復(fù)方蜂膠提取物提高小鼠的免疫力

趙佩佩，殷欣，夏雪奎，張玉，劉昌衡，史亞萍*

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物研究所，山東省科學院生物研究所，山東濟南 250103）

（2.濟南臻研匯康生物科技有限公司，山東濟南 250100）

蜂膠是工蜂從樹干上或植物嫩芽上采集的樹脂或其他分泌物，通過與自己上顎腺分泌的一類物質(zhì)混合形成的膠狀固體物質(zhì)[1]，是我國的古典名藥，在民間具有很長的食用歷史。蜂膠具有多種生物學功能，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗?jié)?、抗癌和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)等，而這些特性與其類黃酮、酚酸和萜類化合物有關(guān)，其中主要取決于其類黃酮含量[2-6]。此外，蜂膠還可能與提高機體的免疫力有關(guān)，施子棣等[7]發(fā)現(xiàn)蜂膠水煎液可以促進小白鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能；薛云浩等[8]發(fā)現(xiàn)蜂膠軟膠囊可提高小鼠的免疫功能，進而增強機體免疫力。

陳麗芳等[9]發(fā)現(xiàn)靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物可增強小鼠免疫功能，提示了蜂膠復(fù)合物可能有較好的增強免疫力的功能。已有報道黃芪多糖[10]、黃芪水煎劑[11]、黃精粗多糖[12]和枸杞發(fā)酵液[13]均具有增加小鼠的免疫功能的功效，如對T淋巴細胞的功能有一定的促進作用和促進小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬作用等。此外，王建東等[14]比較了蜂膠多糖、枸杞多糖和黃芪多糖對小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)3種多糖對小鼠血液中白細胞、淋巴細胞和紅細胞都具有一定的影響，但對小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響差異不顯著。因此蜂膠提取物搭配傳統(tǒng)的補益中藥或植物提取物可能具有比單一蜂膠提取物更為優(yōu)越的提高免疫力功效。

氫化可的松（HY）是一種免疫抑制劑，它可以抑制巨噬細胞吞噬作用，能夠損壞淋巴細胞等，因此對機體的細胞免疫和體液免疫均有抑制作用[15]。其免疫抑制機制可能是能夠結(jié)合免疫細胞上的受體，誘導(dǎo)細胞內(nèi)多種抑制因子的轉(zhuǎn)錄、翻譯，從而抑制機體的免疫功能[16]。本文在構(gòu)建氫化可的松致免疫低下小鼠模型基礎(chǔ)上，探究蜂膠、枸杞、黃芪和黃精復(fù)方提取物對小鼠非特異性免疫和特異性免疫功能的影響，可為生產(chǎn)具有提高免疫功能的保健食品提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠為低溫冷凍干燥獲取凍干粉，來源于西安四季生物科技有限公司，經(jīng)本實驗室乙醇超聲提取獲得粗黃酮。枸杞、黃精和黃芪來源于市售，經(jīng)本實驗室進行水提醇沉獲取的粗多糖，復(fù)方按蜂膠提取物:枸杞提取物:黃芪提取物:黃精提取物（m:m:m:m）=3:4:5:5的比例混合所得干粉，混合干粉中黃酮為13.35%，植物粗多糖為78.63%，其他可溶性物質(zhì)含有粗蛋白和膳食纖維。該復(fù)方是通過正交t值法進行篩選獲得的主要有效成分。

氫化可的松（HY）、RPMI 1640培養(yǎng)液、D-hank’s液、PBS液、小牛血清、WST-1、青/鏈霉素、刀豆蛋白A（ConA）、熒光試劑均購自碧云天生物科技公司；冰醋酸、異丙醇、氯化鈉等購自國藥集團。

實驗小鼠為SPF級BALB/c雄性小鼠，由北京華阜康生物科技股份公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK-(京) 2014-0004。飼料購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK-(滬)2014-0001。動物房環(huán)境條件：屏障系統(tǒng)，溫度：22 ℃～25 ℃，相對濕度：55%～70%。小鼠的采食量為4 g/d，飲水量4 mL/d。

1.2 儀器與設(shè)備

FT-11超凈工作臺、HS-799離心機，無錫瑞江生物科技公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，南京建成生物公司；M5酶標儀、流式細胞儀、倒置顯微鏡，美國BIOTECK等；細胞培養(yǎng)板（圓形、U型）、玻璃皿、75 μm細胞篩網(wǎng)、計時器、載玻片等，上海生工。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組

設(shè)6個分組：陰性對照組、模型組、單一蜂膠提取物組（0.125 g/kg）和三個不同劑量復(fù)方組：低劑量（0.125 g/kg）、中劑量（0.50 g/kg）和高劑量組（1.25 g/kg）。每只小鼠灌胃0.2 mL，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30 d。模型組和劑量組在實驗的第22 d、24 d、26 d、28 d和30 d進行40 mg/kg氫化可的松肌內(nèi)注射造模處理。陰性對照組給予等劑量的生理鹽水，第31 d進行各指標測試[17]。

1.3.2 復(fù)方蜂膠提取物對小鼠體重、臟器指數(shù)的影響

飼養(yǎng)結(jié)束后稱小鼠體重，處死小鼠，取胸腺和脾臟，去盡筋膜，吸干臟器表面的血污，稱其重量，計算胸腺/體重比值以及脾臟/體重比值。

1.3.3 外周血白細胞數(shù)記數(shù)

將小鼠摘眼球取血，至抗凝管中，震蕩以防血凝。取全血約1 mL，用全血細胞分析儀對外周血白細胞（PWBC）和淋巴細胞（PBL）記數(shù)[18]。

1.3.4 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗（WST-1法）

實驗第31 d處死動物，無菌取脾，制成單細胞懸液，細胞濃度為2×106cells/mL。取100 μL上述細胞懸液加入到96孔板中，模型組和劑量組加入50 μL ConA液（溶液終濃度為5 μg/mL），對照組加入等體積的培養(yǎng)液，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10 μL WST-1（5 mg/mL），繼續(xù)孵育2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用M5酶標儀于450 nm波長下測OD值[19]。

1.3.5 小鼠碳廓清實驗

實驗第31 d，以0.01 g/mL體重向小鼠尾靜脈注入稀釋后的印度墨汁。2 min、10 min后，各于內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，立即加入0.1%的2 mL Na2CO3溶液中。M5酶標儀于600 nm波長下測OD值。處死小鼠，取肝臟和脾臟，除去筋膜和表面血污，稱重。按以下公式計算吞噬指數(shù)[17]。

1.3.6 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球?qū)嶒?/p>

實驗第25 d，每只小鼠腹腔注射2%的0.2 mL綿羊紅細胞（SRBC），使其激活巨噬細胞，4 h后，脫頸椎處死小鼠，每只腹腔注射3 mL D-Hank's液（含10%小牛血清），輕揉腹部1 min，取2 mL腹腔洗液，過濾，調(diào)整細胞濃度為6×105cells/mL。使用6孔培養(yǎng)板，吸1 mL腹腔洗液于其中，加入預(yù)調(diào)過的熒光微球（1×107cells/孔），二氧化碳細胞培養(yǎng)箱避光孵育2 h（37 ℃），去掉上清，PBS緩沖液洗滌2次，離心去上清，加入0.3 mL PBS緩沖液，胰酶消化細胞1 min，吹打均勻，過濾后用流式細胞儀分析，計算吞噬百分率（公式4）和吞噬指數(shù)（公式5）[17]。

1.3.7 抗體生成細胞檢測（改良法）

實驗第26 d，腹腔注射2% 0.2 mL SRBC懸液，免疫4 d后的小鼠頸椎處死，制取脾淋巴單細胞懸液。取50 μL用生理鹽水配制的2% SRBC和200 μL脾淋巴細胞懸液先后加入到0.5 mL的頂層試管中，混勻后倒入6孔板中，每個樣本做3個平行孔。二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h（37 ℃），然后每孔加入500 μL以完全培養(yǎng)基稀釋的補體（V/V，1:10），繼續(xù)孵育2 h，自動圖象分析儀讀取溶血空斑數(shù)，溶血空斑數(shù)值為空斑數(shù)/106脾細胞[20]。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 20.2軟件處理各組數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)均為平均值±標準差，采用One-Way ANOVA法分析各組實驗數(shù)據(jù)之間的差異顯著關(guān)系。p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 體重、臟器/體重比值測定

在正常情況下，各臟器與動物體重的比值保持相對恒定，而當動物健康狀況發(fā)生變化時，臟器重量可能隨之發(fā)生改變，從而引起臟器/體重比值的變化。胸腺是中樞免疫器官，是T淋巴細胞發(fā)育、分化、成熟并向外周輸出的場所。脾臟是最大的外周淋巴器官，是發(fā)生免疫應(yīng)答的主要場所。從表1可見，陰性對照組的胸腺/體重和脾臟/體重比值分別為4.01和5.16，而HY模型組的相應(yīng)比值分別為2.80和4.33，兩組差異極顯著（p＜0.01），表明造模成功。各實驗組與HY模型組比，單一蜂膠提取物組和復(fù)方蜂膠提取物三個劑量組小鼠臟器指數(shù)都有明顯升高，差異極顯著（p＜0.01），說明各劑量的復(fù)方蜂膠提取物均可以抵制HY對小鼠脾臟、胸腺的損傷，使臟器指數(shù)恢復(fù)到正常。

表1 復(fù)方蜂膠提取物對小鼠免疫器官/體重的影響Table 1 The effect of compound propolis extract on mice’s immune organ/bodyweight ratio

2.2 復(fù)方蜂膠提取物對小鼠外周血白細胞和淋巴細胞的影響

白細胞來源于骨髓中的造血干細胞，使機體免受病原體和異物的侵入，淋巴細胞是體積最小的一種白細胞，是機體免疫應(yīng)答的重要細胞。機體處于正常狀態(tài)時，骨髓細胞的增殖、分化、成熟釋放與外周血中白細胞的衰老、排出處于相對恒定的狀態(tài)，而HY可破壞這種平衡，抑制骨髓細胞的功能，致使白細胞數(shù)目減少[21]。從表2看出，相比于陰性對照組的6.45×109cells/L（外周血白細胞（PBWC）數(shù)）與6.03×109cells/L（淋巴細胞（PBL）數(shù)），HY模型組的PBWC和PBL的數(shù)目明顯下降（p＜0.01），說明造模成功。單一蜂膠提取物組和復(fù)方蜂膠提取物低劑量組的外周血指標分別提高到4.21×109、3.42×109、4.06×109、3.28×109cells/L，與HY模型組差異顯著（p＜0.05）；而中、高劑量組中小鼠的外周血指標分別達到了4.89×109、4.32×109、5.35×109、4.96×109cells/L，均極顯著高于HY模型組（p＜0.01），表明單一蜂膠提取物和復(fù)方蜂膠提取物能夠顯著改善HY導(dǎo)致的PBWC和PBC水平降低，從而促進免疫抑制小鼠PBWC和PBL水平的恢復(fù)，提高機體的免疫功能，并且單一蜂膠提取物組略高于復(fù)方蜂膠提取物低劑量組，復(fù)方蜂膠提取物中、高劑量組高于單一蜂膠提取物組，推測該實驗中蜂膠提取物中的黃酮類物質(zhì)發(fā)揮了主要功效，其他三種提取物中的多糖成分發(fā)揮了協(xié)同作用，并且復(fù)方蜂膠提取物低劑量組中的各組分協(xié)同作用，功效接近單一蜂膠提取物組。王建東等[14]發(fā)現(xiàn)枸杞多糖、黃芪多糖和蜂膠多糖可促進PBL的增殖，陳麗芳等[9]發(fā)現(xiàn)靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物可提高PBL的增殖能力，本結(jié)果與其研究結(jié)果具有一致性，并且也進一步證明枸杞多糖和黃芪多糖可協(xié)同蜂膠提取物發(fā)揮作用。

表2 復(fù)方蜂膠提取物對小鼠外周血白細胞和淋巴細胞的影響Table 2 The effect of compound propolis extract on mice’s PWBC and PBL

2.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗

ConA是作用于人和小鼠T細胞的重要非抗原性促有絲分裂原，可誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖，用于檢測機體免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)。在ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞增殖的實驗中，經(jīng)統(tǒng)計學分析，灌胃給予受試物30 d，HY模型組小鼠的增殖指數(shù)顯著降低（p＜0.01），免疫低下模型構(gòu)建成功。從表3可知，陰性對照組、HY模型組、單一蜂膠提取物組及復(fù)方蜂膠提取物各劑量組的脾淋巴細胞增殖指數(shù)分別為1.00、0.62、1.44、1.30、1.42、1.56，單一蜂膠提取物組和復(fù)方蜂膠提取物各劑量組均可以促進小鼠脾淋巴細胞的增殖（p＜0.01），說明單一蜂膠提取物和復(fù)方蜂膠提取物可以恢復(fù)HY導(dǎo)致的脾淋巴細胞增殖減少，對細胞免疫功能具有促進作用，這與之前文獻報道蜂膠可顯著增強小鼠脾淋巴細胞的增殖能力相一致[5,8]。靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物及枸杞發(fā)酵液也均可提高小鼠的脾淋巴細胞增殖[9,13]，說明蜂膠提取物可與其他功效成分共同發(fā)揮細胞免疫促進作用，并且本實驗中復(fù)方蜂膠提取物對細胞免疫功能的促進作用具有劑量效應(yīng)。

表3 復(fù)方蜂膠提取物對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Table 3 The effect of compound propolis extract proliferation function of splenic lymphocyteinduced by ConA in mice

2.4 小鼠碳廓清實驗

巨噬細胞是非特異性免疫細胞，具有加工和呈遞抗原、吞噬異物等功能，其吞噬功能可用吞噬指數(shù)來判定，吞噬指數(shù)越高，吞噬功能越強。小鼠碳廓清實驗是將印度墨汁隨小鼠血液循環(huán)到達肝臟、脾臟等處，被巨噬細胞清除，以吞噬指數(shù)指示其碳廓清能力。本實驗中，與陰性對照組（5.32）相比，HY模型組小鼠的吞噬指數(shù)（4.16）極顯著降低（表4）。與HY模型組小鼠相比，單一蜂膠提取物組和復(fù)方蜂膠提取物低劑量組的吞噬指數(shù)（4.71、4.68）差異不顯著，中、高劑量組吞噬指數(shù)（5.29、5.16）均顯著增加（p＜0.01），但中、高劑量之間差異不顯著。陳麗芳等實驗中靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對單核-巨噬細胞的碳廓清能力無明顯的增強作用[9]。而孫小英等實驗中黑蜂蜂膠醇提物可促進移植瘤小鼠的單核-巨噬細胞碳廓清功能，從而提高小鼠的免疫活性[6]。本實驗中復(fù)方蜂膠提取物中劑量組中蜂膠含量略低于黑蜂蜂膠醇提物的低劑量組，但高于靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物，單一蜂膠提取物的蜂膠含量高于黑蜂蜂膠醇提物的低劑量組，而復(fù)方蜂膠提取物中劑量組的吞噬指數(shù)明顯高于單一蜂膠提取物，說明復(fù)方中的其他成分對于蜂膠提高小鼠免疫活性的功效起到了一定的協(xié)同作用。

表4 復(fù)方蜂膠提取物對小鼠碳廓清實驗的影響Table 4 The effect of compound propolis extract on carbon granular clearance test in mice

2.5 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球?qū)嶒?/h3>

表5 復(fù)方蜂膠提取物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響Table 5 The effect of compound propolis extract on phagocytic function of macrophage in mice

巨噬細胞吞噬熒光微球后，利用流式細胞儀迅速檢測熒光信號，具有熒光信號的巨噬細胞與計數(shù)的巨噬細胞相比即為其吞噬百分率，被吞噬的熒光微球總數(shù)與計數(shù)的熒光微球總數(shù)比即為吞噬指數(shù)。從表3可知，陰性對照組吞噬百分率和吞噬指數(shù)分別為27.00和0.41，HY模型組的相應(yīng)指標下降到18.70和0.24，與陰性對照差異極顯著（p＜0.01）；與HY模型組比，中劑量組可以極顯著提高免疫低下小鼠腹腔巨噬細胞對熒光微球的吞噬百分率（p＜0.01）和吞噬指數(shù)（p＜0.01），高劑量組的效果并不顯著（p＞0.05），推測可能是因為高濃度的藥物會對細胞產(chǎn)生一定抑制作用（表5）。

2.6 小鼠抗體生成細胞檢測（改良法）

小鼠經(jīng)SRBC免疫后的溶血素水平是反映其體液免疫功能的重要指標，體液免疫是B淋巴細胞在受到外界抗原刺激后形成效應(yīng)B細胞，分泌抗體參與機體免疫機制[20]。與陰性對照組相比，HY模型組抗體生成細胞數(shù)顯著降低（p＜0.01），免疫低下小鼠模型構(gòu)建成功（表6）。中、高劑量組與HY模型組比，顯著提高了抗體生成細胞數(shù)（p＜0.05）。喻建輝等[5]發(fā)現(xiàn)蜂膠能明顯提高小鼠半數(shù)溶血值和抗體生成細胞數(shù)，薛云浩等[8]發(fā)現(xiàn)蜂膠軟膠囊可顯著增強小鼠產(chǎn)生抗體生成細胞的能力和血清溶血素水平，具有促進機體體液免疫的功能。本實驗中，隨著復(fù)方蜂膠提取物濃度的升高，促進小鼠產(chǎn)生抗體生成細胞的效果越好，而單一蜂膠提取物效果不明顯。不同來源的蜂膠中所具有的活性物質(zhì)成分和含量不同，不同提取方式也會影響最終蜂膠提取物中的活性物質(zhì)，從而導(dǎo)致結(jié)果的差異性，蜂膠對體液免疫的影響總體呈現(xiàn)了劑量依賴型，隨著濃度的增高而效果越明顯。

表6 蜂膠復(fù)方制劑對抗體生成細胞的影響Table 6 The effect of compound propolis extract on ant-body-producing cells in mice

3 結(jié)論

3.1 免疫器官的臟器指數(shù)是基本的免疫指標之一，單一蜂膠提取物和復(fù)方蜂膠提取物均可以抵制氫化可的松的小鼠臟器損傷。在非特異性免疫中，腹腔巨噬細胞、單核-巨噬細胞可以抵抗或者清除外來異物或抗原，其吞噬指數(shù)可以反映其吞噬功能。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方蜂膠提取物可以部分恢復(fù)單核-巨噬細胞的吞噬功能至正常水平，較高劑量組并沒有表現(xiàn)出顯著的增強效應(yīng)，可能是因為高濃度的藥物對細胞抑制作用。但在腹腔巨噬細胞的吞噬作用中，可以發(fā)現(xiàn)該復(fù)方的中劑量組就可以使吞噬功能恢復(fù)到正常水平。

3.2 在細胞免疫反應(yīng)中，ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細胞增殖實驗中，單一蜂膠提取物組和復(fù)方蜂膠提取物劑量組對ConA刺激的脾淋巴細胞具有增殖作用，使免疫低下小鼠的淋巴細胞的增殖水平高于正常水平。在體液免疫反應(yīng)（抗體生成細胞實驗）中，發(fā)現(xiàn)中劑量組可以使抗體細胞生成數(shù)恢復(fù)至正常水平，隨著濃度升高，促進效果就越好，呈劑量依賴型，而單一蜂膠提取物組效果不明顯。

3.3 在免疫低下模型成立條件下，外周血白細胞總數(shù)、NK細胞活性測定、細胞免疫、體液免疫和單核-巨噬細胞功能測定，任兩個實驗測定結(jié)果為陽性，則說明樣品對免疫低下模型具有提高免疫功能的作用。本實驗中，單核-巨噬細胞的功能測定，復(fù)方蜂膠提取物對小鼠碳廓清實驗以及腹腔巨噬細胞吞噬實驗均為陽性反應(yīng)；在外周血白細胞總數(shù)、體液免疫、細胞免疫的實驗的結(jié)果均為陽性反應(yīng)。所以復(fù)方蜂膠提取物具有增強免疫低下小鼠的免疫的功能。