桔甘片對急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用

謝麗雅，董宇，徐曉波，沈瓊，李文強，李偉，任珅，王梓*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118）（2.通化縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，吉林通化 134100）

酒精性肝損傷是我國常見的肝臟疾病，主要包括肝臟脂肪變性，酒精性肝炎，肝纖維化，嚴(yán)重發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[1]。在我國，酒精性肝損傷發(fā)病率日益增加，嚴(yán)重危害人民健康。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，酒精性肝損傷發(fā)生主要是由于酒精在機體代謝過程中會通過多種途徑產(chǎn)生大量活性氧（ROS）[2]，造成抗氧化活性降低和脂質(zhì)過氧化升高，破壞機體氧化還原平衡，從而破壞線粒體功能，誘發(fā)氧化應(yīng)激，最后導(dǎo)致肝損傷[3]。在早期，臨床上治療酒精性肝損傷的措施主要集中在戒酒、營養(yǎng)支持、藥物輔助治療，但長期服用藥物會產(chǎn)生不良反應(yīng)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)許多天然植物提取物及中藥復(fù)方制劑因其具有抗氧化、抗凋亡活性在酒精肝疾病方面起到重要作用[4,5]。

桔梗湯是中醫(yī)辨證理論指導(dǎo)下的經(jīng)典復(fù)方制劑，由桔梗與甘草兩味藥配伍組成[6]，前期研究發(fā)現(xiàn)桔梗湯中主要含有桔梗皂苷D、甘草酸、甘草苷等化學(xué)成分，表現(xiàn)出較好的抗炎[7]、抗氧化[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]等藥理活性。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)桔梗湯在一定程度上對肝臟損傷具有保護作用[10,11]。由于湯劑在臨床應(yīng)用中有不易服用，味苦等缺點，限制了其在日常生活的應(yīng)用和推廣。為進一步提升桔梗與甘草配伍的實用性，依據(jù)桔梗湯的功效特點，課題組前期開發(fā)出集口感好、易吸收、攜帶方便于一體的新型精深加工健康保健產(chǎn)品-“桔甘片”，該產(chǎn)品能很好地解決桔梗湯服用所產(chǎn)生的口感等問題。

目前，關(guān)于中藥復(fù)方片劑保肝作用研究鮮見報道，本研究以現(xiàn)代生活中較為常見酒精性肝損傷為切入點，通過建立小鼠體內(nèi)急性酒精肝損傷模型，初步探討桔甘片（JGT）對酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護作用，為把JGT開發(fā)為保護肝損傷的藥物和保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器和試劑

1.1.1 主要實驗儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；H1650R高速冷凍離心機，北京宏達(dá)恒業(yè)科技有限公司；JJ-2高速組織勻漿機，上海比朗儀器制造有限公司；BioTek-EPUCH2酶標(biāo)儀，美國分子生物儀器公司；RM2245半自動石蠟切片機，徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司；Leica DM 2500熒光顯微鏡，德國徠卡。

1.1.2 藥物與試劑

桔甘片主要由桔梗、甘草、蜂蜜粉組成；聯(lián)苯雙酯滴丸，浙江醫(yī)藥有限公司新昌制藥廠；蘇木素-伊紅染色液（H&E）由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）、甘油三酯（TG）試劑盒全部購于南京建成生物工程研究所；乙醇（分析純，北京化工廠），水為超純水，乙腈為色譜純，所有其他未列試劑均為分析級。

1.1.3 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠（20～22 g），由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，合格證號：SCXK(吉) 2018-0007動物飼養(yǎng)條件符合實驗動物福利倫理委員會的要求，12 h光照或黑夜循環(huán)環(huán)境，溫度為23±2 ℃，相對濕度為50%±5%，提供自由飲水和攝食。

1.2 方法

1.2.1 桔梗湯提取物的制備

先前研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)桔梗和甘草配伍比例為1:2時，桔梗湯中甘草酸、甘草苷、桔梗皂苷D含量最高，且抗氧化能力最強。稱取桔梗飲片60 g、甘草飲片120 g，共180 g，加入20倍蒸餾水，浸泡5 h后煮沸，趁熱過濾，反復(fù)煎煮3次，合并濾液并離心5 min，將上清液置70 ℃水浴鍋蒸發(fā)濃縮至生藥濃度為1.0 g/mL，-80 ℃預(yù)冷24 h，用研缽將桔梗提取物研磨，過80目篩，待用。

1.2.2 不同劑量桔甘片的配制

桔甘片是以桔梗湯提取物為主要原料，添加黏合劑、潤滑劑、矯味劑等輔料；實驗室前期采用單因素考察和正交試驗設(shè)計方法優(yōu)化桔甘片配方，篩選出麥芽糊精30%、蜂蜜粉20%、聚維酮（PVP-k30）4%、硬脂酸鎂1.5%、桔梗湯提取物44.5%為最佳配伍比例。將主藥和輔料充分混勻后過篩，并采用粉末直接壓片法制備桔甘片，片重達(dá)到0.4 g。精密稱量桔甘片56.2 mg、112.4 mg、224.8 mg分別溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成濃度分別為10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL給藥樣品溶液，待小鼠灌胃備用。

1.2.3 高效液相色譜條件

利用Tnature C18 Superb色譜柱（250 mm×4.6 mm），流動相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）；流速1.0 mL/min，進樣量：10 μL；柱溫30 ℃。洗脫梯度：0～10 min，20%→25% B；10～55 min，25%→50% B；55～57 min，50%→20% B；57～60 min，20% B，在波長210 nm處測定。

1.2.4 動物分組和給藥

所有小鼠在標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)1周，隨后將小鼠隨機分成6組（n=8只）：空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯陽性組（200 mg/kg)、JGT-L（100 mg/kg）組，JGT-M（200 mg/kg）組，JGT-H（400 mg/kg）組，各給藥組按劑量10 mL/kg連續(xù)灌胃給藥14 d，空白組和模型組給予0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，末次給藥1 h后，除空白組外，剩余組灌胃給予50%酒精（12 mL/kg·bw）致急性肝損傷；12 h后對小鼠進行眼球采血以收集血液樣本，離心后取上清用于生化指標(biāo)檢測；將小鼠脫頸處死后，立即取出肝、脾組織。將各肝臟左葉一小部分固定于10%中性緩沖福爾馬林溶液，其余肝組織立即放入液氮中并于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)實驗，動物實驗設(shè)計流程如圖2所示。

1.2.5 臟器指數(shù)的測定

動物實驗結(jié)束前，對所有小鼠稱重。解剖后，迅速取出肝臟，使用0.9%生理鹽水去除血液，濾紙吸凈后對肝組織稱重，計算小鼠臟器指數(shù)：

1.2.6 小鼠血清生化標(biāo)記物的測定

取小鼠血清，根據(jù)試劑盒說明書，對AST和ALT兩個肝毒性敏感指標(biāo)及TG的水平進行了檢測。

1.2.7 小鼠肝組織勻漿指標(biāo)測定

精密稱取0.2 g肝組織置于2 mL離心管中，加入生理鹽水(1:9m/V)后勻漿，在4000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，使用BCA蛋白試劑盒對勻漿上清液蛋白濃度進行測定。根據(jù)脂質(zhì)過氧化MDA試劑盒說明書檢測肝組織中MDA的含量，谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒說明書測定GSH-Px活性。

1.2.8 組織病理學(xué)檢查

每組隨機選取3只小鼠進行肝臟組織病理學(xué)檢查。取肝臟左葉一小部分，用10%福爾馬林溶液固定2 d以上，流水過夜，酒精脫水，石蠟包埋并切成5 μm切片。切片經(jīng)脫蠟、水合、蘇木精和伊紅染色，采用光學(xué)顯微鏡，200倍放大，觀察肝組織形態(tài)變化。并采用Ridit法分析肝細(xì)胞受損程度。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，采用單向方差分析（ANOVA）評估兩組間的差異，p＜0.05、p＜0.01或p＜0.001表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC法分析桔甘片（JGT）中化學(xué)成分

采用高效液相色譜法，在JGT中檢測到甘草苷、甘草酸、黨參炔苷、桔梗皂苷D等4種主要活性成分（如圖1），其中甘草苷含量為2.41 mg/g，黨參炔苷含量為0.03 mg/g，桔梗皂苷D含量為0.5 mg/g，甘草酸含量為0.84 mg/g，上述成分可以作為桔甘片質(zhì)量控制的重要指標(biāo)性成分。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（a）和樣品（b）Fig.1 Standard references (a) and Samples (b)

2.2 JGT對小鼠臟器指數(shù)的影響

表1 桔甘片對急性酒精肝損傷小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of JGT on organ indices on alcohol-induced ALI in mice(x±s, n=8)

如表1所示，與空白對照組相比，各組小鼠體質(zhì)量沒有顯著變化，表明JGT與聯(lián)苯雙酯陽性藥對小鼠體重沒有明顯的影響。一次性大劑量酒精沖擊后，模型組小鼠肝臟指數(shù)較空白組顯著增加（p＜0.05），分別達(dá)到5.84 mg/g，表明小鼠體內(nèi)肝組織受損。陽性藥和JGT低中高劑量給藥后，能夠不同程度的降低酒精導(dǎo)致的肝重的增大（p＜0.05），各給藥組均具有顯著地統(tǒng)計學(xué)意義，其中，JGT高劑量組對急性肝損傷小鼠肝重的影響最為顯著（p＜0.01），肝臟指數(shù)下降到5.32 mg/g。

圖2 急性酒精肝損傷模型實驗流程圖及桔甘片對小鼠血清中ALT、AST和TG的影響Fig.2 Experimental flow chart of alcohol-induced ALI in mice and the effect of JGT on serum ALT (b), AST (c) and TG (d)

圖3 桔甘片對急性酒精肝損傷小鼠肝臟中MDA和GSH-Px水平的影響Fig.3 The effect of JGT on the levels of MDA (a) and GSH-Px (b) on alcohol-induced ALI in mice

2.3 JGT對小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和TG的影響

ALT和AST作為非特異性功能酶，廣泛存在于心肌組織及肝臟組織，被認(rèn)為是反映肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)，當(dāng)機體肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死和損傷時，兩種血清轉(zhuǎn)氨酶從肝臟滲透到血液，造成血液中ALT和AST濃度升高[12]。據(jù)文獻報道[13]，甘草提取物能夠通過抑制酒精導(dǎo)致的肝組織中ALT、AST水平的升高，從而對肝組織損傷起到緩解和改善效果。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，50%酒精攝入能夠?qū)е卵逯蠥LT、AST水平急劇升高（p＜0.001，p＜0.05），分別達(dá)到40.91、31.98 U/L，進一步表明肝組織嚴(yán)重?fù)p傷。然而，JGT和聯(lián)苯雙酯預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，并且JGT高劑量組中ALT、AST下降最為顯著（p＜0.01，p＜0.001），降低到15.65、16.42 U/L，與陽性藥組效果較為接近。此外，我們對TG水平進行了檢測，它是反映肝臟脂肪代謝障礙的敏感指標(biāo)[14]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JGT給藥對降低TG的濃度有一定作用，其中高劑量組抑制率可達(dá)到34.73%，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），上述結(jié)果初步說明JGT能夠改善小鼠肝組織損傷程度。

2.4 JGT對小鼠肝臟MDA和GSH-Px的影響

MDA是多不飽和脂肪酸過氧化的最終產(chǎn)物之一，具有細(xì)胞毒性，也是氧化應(yīng)激的標(biāo)志。脂質(zhì)過氧化是通過自由基氧化細(xì)胞膜內(nèi)的多不飽和脂肪酸，導(dǎo)致組織損傷[15]。由圖3a可知，與空白組相比，模型組小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA明顯增多（p＜0.001），達(dá)到2.41 nmol/mg；與模型組比較，陽性藥組脂質(zhì)過氧化水平明顯降低，降幅達(dá)到33.75%（p＜0.01）。同時，JGT不同劑量均能有效抑制MDA含量的升高，其中高劑量組作用效果最強，抑制率達(dá)到27.50%（p＜0.05），表明JGT可以顯著減輕肝臟的氧化損傷。

GSH-Px屬于機體內(nèi)重要的抗氧化酶，能清除氧化過程中產(chǎn)生的超氧負(fù)離子自由基，GSH-Px活力的提高反映機體清除自由基能力的增強，從而保護機體組織免受損傷[16]。圖3b結(jié)果顯示，模型組GSH-Px活性為610.15 U/mg pro，較空白組降低了29.30%。此外，JGT低、中、高劑量預(yù)給藥處理后，肝組織勻漿中GSH-Px活性分別上升至634.24、802.72、828.81 U/mg pro，并且JGT中高劑量組顯著逆轉(zhuǎn)了小鼠體內(nèi)抗氧化酶的減少（p＜0.05）；這些數(shù)據(jù)清楚的表明：JGT對酒精誘導(dǎo)的肝損傷具有保護作用，可能部分與其抗氧化活性有關(guān)。

圖4 桔甘片對急性酒精肝損傷小鼠肝臟病理變化影響Fig.4 Effect of JGT on pathological changes of liver on alcohol-induced ALI in mice

表2 小鼠肝臟病理變化和Ridit分析Table 2 Pathological changes in the liver and Ridit analysis

2.5 JGT對小鼠組織病理學(xué)變化的影響

通過光學(xué)顯微鏡對肝組織切片觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白組中央靜脈組織細(xì)胞核排列規(guī)則整齊，形態(tài)正常，未見炎癥浸潤；模型組肝細(xì)胞損傷較明顯，少量細(xì)胞核出現(xiàn)萎縮，排列不規(guī)則，見有部分炎癥浸潤；與模型組比較，各給藥組不同程度改善小鼠肝組織損傷，炎癥浸潤面積明顯減小，且高劑量組和陽性組肝細(xì)胞形態(tài)幾乎恢復(fù)正常（見圖4）。根據(jù)肝細(xì)胞損傷程度進行評分及Ridit分析，由表2可知，模型組與空白對照組比較表現(xiàn)出更高的肝組織損傷等級，與模型組相比，中、高劑量組損傷等級顯著降低（p＜0.05），上述結(jié)果表明JGT對酒精誘導(dǎo)的肝組織損傷具有良好的治療效果。

3 結(jié)論

綜上所述，JGT能夠通過抑制小鼠體內(nèi)肝功能指標(biāo)水平的升高，有效降低肝臟脂質(zhì)過氧化水平，調(diào)節(jié)肝臟代謝的紊亂，提高小鼠體內(nèi)抗氧化能力，恢復(fù)機體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡，從而對酒精誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷發(fā)揮保護作用。本研究為深度開發(fā)治療酒精性肝損傷藥物奠定實驗基礎(chǔ)，同時更拓寬了藥食兼用藥材的使用途徑。值得注意的是，本文從JGT中檢測到甘草苷、甘草酸、黨參炔苷、桔梗皂苷D四種活性成分，其中，桔梗皂苷D具有較強的抗氧化能力，可能在保護酒精肝損傷方面發(fā)揮主導(dǎo)作用，盡管我們對JGT的肝保護作用做了初步的研究，但JGT對機體其他組織是否具有預(yù)防保護作用有待探討。