā)病最適溫度為25～27℃，當溫度高于38℃后，病毒會受到高溫的抑制，因此，實驗應在20～30℃溫室內(nèi)進行。

2 將煙草花葉病毒的RNA 與蛋白質(zhì)相互分離的操作方法

2.1 疑惑：如何人為地將煙草花葉病毒的RNA與蛋白質(zhì)相互分離

浙科版教材在“煙草花葉病毒（a、b）及其對葉子細胞的感染和病毒重建（c）”示意圖中標出，通過“降解”的方法將TMV 的RNA 與蛋白質(zhì)相互分離，但沒有寫明其降解的具體方法。受酶解法除去植物細胞的細胞壁等知識的影響，多數(shù)學生錯誤地認為在該實驗中也是用酶解法進行“降解”的。

2.2 解析：用石碳酸處理或堿性洗滌劑處理可使煙草花葉病毒的RNA 與蛋白質(zhì)相互分離

Gierer 和Schramm 在進行煙草花葉病毒的感染實驗時，采用將TMV 置于水和苯酚（石碳酸）中，而將蛋白質(zhì)和RNA 相互分離（圖1）。其基本操作是將TMV 溶液與苯酚的水溶液混合，并將此液配制成含有3%十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.3 mol／L NaAc 的溶液。在4℃下劇烈振蕩，離心后取水相，即可得到TMV 的RNA［2］。

圖1 將TMV 置于水和苯酚中震蕩［3］

Fraenkel-Conrat H.和Williams R.C.在進行煙草花葉病毒的重建實驗時，采用先將TMV 用弱堿性洗滌劑處理，然后通過分別提純的方法將TMV的RNA 和蛋白質(zhì)相互分離。其基本的操作是，在3℃條件下，將TMV 溶液置于pH 值為10～10.5 的甘氨酸緩沖液或pH 值為10.5 的碳酸氫鹽緩沖液中透析48～72 h。用冷超速離心法分離除去未降解的病毒，用硫酸銨將上清液調(diào)至pH 值為0.4 的飽和液并再次離心。離心后TMV 的蛋白質(zhì)主要存在于沉淀中，而RNA 主要存在于上清液中。對蛋白質(zhì)部分進行重新溶解，經(jīng)在低硫酸銨濃度下沉淀、透析等操作后可獲得純度高、重組效果好的TMV 的蛋白質(zhì)［4-5］。

從經(jīng)堿降解的TMV 中提取的核酸組分，其重組效果不如用洗滌劑法提取的核酸組分。洗滌劑法提取核酸的基本操作是，將含有1% SDS 的病毒溶液的pH 值調(diào)整為8.5，并在40℃下保持16～20 h。用硫酸銨使蛋白質(zhì)沉淀后，取上清液。將上清液冷藏、離心，并用冷乙醇和pH 值為5 的乙酸鹽進一步純化?？色@得重建效果好的TMV 的RNA。

3 將提純后的RNA 和蛋白質(zhì)體外重建的操作方法

3.1 疑惑：如何實現(xiàn)煙草花葉病毒的體外重建

在浙科版教材中，關(guān)于煙草花葉病毒重建操作的相關(guān)表述只有一句：“來自不同病毒株系的RNA和蛋白質(zhì)混合后感染煙草”［1］。至于RNA 和蛋白質(zhì)應該在什么樣的環(huán)境中進行混合，混合后又應置于什么樣的環(huán)境中等問題都沒有說明。這就容易導致學生簡單的認為只要病毒的核酸和蛋白質(zhì)在細胞外相遇即可自發(fā)重建，不需要特殊處理。

3.2 解析：體外重建效果受pH 值和離子強度等因素的影響

TMV結(jié)構(gòu)簡單，是一種典型的棒狀植物病毒，約由2 130 個相同的蛋白亞基沿著單鏈RNA 螺旋狀而成，有較強的自組裝特性。體外重建的效果受pH值和離子強度等因素的影響。Fraenkel-Conrat H.和Williams R.C.在進行重建活性病毒時的基本操作是，將1%蛋白質(zhì)溶液與0.1%核酸溶液按一定比例混合，并添加適當?shù)木彌_液，使樣品呈現(xiàn)乳白色。pH 值為6 的醋酸鹽作為緩沖劑的效果最好，但磷酸鹽（pH 值為6.3 或7.0）和乙酸銨（pH 值為6）也可使用。將樣品置于3℃環(huán)境下保存24 h 后，進行超速離心，除去不可溶物質(zhì)，獲得乳白色上清液。即可從乳白色上清液中獲得有活性的重組病毒［4-5］。用電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在重建過程中最初形成的是圓盤狀，帶有中心孔的蛋白質(zhì)聚集體（圖2），最終形成的重組煙草花葉病毒的形態(tài)與正常TMV 相同，但短片段比例較大（圖3）。

圖2 重組過程中初始形成的蛋白質(zhì)聚集體（120 000×）［4］

圖3 重組煙草花葉病毒顆粒（60 000×）［4］

4 小結(jié)

受限于課程的性質(zhì)、文本的篇幅等因素，高中生物學教材不可能對各種生物學知識都加以詳盡的介紹。學生在學習過程中也難免會出現(xiàn)一些困惑，教師應積極引導學生解決困惑。查閱科學家最初發(fā)表的相關(guān)研究論文是解決困惑的有效方法之一，在幫助學生解決困惑的同時，幫助學生理解“科學知識可能隨著研究的深入而改變”“科學受到社會和文化的影響”等科學本質(zhì)。獲得原始文獻的途徑主要有：館際文獻資源共享庫，例如，華東地區(qū)西文生物醫(yī)學期刊聯(lián)目數(shù)據(jù)庫、聯(lián)合計算機圖書館中心；中外文期刊數(shù)據(jù)庫，例如，中國知網(wǎng)；國內(nèi)、外著名圖書情報機構(gòu)、文獻服務部門，例如，美國衣阿華大學醫(yī)學圖書館檢索系統(tǒng)（handin MD），http://www.lib.uiowa.edu/hardin-www hslibs.html 提供美國各州、加拿大及部分英國、德國醫(yī)學院校和醫(yī)院圖書館網(wǎng)址和免費醫(yī)學雜志網(wǎng)址，均可方便地查詢所需信息；協(xié)會組織和出版機構(gòu)的站點，例如，亞洲橋醫(yī)學信息快遞站。