鏈霉菌DDE轉(zhuǎn)座酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

蘇愛珍，薛永常

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034）

鏈霉菌（Streptomyces）屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，是自然界中數(shù)量最多、最普遍的放線菌之一[1]，具有復(fù)雜的生活周期和次生代謝途徑，產(chǎn)生大量具有重要價(jià)值 的天然代謝物，是研究微生物形態(tài)分化和化學(xué)多樣性的良好研究材料[2,3]。鏈霉菌代謝產(chǎn)物獨(dú)特的化學(xué)支架和巨大的代謝潛力使其成為生物勘探研究中最有前途的候選材料[4]。而插入序列是細(xì)菌中一種普遍存在的轉(zhuǎn)座元件，結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，兩側(cè)有兩個(gè)反向重復(fù)序列，發(fā)生轉(zhuǎn)座需轉(zhuǎn)座酶基因編碼的轉(zhuǎn)座酶參與[5,6]。它是細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的可自我移動(dòng)的DNA，形式簡(jiǎn)單，僅包含其自身轉(zhuǎn)座所需的基因[7-9]。在細(xì)菌中，插入序列可根據(jù)其催化區(qū)域的折疊和關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)相似性分為DDE轉(zhuǎn)座酶、DEDD轉(zhuǎn)座酶、HUH轉(zhuǎn)座酶和絲氨酸轉(zhuǎn)座酶[10]。

自1950年由McClintock[11]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子以來，隨后在細(xì)菌、真菌及動(dòng)植物中也被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，且被廣泛研究。近年來，在原核轉(zhuǎn)座子，如Tn5、Tn10、噬菌體MuA[12,13]，真核轉(zhuǎn)座子家族，如hAT[14]、Tc1/Mariner[15]中的DDE轉(zhuǎn)座酶已被廣泛研究，DDE轉(zhuǎn)座酶是由天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）三個(gè)保守的氨基酸三聯(lián)體組成，顯示了較好的應(yīng)用前景。Halomonassp.中的ZM3轉(zhuǎn)座酶可以使細(xì)菌適應(yīng)惡劣環(huán)境條件的遺傳信息[16]。Streptococcus agalactiae中DDE轉(zhuǎn)座酶可通過改變整合位點(diǎn)上相鄰基因的表達(dá)或促進(jìn)基因組重排來改變其行為，能動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)毒力基因，提高了它的適應(yīng)能力[17]。TN轉(zhuǎn)座子家族可以使用DDE轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行復(fù)制轉(zhuǎn)座，以產(chǎn)生共整合結(jié)構(gòu)，在穩(wěn)定相關(guān)轉(zhuǎn)座子方面發(fā)揮作用[18]。Philippe等[19]通過計(jì)算機(jī)輔助比對(duì)和定點(diǎn)突變技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并證明了在DDE轉(zhuǎn)座酶上有一個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）潛在的DNA結(jié)合域與催化結(jié)構(gòu)域，可以使DDE轉(zhuǎn)座酶蛋白形成聚合體，負(fù)責(zé)DNA結(jié)合的序列特異性，在調(diào)控基因表達(dá)中起著重要的作用。本文從X1鏈霉菌中克隆出DDE轉(zhuǎn)座酶基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析研究，以期為研究該轉(zhuǎn)座酶的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本文鏈霉菌是由實(shí)驗(yàn)室保藏菌株[20]，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21，pET-32a(+)質(zhì)粒均為實(shí)驗(yàn)室保存，pMD19-T載體購(gòu)自大連寶生物有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/L），高氏一號(hào)培養(yǎng)基（g/L），生理生化培養(yǎng)基配置方法見《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[21]。

1.1.3 酶與試劑

柱式DNA膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，DNAMarker、FastPure質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，QuickCutTMEcoRI（15 U/μL）、QuickCutTMHind III（15 U/μL）均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，Taq DNA polymerase（5 U/μL）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海洋放線菌的生理生化鑒定

形態(tài)觀察：采用平皿插片法，用美藍(lán)染液染色后油鏡下觀察菌株的形態(tài)特征。碳源的利用、硫化氫產(chǎn)生等生理生化試驗(yàn)參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[21]。

1.2.2 放線菌16S rDNA鑒定[22]

將培養(yǎng)3～4 d的鏈霉菌用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以其為模板，采用16S rDNA通用引物（27F，1492R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將得到的序列用柱式DNA膠回收試劑盒回收后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序后的序列用SeqMan進(jìn)行序列拼接后，利用EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，初步得到該菌種種屬，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹，得到親緣關(guān)系最近的菌種。

1.2.3DDE轉(zhuǎn)座酶基因擴(kuò)增及蛋白表達(dá)

參考GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)布DDE轉(zhuǎn)座酶基因序列（登錄號(hào)：CP047144.1），設(shè)計(jì)上下游引物，并在5′端增加Hind III和EcoR I的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基：

將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行回收后，與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒，將其送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

用HindIII和EcoR I雙酶切陽(yáng)性重組質(zhì)粒及pET32a(+)質(zhì)粒，回收目的片段及pET32a(+)酶切大片段，連接并轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行16 ℃誘導(dǎo)16～20 h后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.4DDE轉(zhuǎn)座酶基因的生物信息學(xué)分析

通過Blast和ISfinder數(shù)據(jù)庫(kù)確定該擴(kuò)增序列為DDE轉(zhuǎn)座酶基因片段；通過NCBI的ORF finder及ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因的ORF及氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過蛋白性質(zhì)預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)其擬翻譯的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)與分析；通過CBS Prediction Servers數(shù)據(jù)庫(kù)提供的SignalP、TMHMM、DictyOGlyc、NetPhos等在線網(wǎng)站對(duì)其信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域、糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析；通過Sopma.html網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過phyre2軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈霉菌的形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)鑒定

將篩選菌株X1涂布在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)基表面呈灰褐色，菌落生長(zhǎng)豐滿，表面不光滑，呈饅頭形，基內(nèi)菌絲體的顏色為白色，且無可溶性色素產(chǎn)生。油鏡（10×100）下觀察可以看到菌株基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)茂盛，呈直線不斷裂，分枝多；孢子絲叢生、彎曲，孢子球形或橢球形，表面光滑，形成孢子鏈（圖1）。

圖1 油鏡(10×100)下X1的形態(tài)Fig.1 Morphology of X1 under oil immersion lens (10×100)

不同的鏈霉菌能利用不同的糖，對(duì)X1進(jìn)行不同碳源的利用實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，X1可以利用葡萄糖、果糖、木糖、菊糖、甘露醇、麥芽糖、淀粉等糖，但不能利用蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、殼聚糖和檸檬酸。NaCl濃度低于10%時(shí)，菌體正常生長(zhǎng)；NaCl濃度在10%～12.5%之間，菌體生長(zhǎng)緩慢；NaCl濃度大于12.5%時(shí)，菌體受到抑制，不生長(zhǎng)，由此看出，該菌對(duì)鹽度的耐受性較強(qiáng)。其他生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株X1可明膠液化；葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中將紫色培養(yǎng)基變黃，說明菌株可以利用葡萄糖，但是在乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基上沒有顏色變化，則該菌不能利用乳糖；淀粉水解培養(yǎng)基上滴加盧戈氏碘液后有透明圈出現(xiàn)，說明可以水解淀粉；牛奶胨化實(shí)驗(yàn)中，X1能將牛奶先凝固后胨化；黑色素產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，可發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面產(chǎn)生黑色物質(zhì)，證明該菌可產(chǎn)生黑色素；但不產(chǎn)生硫化氫、不能將硝酸鹽還原、不能將酪蛋白分解，也不能將纖維素進(jìn)行水解。綜合X1形態(tài)特征和生理生化特征，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[22]和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[23]，初步判斷X1為鏈霉菌屬灰褐類群。

2.2 16S rDNA 擴(kuò)增及進(jìn)化樹的建立

以提取菌株的基因組DNA為模板，用16S rDNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到單一且清晰的條帶，該目的條帶回收后測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株X1與Streptomyces griseoincarnatus（AJ781321，99.93%）、Streptomyces labedae（AB184704，99.93%）以及Streptomyces violaceochromogenes（AB184312，98.86%）等有較高的相似性。在此基礎(chǔ)上，選取與X1同源性較高的多條已知標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），結(jié)果表明，在所選擇的13個(gè)物種序列中，X1的16S rDNA與Streptomyces labedae相似度達(dá)到98%。從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，X1與Streptomyces labedae處于同一分支，同源性較高，這與生理生化結(jié)果一致，證明X1屬于鏈霉菌屬灰褐類群，并命名為Streptomyces labedaesp. X1。

圖2 構(gòu)建16S rDNA進(jìn)化樹Fig.2 Construction of 16S rDNA evolutionary tree

2.3 DDE轉(zhuǎn)座酶基因序列分析

以X1基因組DNA為模板，特異引物D1、D2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。當(dāng)退火溫度為61 ℃時(shí)能夠擴(kuò)增出一條單一清晰條帶（圖3），膠回收后，與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證后，送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖3 目的片斷PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoretogram of target fragment

2.4 DDE轉(zhuǎn)座酶氨基酸結(jié)構(gòu)分析

測(cè)序結(jié)果表明，該擴(kuò)增片段為401 bp。利用Blast和ISfinder數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)（圖4），發(fā)現(xiàn)其與ISAzo13家族轉(zhuǎn)座酶基因有88%的相似度。

利用BlastX比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列擬編碼DDE轉(zhuǎn)座酶，該區(qū)域中還包含一個(gè)Helix-turn-helix（HTH，螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋）結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖5。

轉(zhuǎn)座酶的種類有很多，是生物體發(fā)生轉(zhuǎn)座發(fā)生反應(yīng)必不可少的作用元件，一直在被不斷的探索[24]。Harmer等[9]在研究IS6/IS26家族時(shí)發(fā)現(xiàn)，該家族中的DDE轉(zhuǎn)座酶具有三個(gè)保守的氨基酸三聯(lián)體：天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）用于協(xié)調(diào)二價(jià)金屬陽(yáng)離子，這些陽(yáng)離子在鏈斷裂和重新結(jié)合期間發(fā)生的親核攻擊中起著至關(guān)重要的作用。此外還發(fā)現(xiàn)該DDE轉(zhuǎn)座酶中有個(gè)HTH結(jié)構(gòu)域，是具有二聚作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)，可以使DDE轉(zhuǎn)座酶蛋白形成聚合體，是轉(zhuǎn)座酶可能的DNA結(jié)合區(qū)[25,26]。Zou等[27]對(duì)金魚Tgf2轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行研究時(shí)，得到了三個(gè)保守的位點(diǎn)DDE（228aa、295aa、648aa），可以影響Tgf2轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座效率；DDE轉(zhuǎn)座酶上的HTH結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)具有二聚作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)，除了起到結(jié)合DNA的作用外還起到了聚合作用，可以使Tgf2轉(zhuǎn)座酶蛋白形成聚合體。結(jié)合對(duì)現(xiàn)有DDE轉(zhuǎn)座酶的了解，對(duì)本研究的DDE轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該DDE轉(zhuǎn)座酶保守的氨基酸三聯(lián)體分別位于Asp43、Asp49、Glu91。通過圖5可以看出，該氨基酸序列中含有一個(gè)HTH結(jié)構(gòu)域，且分析結(jié)果顯示該結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)座酶可能的DNA結(jié)合區(qū)，是有效DNA轉(zhuǎn)座所必需的。

2.5 生物信息學(xué)分析

2.5.1DDE轉(zhuǎn)座酶基因的ORF預(yù)測(cè)

用NCBI的ORF finder檢測(cè)這段序列的開放閱讀框，結(jié)果表明該DDE轉(zhuǎn)座酶基因的最大的ORF從第一個(gè)堿基開始，到第378個(gè)堿基終止，即所有序列基本都為編碼區(qū)，可表達(dá)125個(gè)氨基酸。

2.5.2 DDE轉(zhuǎn)座酶的理化性質(zhì)分析

利用Protparam軟件，分析鏈霉菌DDE轉(zhuǎn)座酶的理化性質(zhì)。該蛋白的氨基酸數(shù)量是125個(gè)，理論等電點(diǎn)pI：10.01，為 堿 性 蛋 白，分 子 式 為C634H1050N192O187S3，在280 nm波長(zhǎng)下，所有半胱氨酸形成胱氨酸（cystines）時(shí)的消光系數(shù)為3105 L/(mol·cm)，對(duì)應(yīng)的吸光度為0.215；所有半胱氨酸均不形成胱氨酸時(shí)的消光系數(shù)為2980 L/(mol·cm)，對(duì)應(yīng)的吸光度為0.206；脂肪族氨基酸指數(shù)為91.74，GRAVY值為-0.283，不穩(wěn)定指數(shù)為28.97小于40，表明該基因翻譯出來的DDE轉(zhuǎn)座酶為穩(wěn)定蛋白。

2.5.3 DDE轉(zhuǎn)座酶的親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)分析

通過Protscale在線分析，預(yù)測(cè)DDE轉(zhuǎn)座酶基因編碼氨基酸序列的親/疏水性（圖6）。多肽鏈的第54位具有最大值1.944，疏水性最強(qiáng)；第25位存在最小值-2.900，為親水性氨基酸。平均疏水性通過理化性質(zhì)分析顯示為-0.8645，在整條肽鏈中，親水氨基酸數(shù)量較多，表明整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，推測(cè)該蛋白為可溶性蛋白。

圖4 DDE轉(zhuǎn)座酶基因序列比對(duì)Fig.4 Sequence alignment ofDDEtransposase gene

圖5 氨基酸結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Amino acid domain analysis

圖6 DDE轉(zhuǎn)座酶基因編碼蛋白的疏水性和親水性Fig.6 The hydrophobicity/hydrophilia ofDDEtransposase gene coding protein

跨膜區(qū)必須由強(qiáng)疏水的氨基酸組成，才能使膜蛋白穿過膜的磷脂雙分子層。通過蛋白親、疏水性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為親水性蛋白，推測(cè)不存在跨膜區(qū)[28]。進(jìn)一步利用TMHMM程序?qū)υ摰鞍卓缒^(qū)進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖7所示，表明確實(shí)不存在跨膜區(qū)，這與親水性的分析的結(jié)果是一致的。

圖7 DDE轉(zhuǎn)座酶基因編碼蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7 The transmembrane domain ofDDEtransposase gene coding protein

2.5.4 信號(hào)肽分析

圖8 DDE轉(zhuǎn)座酶基因編碼蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.8 The signal peptide ofDDEtransposase gene coding protein

信號(hào)肽是引導(dǎo)前體蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜分泌到胞外的一段序列，對(duì)其預(yù)測(cè)和分析有助于了解蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位并區(qū)分蛋白質(zhì)的功能域[29]。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果如圖8，分析發(fā)現(xiàn)該擬表達(dá)的蛋白中信號(hào)肽、TAT信號(hào)肽、脂蛋白信號(hào)肽存在的可能性分別為0.0058、0.0025和0.0026，說明該蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白。

2.5.5 糖基化與磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白的糖基化與磷酸化一樣都是最為普遍的一種蛋白質(zhì)翻譯后的修飾方式，肽鏈中的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸是蛋白質(zhì)磷酸化最容易形成的三種氨基酸[30]，利用NetPhos在線軟件對(duì)該基因編碼的蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析（圖9）。結(jié)果表明，該蛋白可以發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有14個(gè)，其中絲氨酸有四個(gè)，蘇氨酸10個(gè)，且在多肽鏈中分布不均勻。

圖9 DDE轉(zhuǎn)座酶磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)與分析Fig.9 Phosphorylation site prediction and analysis of DDE transposase amino acid

糖基化有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能作用,它是在酶的控制下，在蛋白質(zhì)上加上糖類的過程。糖基化是對(duì)蛋白的重要的修飾，有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能作用[31]。利用DictyOGlyc在線工具預(yù)測(cè)和分析DDE轉(zhuǎn)座酶基因擬表達(dá)蛋白糖基化位點(diǎn)，結(jié)果如圖10。

圖10 DDE轉(zhuǎn)座酶蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.10 The prediction protein glycosylation site of DDE transposase

從分析結(jié)果可以看出，DDE轉(zhuǎn)座酶基因擬表達(dá)蛋白上潛在的糖基化位點(diǎn)有1個(gè)，在第117位的絲氨酸上，說明該分析說明糖基化位點(diǎn)較少。

2.5.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)預(yù)測(cè)

DNA序列翻譯成氨基酸之后，可通過折疊和盤繞，形成比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，具有特有的生物活性和理化性質(zhì)[32]。因此，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析對(duì)我們了解蛋白的空間結(jié)構(gòu)有重要的意義。對(duì)其空間結(jié)構(gòu)的了解有著重要意義預(yù)測(cè)。常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件主要有結(jié)果如圖11所示，該蛋白中存在68個(gè)α-螺旋占51.52%、15個(gè)β轉(zhuǎn)角占11.36%、5個(gè)伸展占3.79%、44個(gè)無規(guī)則卷曲占33.33%。

圖11 DDE轉(zhuǎn)座酶基因編碼蛋白的折疊盤繞方式Fig.11 The folded and coiled ways of DDE transposase gene coding protein

用蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)軟件phyre2對(duì)氨基酸序列同源建模得到蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，如圖12所示。該蛋白結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，該結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，從圖中可以看出，整體的結(jié)構(gòu)是螺旋-轉(zhuǎn)-螺旋（HTH）結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)其為DDE轉(zhuǎn)座酶超家族，與已發(fā)現(xiàn)的HTH結(jié)構(gòu)域基本一致[19]，這些結(jié)構(gòu)對(duì)其生物學(xué)功能的發(fā)揮有重要作用。

圖12 DDE轉(zhuǎn)座酶基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.12 The tertiary structure of DDEtransposase gene coding protein

2.6 DDE轉(zhuǎn)座酶基因的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

選取成功構(gòu)建的pET32a(+)-DDE陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒的單克隆菌接種到低鹽培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)OD 600=0.6時(shí)，停止培養(yǎng)。加入IPTG使反應(yīng)終濃度到達(dá)0.5 mmol/L時(shí)，培養(yǎng)17 h后取樣，樣品處理后用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖13。

由圖13可知，作為對(duì)照的pET32a(+)-DDE的菌株在未加入IPTG時(shí)，沒有目的蛋白的表達(dá)；在加入IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)17 h后，在27 ku左右出現(xiàn)明顯的條帶，這與先前在線分析得到的預(yù)測(cè)的理論值相似，對(duì)以后鑒定DDE轉(zhuǎn)座酶活性以及它的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

圖13 DDE轉(zhuǎn)座酶表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.13 SDS-PAGE analysis of DDE transposase expressed product

3 結(jié)論

3.1 本研究主要從實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中篩選了一株產(chǎn)DDE轉(zhuǎn)座酶的菌株，通過形態(tài)及生理生化鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌與Streptomyces labedae有很近親緣關(guān)系，相似度高達(dá)98%，將其命名為Streptomyces labedaesp. X1。從該鏈霉菌中克隆了DDE轉(zhuǎn)座酶基因，該基因片段為401 bp，通過Blast和ISfinder數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示其與ISAzo13家族轉(zhuǎn)座酶的基因有88%的相似度。通過用ISfinder等軟件對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該DDE轉(zhuǎn)座酶的三個(gè)保守氨基酸分別位于Asp43、Asp49、Glu91，而且還存在一個(gè)HTH結(jié)構(gòu)域，分析結(jié)果顯示該結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)座酶可能的DNA結(jié)合區(qū)，是有效DNA轉(zhuǎn)座所必需的。

3.2 研究發(fā)現(xiàn)已知蛋白的新功能，對(duì)蛋白的開發(fā)利用有巨大意義。本文通過對(duì)DDE轉(zhuǎn)座酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，理化性質(zhì)結(jié)果顯示，該基因擬編碼蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為28.97小于40，所以該蛋白為穩(wěn)定蛋白，平均疏水性分析結(jié)果為-0.8645，所以是親水蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，為非分泌蛋白；有14個(gè)磷酸化位點(diǎn)且僅有一個(gè)糖基化位點(diǎn)；該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，主要為無規(guī)則卷曲和螺旋結(jié)構(gòu)，而這些結(jié)構(gòu)對(duì)其生物學(xué)功能的發(fā)揮有重要作用。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果顯示在27 ku處出現(xiàn)條帶，說明該基因可以表達(dá)成蛋白質(zhì)。這些性質(zhì)及結(jié)果分析對(duì)研究該基因及其家族的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。但是為了獲取更準(zhǔn)確的研究結(jié)果，仍須克隆驗(yàn)證以及酶學(xué)鑒定，因此關(guān)于該基因的分子克隆和功能鑒定，我們還在進(jìn)行更深層次的試驗(yàn)和研究。