CRISPR/Cas9在自身免疫性疾病中的應(yīng)用

陳振宇

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

免疫反應(yīng)被抗原激活后，在消滅抗原的同時(shí)，甚至當(dāng)抗原已被清除后，激活的淋巴細(xì)胞凋亡延遲，且將自身組織當(dāng)作靶抗原予以殺傷，產(chǎn)生自身免疫性疾病。自身免疫性疾病臨床表現(xiàn)多樣，發(fā)病機(jī)理未明，尚缺乏理想治療方法。臨床治療方案除控制發(fā)病誘因外，主要采用抑制或阻斷體內(nèi)病理性自身免疫應(yīng)答方法，如激素類藥物、抗風(fēng)濕藥物、免疫抑制劑等，但這些藥物無(wú)法徹底根治。隨著以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)的崛起，許多疾病有望通過(guò)基因治療讓患者獲得痊愈，而且近年來(lái)與自身免疫相關(guān)的基因，細(xì)胞因子和信號(hào)通路相繼被發(fā)現(xiàn)，這為治療自身免疫性疾病提供了很多新的思路。

1 CRISPR/CAS9系統(tǒng)簡(jiǎn)述

1.1 CRISPR/CAS9的發(fā)現(xiàn)

早期，研究者們認(rèn)為像細(xì)菌和古細(xì)菌這樣的單細(xì)胞生物只有簡(jiǎn)單的免疫防御機(jī)制，而缺乏“記住”病原體的能力。然而，Ishino等[1]發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌的堿性磷酸酶基因編碼區(qū)下游存在一段由長(zhǎng)度為29 bp的重復(fù)片段和32～33 bp的非重復(fù)片段間隔相連的重復(fù)序列，之后的研究發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)結(jié)構(gòu)在細(xì)菌和古細(xì)菌中普遍存在[2]。21世紀(jì)初，該結(jié)構(gòu)被正式定義為Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats(CRISPR)。CRISPR/Cas系統(tǒng)類似于真核生物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能夠“記住”之前攻擊過(guò)細(xì)菌的病原體，并在病原體再次攻擊宿主時(shí)迅速建立有效的反應(yīng)，清除病原體[3]。在CRISPR/Cas發(fā)現(xiàn)后不久，科學(xué)家開(kāi)始使用各種CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性基因改造，并最終用于基因治療，如今，CRISPR/Cas被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)針對(duì)疾病（如癌癥、單基因疾病和自身免疫性疾病）分子療法最有前途的工具之一[4]。

1.2 CRISPR/CAS9的結(jié)構(gòu)

作為一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，CRISPR/Cas系統(tǒng)的存在使得原核生物可以“記住”那些來(lái)自病毒或者噬菌體的外源DNA，然后阻止這些DNA在原核生物體內(nèi)的復(fù)制[5]，從而防止原核生物再次受到相同外源DNA的攻擊，類似于真核生物中的RNAi系統(tǒng)[6]。2007年，在嗜熱鏈球菌中首次發(fā)現(xiàn)CRISPR作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的證據(jù)，該項(xiàng)研究表明，CRISPR間隔區(qū)的序列與特定噬菌體基因組序列之間的序列同源性是CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮作用的前提[7]。此外，又證明了新的間隔重復(fù)單位是在被噬菌體攻擊之后獲得的，并且cas基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是CRISPR系統(tǒng)功能不可缺失的一部分。

一個(gè)典型的CRISPR/Cas基因序列由三個(gè)部分組成。分別是CRISPR序列，間隔重復(fù)序列以及cas基因序列。CRISPR序列在不同原核生物基因組中的數(shù)量可能有所不同，但每個(gè)CRISPR位點(diǎn)之前都含有一個(gè)富含AT的不保守的前導(dǎo)序列[8]，長(zhǎng)度從幾個(gè)堿基對(duì)到一百個(gè)堿基對(duì)不等。該序列對(duì)于CRISPR的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，缺乏前導(dǎo)序列的CRISPR片段沒(méi)有顯示出能夠獲得新的間隔重復(fù)單位的能力[9]。

CRISPR 序列的第二部分是由間隔重復(fù)序列組成，每個(gè)單位都有一個(gè)間隔重復(fù)序列，在不同的物種、菌株，甚至在同一基因組的不同位點(diǎn)之間都有所不同，其后緊連著一個(gè)與病毒基因組中原間隔序列相同的間隔序列。每個(gè)序列重復(fù)間隔單元的數(shù)量從幾個(gè)到幾百個(gè)不等，目前已知的最高數(shù)量的重復(fù)間隔單元是氯氟烴屬植物基因組中的374個(gè)[10]。

cas 基因構(gòu)成了CRISPR基因序列的第三部分。這些基因通常位于重復(fù)序列之后，并增加了CRISPR系統(tǒng)的可變性，因?yàn)槊總€(gè)基因集群都有不同的cas基因集。迄今為止，已鑒定出40多個(gè)cas基因家族，其中六個(gè)cas基因家族存在于幾乎所有具有CRISPR序列（Cas1至Cas6）的物種中，因此被稱為“核心”cas基因。

1.3 CRISPR/Cas9的作用機(jī)制

CRISPR 功能分為三個(gè)階段：適應(yīng)、CRISPR RNA的形成和干擾。在第一階段，當(dāng)外源DNA入侵細(xì)菌時(shí)，其CRISPR系統(tǒng)會(huì)特異性地捕獲一段被稱為proto-spacers的外源DNA序列插入到前導(dǎo)序列與間隔重復(fù)序列之間，并進(jìn)行一次重復(fù)片段的復(fù)制，形成一段新的重復(fù)單元，這些重復(fù)單元就是細(xì)菌特異性免疫的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。值得注意的是，外源DNA的捕獲并不是完全隨機(jī)的，在這些被捕獲的DNA序列下游通常有一段序列保守的特殊結(jié)構(gòu)，被稱為PAM位點(diǎn)[11]。PAM位點(diǎn)的存在可能是CRISPR系統(tǒng)區(qū)分自身DNA與外源DNA而避免發(fā)生自身免疫的機(jī)制之一[12]，同時(shí)也是基因編輯時(shí)靶序列選擇的重要需求[13]。在第二階段，形成的重復(fù)單元會(huì)被轉(zhuǎn)錄形成前體CRISPRRNA(Pre-crRNA)，在RNAseⅢ的作用下成熟。成熟的crRNA與tracrRNA通過(guò)堿基配對(duì)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，Cas9蛋白結(jié)合形成靶向切割復(fù)合體對(duì)外源DNA進(jìn)行特異切割，達(dá)到識(shí)別和降解外源DNA的目的。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在自身免疫性疾病中的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas9用于篩選自身免疫性疾病調(diào)控基因

CPISPR/Cas9 有望用于治療單基因疾病和大多數(shù)自身炎癥性疾病。自身免疫性疾病的遺傳背景復(fù)雜，多基因多通路參與發(fā)病機(jī)制，且易受外部環(huán)境的影響，CRISPR/Cas技術(shù)誘導(dǎo)基因失活已經(jīng)在多個(gè)研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。

有研究表明Treg細(xì)胞的不穩(wěn)定則會(huì)促進(jìn)自身免疫或更多更有效的抗腫瘤免疫，其主要特征表現(xiàn)為主要轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的缺失及促炎性特性的獲得。在一項(xiàng)研究中，研究人員開(kāi)發(fā)出了一種用于初級(jí)小鼠Treg細(xì)胞表型研究的基于CRISPR的聯(lián)合篩選平臺(tái)，同時(shí)研究人員利用該技術(shù)對(duì)大約500個(gè)核內(nèi)因子進(jìn)行了靶向功能缺失的篩選分析，從而識(shí)別出能促進(jìn)或干擾Foxp3表達(dá)的基因調(diào)節(jié)程序[14]。此外，有研究團(tuán)隊(duì)使用CRISPR全基因組篩選技術(shù)，在T1D（1型糖尿?。┬∈竽Ｐ椭欣米陨砻庖叩倪x擇性壓力在自身免疫性糖尿病中進(jìn)行無(wú)偏倚的全基因組搜索，以尋找胰島β細(xì)胞存活的修飾因子[15]。

許多遺傳變異與自身耐受性的喪失及自身免疫的發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在一些自身免疫性疾病患者的樣本中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種遺傳變異，其中約90%存在于非編碼區(qū)和免疫增強(qiáng)子[16]。具有順式調(diào)節(jié)和表觀遺傳特征的非編碼區(qū)的遺傳調(diào)控受損是自身免疫性疾病的主要基礎(chǔ)，證明這些變異是否是免疫功能的假定控制因子的一個(gè)潛在方法是使用CRISPR進(jìn)行序列微干擾，該方法已被用于識(shí)別功能性非編碼區(qū)[17]。這些區(qū)域中的一些序列作為增強(qiáng)子，可能對(duì)免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要，對(duì)特定的細(xì)胞外環(huán)境或刺激做出反應(yīng)。基于CRISPR的實(shí)驗(yàn)也能用于識(shí)別這些重要的自身免疫風(fēng)險(xiǎn)基因座的調(diào)控序列，如CD69和IL2RA，后者與克羅恩病有關(guān)[18,19]。此外，CRISPR篩選也被用于PD-1和PD-L1的假定調(diào)節(jié)因子的研究[20]。

2.2 CRISPR/Cas9用于構(gòu)建自身免疫性疾病模型

CRISPR 亦被運(yùn)用于某些疾病模型的構(gòu)建。例如，一組研究人員創(chuàng)建了家族性噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥2（FHL2）模型，以測(cè)試在無(wú)法進(jìn)行骨髓移植時(shí)，與間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)作為替代療法的效果[21]。利用CRISPR對(duì)自身免疫調(diào)節(jié)因子基因（AIRE）也進(jìn)行了研究，揭示了AIRE的干擾導(dǎo)致自身免疫的機(jī)制之一是通過(guò)破壞胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞（mTECs）與胸腺細(xì)胞之間的粘附[22]。

在另一項(xiàng)研究中[23]，研究人員運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)制備了Trex1D18N/D18N點(diǎn)突變小鼠，該小鼠展現(xiàn)出了許多人類自身免疫的癥狀，包括生存時(shí)間顯著下降，心臟、腎臟的多個(gè)器官受損，自身抗體增加等。利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立的這些自身免疫性疾病模型對(duì)后續(xù)的藥物開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要意義。

2.3 CRISPR/Cas9用于自身免疫性疾病治療

有一些免疫系統(tǒng)的疾病是由單基因紊亂引起的，例如周期性發(fā)熱綜合征、原發(fā)性免疫缺陷和某些自身免疫性疾病等可以用CRISPR來(lái)進(jìn)行治療，這些疾病中的大多數(shù)都是由于生殖系中的基因變異引起的，使得造血干細(xì)胞能夠產(chǎn)生基因變異的祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞。因此，異基因干細(xì)胞移植通常是嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）[24]或慢性肉芽腫性疾病的治療方法，然而，時(shí)常發(fā)生移植物抗宿主的情況，可能會(huì)對(duì)預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響。通過(guò)使用CRISPR，可以在患者自身的造血干細(xì)胞中進(jìn)行基因修飾，插入正常的基因拷貝，然后產(chǎn)生自體移植的細(xì)胞庫(kù)，可以在沒(méi)有移植物抗宿主風(fēng)險(xiǎn)的情況下重建免疫系統(tǒng)的功能[25]。

類似的方法也被用于鐮狀細(xì)胞病。在一項(xiàng)研究中，來(lái)自HBB基因有純合錯(cuò)義突變的SCD患者的iPSCs通過(guò)CRISPR與含有野生型HBB等位基因的DNA模板進(jìn)行同源重組修飾，使得常規(guī)的β珠蛋白可以正常表達(dá)[26]。

在分化的免疫細(xì)胞也可以通過(guò)CRISPR進(jìn)行突變糾正。IL2RA的隱性突變導(dǎo)致一個(gè)有自身免疫性疾病家族史的患者FOXP3 Tregs中IL2受體α鏈處于低水平狀態(tài)，一項(xiàng)研究在利用CRISPR進(jìn)行靶向修飾后，患者的T細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)正常水平的IL2RA[27]。

CRISPR 修飾的Tregs過(guò)繼細(xì)胞療法也是治療自身免疫性疾病的方法之一。在模式動(dòng)物中，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通過(guò)進(jìn)行的Treg移植，顯示出改善的跡象；然而，在人類RA患者中嘗試這種方法之前，維持Treg的分化是一個(gè)重要的問(wèn)題。CRISPR/Cas系統(tǒng)也被用于修飾可能影響FOXP3表達(dá)的基因，使得Treg的表型占優(yōu)勢(shì)，并促進(jìn)了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎過(guò)繼Treg治療的效果[28]。

另外一項(xiàng)最新的成果中，研究人員運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)A20進(jìn)行了研究[29]，結(jié)果表明A20去泛素化酶（DUB）結(jié)構(gòu)域的遺傳變異增加了系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)。A20由基因TNFAIP3進(jìn)行編碼，是NF-κB的負(fù)調(diào)節(jié)劑，DUB結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)結(jié)構(gòu)變化來(lái)降低或增加NF-κB活性[30-32]，因此可以對(duì)NF-κB誘導(dǎo)的促炎和存活基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，但是有其他報(bào)道表明A20的DUB活性對(duì)其NF-κB抑制功能并不是必要的[33]。因此，由A20 DUB結(jié)構(gòu)域的遺傳破壞引起的自身免疫風(fēng)險(xiǎn)增加可能是由NF-κB途徑以外的其他機(jī)制引起的。

利用CRISPR/Cas對(duì)表觀遺傳進(jìn)行調(diào)控也被用于治療自身免疫性疾病。Jing等人通過(guò)CRISPR/Cas序列干擾開(kāi)發(fā)了一種具有miR-155表達(dá)沉默的巨噬細(xì)胞細(xì)胞系，在該細(xì)胞系中，促炎細(xì)胞因子的表達(dá)顯著降低，這種方法可能是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種途徑[34]。生物藥物的常規(guī)抗細(xì)胞因子治療通常由于在非靶組織中的抑制而具有副作用。然而，使用CRISPR/Cas9，Brunger等人實(shí)現(xiàn)了生物藥物的閉環(huán)生產(chǎn)。研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)將IL1R拮抗劑和STNFR 1-鼠IgG的基因插入鼠iPSC CCL2基因的位點(diǎn)。在炎癥過(guò)程中，CCL2表達(dá)對(duì)白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子-α的反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞暴露于炎癥信號(hào)時(shí)，細(xì)胞因子拮抗劑的表達(dá)減輕了白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子α的體外病理生理效應(yīng)[35]。

3 總結(jié)與展望

2020 年10月，瑞典皇家科學(xué)院宣布，將2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna，以表彰她們?cè)凇皯{借開(kāi)發(fā)基因組編輯方法”方面作出的貢獻(xiàn)，意味著此項(xiàng)技術(shù)迎來(lái)了一個(gè)嶄新的時(shí)代，它將會(huì)逐漸地滲入人類的日常生活和醫(yī)療健康，如可以用于提高部分農(nóng)產(chǎn)品的抗病性和產(chǎn)量，不需要再利用雜交選種的方式。它為疾病建模、基因篩選以及基因沉默、插入、干細(xì)胞修飾和表觀遺傳修飾等領(lǐng)域提供了一種簡(jiǎn)單且廉價(jià)的方法，讓科學(xué)家們?cè)诟髯缘念I(lǐng)域有了新的方向和突破。雖然這項(xiàng)技術(shù)為科學(xué)研究提供了諸多便利，由于自身免疫性疾病多與遺傳相關(guān)，且多基因多通路參與發(fā)病機(jī)制，CRISPR可能是通過(guò)使用針對(duì)自身免疫性疾病患者的個(gè)性化藥物來(lái)實(shí)現(xiàn)疾病治愈的有力治療手段之一，但需要注意的是單基因的敲除是否會(huì)影響機(jī)體其他功能的缺失或者導(dǎo)致其他疾病，所以對(duì)于CRISPR/Cas9在自身免疫性疾病中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步深入研究，以利用此項(xiàng)技術(shù)的最大潛力來(lái)開(kāi)發(fā)針對(duì)特定疾病的個(gè)性化治療方法。