龍眼、枸杞和紅棗多糖的理化性質(zhì)及其協(xié)同益生活性

周文君，池建偉，易陽，張名位，張瑞芬，劉磊，賈栩超，董麗紅，黃菲*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）

龍眼（Dimocarpus longanLour.）為無患子科龍眼屬常綠喬木，主產(chǎn)于廣東、海南、廣西等地區(qū)，是典型的南方特色水果。龍眼多糖（longan polysaccharide，LP）是龍眼中最豐富的活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[1]。枸杞（Lycium barbarumL.）屬于茄科枸杞屬落葉灌木植物，主產(chǎn)于寧夏、甘肅、青海、新疆等地，是我國西北干旱地區(qū)重要經(jīng)濟(jì)作物[2]。枸杞多糖（goji polysaccharide，GP）是枸杞的主要活性成分，具有抗糖尿病、改善睪丸功能、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗結(jié)腸癌、細(xì)胞保護(hù)和神經(jīng)調(diào)節(jié)等功效[3]。紅棗（Zizyphus jujubeMill.）是鼠李科棗屬植物棗樹的果實(shí)，主產(chǎn)于新疆、河南、山東、河北等地區(qū)，是典型的北方特色水果。紅棗多糖（jujube polysaccharide，JP）是紅棗的主要活性物質(zhì)，具有抗衰老、增強(qiáng)肌力、護(hù)肝抗炎、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)不同來源多糖的結(jié)構(gòu)和活性均有顯著差異[6]。雖然關(guān)于龍眼、枸杞和紅棗多糖的研究已有較多報(bào)道，但對(duì)于三種多糖的理化特性和活性差異的研究較少。將南方特色水果龍眼、北方特色水果紅棗和西北干旱地區(qū)經(jīng)濟(jì)作物枸杞中的多糖進(jìn)行比較，明確其構(gòu)效關(guān)系，對(duì)豐富植物多糖的理論研究有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)多糖因大分子結(jié)構(gòu)難以被機(jī)體直接消化吸收利用，需要依賴于腸道菌群酵解利用，通過影響腸道菌群構(gòu)成及其代謝產(chǎn)物發(fā)揮其生理功能[7]。多糖對(duì)腸道菌群的影響主要體現(xiàn)在促進(jìn)腸道益生菌增殖、增加益生菌豐度[8]。如山藥多糖、發(fā)酵黃精多糖、蛹蟲草多糖等可增加小鼠結(jié)腸內(nèi)雙歧桿菌屬、乳酸菌屬、羅斯氏菌屬等益生菌的豐度，降低另枝菌屬、螺桿菌屬、梭菌屬鏈球菌屬、大腸桿菌、腸球菌等腸道病原菌的豐度，對(duì)腸道功能有一定的保護(hù)作用[9-11]。因而，植物多糖對(duì)益生菌的影響受到越來越多的關(guān)注，多糖通過調(diào)節(jié)益生菌進(jìn)而發(fā)揮其他生理功效成為一種新的研究方向。

單一多糖的功效一般具有一定的局限性，有研究發(fā)現(xiàn)將多糖按照一定的比例復(fù)配后，其生理功效具有協(xié)同增效的作用[12]。如黃芪多糖和硫酸化三枝九葉草多糖組成的復(fù)合多糖可以克服環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制，顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，提高血清抗體滴度、IFN-γ、IL-2、IgG和IgM水平，其復(fù)合多糖效果優(yōu)于單用黃芪多糖或硫酸化三枝九葉草多糖[13]；Wang等[14]將復(fù)合多糖（枸杞多糖:黃芪多糖:香菇多糖=1:1:1）灌胃幼鼠，構(gòu)建了幼齡大鼠腸道菌群與代謝產(chǎn)物的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合多糖被微生物利用后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（如氨基酸和短鏈脂肪酸等）可促進(jìn)益生菌豐度增加和腸道功能完善。復(fù)合多糖可增加肥胖小鼠腸道菌群中雙歧桿菌屬、別樣棒菌屬、蘇黎世桿菌科等益生菌的數(shù)量[15]。龍眼、枸杞和紅棗多糖的生理功效已被廣泛報(bào)道，但對(duì)其調(diào)節(jié)益生菌的研究不多，其是否具有協(xié)同益生活性亦不明確。因此，本研究以南方特色水果龍眼、北方特色水果紅棗和西北干旱地區(qū)經(jīng)濟(jì)作物枸杞為原料，通過對(duì)比三種多糖的理化性質(zhì)和基本結(jié)構(gòu)的差異，考察3種多糖單獨(dú)及復(fù)合作用對(duì)益生菌增殖的影響，明確其是否具有協(xié)同益生功效。本研究的結(jié)果既可以豐富植物多糖生物活性的理論研究，又能為龍眼、枸杞、紅棗功能性食品研發(fā)提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍眼干產(chǎn)地廣東，品種為“儲(chǔ)良”；紅果枸杞干產(chǎn)地寧夏，品種為“寧夏枸杞”；紅棗干產(chǎn)地新疆，品種為“灰棗”；以上三種原料購自天平架水果市場(chǎng)。

葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、巖藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，上海源葉生物科技有限公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（分子量：1、5、12、25、150、270、410、670 ku）（色譜純），美國Sigma aldrich公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成科技有限公司；復(fù)合益生菌株（發(fā)酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜熱鏈球桿菌），廈門元之道生物科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

GL224I-1SCN分析天平，德國賽多利斯集團(tuán)；SP902S可拆洗靜音破壁機(jī)，浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司；Eyelan-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、DRC-1000REC冷凍干燥器，東京理化器械株式會(huì)社；MRHei-Tec磁力攪拌器，德國海道夫集團(tuán)；GL-20M高速冷凍離心機(jī)，湖南長沙易達(dá)儀器有限公司；BioTekGen5酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；WatersACQUITYAPC高效液相色譜儀，美國沃特世公司；ICS 5000高效離子色譜儀，美國Dionex公司；Nexus5DXC FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司；LEO1530VP場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，德國Zeiss公司；Malvern Zetasizer Series納米粒度儀，英國Malvern儀器有限公司；LS-75HD立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-OJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HYQX-Ⅲ厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取

取龍眼干、枸杞干、紅棗干原料洗灰去核，按料液比1:30（g/mL）的比例加入蒸餾水，打漿2 min直至果肉變成碎小顆粒，質(zhì)地均勻，將果漿轉(zhuǎn)移至5 L燒杯中，覆膜后置于95 ℃水浴浸提4 h，采用紗布趁熱過濾，收集上清液，將濾渣按料液比1:30（g/mL）的比例加入蒸餾水二次提取，收集上清液合并，在65 ℃的水浴溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5～1/4，得到粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入1/4體積的Sevag試劑（氯仿:正丁醇=4:1混合制得）去除蛋白，800 r/min磁力攪拌20 min后離心（4000 r/min，10 min），收集上清液，重復(fù)多次直至多糖溶液基本無蛋白沉淀，將上清液于65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)試劑，得到脫蛋白多糖溶液。將脫蛋白多糖溶液加入4倍體積無水乙醇，于4 ℃冰箱存放12 h（靜置過夜），冷凍離心（4000 r/min，20 min）收集沉淀，加少量預(yù)熱蒸餾水溶解沉淀后，采用冷凍干燥得到三種多糖，分別標(biāo)記為龍眼多糖（LP）、枸杞多糖（GP）和紅棗多糖（JP）。

1.2.2 多糖基本成分分析

1.2.2.1 多糖得率

使用重量法計(jì)算多糖得率，計(jì)算公式如下：

1.2.2.2 基本化學(xué)成分

中性糖含量測(cè)定：采用苯酚-硫酸法[16]。

糖醛酸含量測(cè)定：采用Filisetti的間羥基聯(lián)苯法[17]。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒測(cè)定蛋白含量。

1.2.2.3 分子質(zhì)量

樣品的配制方法：稱取適量樣品，加入1 mL流動(dòng)相溶解，靜置12 h，搖勻，過0.45 μm濾膜，等待分析。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的配制方法：稱取不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)品各2 mg，加入流動(dòng)相1 mL，靜置12 h，搖勻，等待分析。

色譜柱：UltranhydrogelLinear（7.8×300 mm），柱溫35 ℃；流動(dòng)相：25 mmol/L Na2HPO4+25 mmol/L NaH2PO4+0.05% NaN3緩沖鹽溶液；流速：0.8 mL/min；等度洗脫，進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器，溫度35 ℃。

1.2.3 單糖組成分析

參考Zhang[18]的研究：5 mg樣品加4 mL 4 mol/L三氟乙酸在安瓿瓶中溶解，酒精噴燈封管，在110 ℃條件下水解6 h。冷卻到室溫后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余的三氟乙酸，加入3 mL甲醇復(fù)溶，蒸發(fā)干燥四次。最后，使用超純水溶解殘?jiān)?，定容?0 mL容量瓶后，過0.22 μm濾膜進(jìn)行分析。

離子色譜條件：CarbopacPA1分析柱（250×4 mm2）；梯度洗脫過程如下：0～25 min，1% 500 mmol/L NaOH；25～40 min，線性梯度1～100% 500 mm NaOH；40～50 min，100% 500 mmol/L NaOH。用NaOH和CH3COONa洗脫葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。0～20 min，20% 500 mmol/L NaOH；20～30 min，100% 100 mmol/L NaOH和170 mmol/L CH3COONa，30～45 min，線性梯度20～35% 500 mmol/L NaOH。進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為30 ℃。結(jié)果根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行分析，并通過出峰的面積比計(jì)算出單糖摩爾百分比。

1.2.4 紅外光譜分析

取1～2 mg多糖樣品，與100 mg KBr研磨混合后壓片，采用傅立葉變換紅外光譜儀掃描分析，掃描范圍為4000～400 cm-1。

1.2.5 掃描電鏡分析

取2～3 mg多糖粉末，使其薄且均勻的分布在導(dǎo)電膠上，真空噴金，用掃描電子顯微鏡觀察其在200和20000倍下的形貌特征。

1.2.6 多糖的溶液特性分析

多糖的溶解性測(cè)定：參考尹艷[19]的研究并稍作修改，稱取200 mg的多糖樣品，溶于4 mL蒸餾水中，室溫下靜置30 min，期間每隔5 min渦旋振蕩10 s。靜置后離心（4000 r/min，10 min），取上清液1 mL，冷凍真空干燥，稱重干燥后的上清質(zhì)量，以每毫升水中溶解的多糖的質(zhì)量來表征其溶解性。

多糖溶液的粒徑與電位測(cè)定：稱取10 mg的多糖樣品，溶于4 mL蒸餾水中，渦旋混勻后使用納米粒度儀在25 ℃通過動(dòng)態(tài)光散射分析多糖水溶液的Zeta電位（Zp）和粒度（Size）。

1.2.7 單一多糖對(duì)復(fù)合菌種的益生活性評(píng)價(jià)

無碳MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏4 g，牛肉膏8 g，檸檬酸氫二銨2 g，無水乙酸鈉5 g，七水合硫酸鎂0.2 g，磷酸二氫鉀2 g，四水合硫酸錳0.04 g，吐溫801 mL，L-半胱氨酸0.5 g，加入1 L蒸餾水，調(diào)整pH為6.2～6.5。

菌株活化：將保存的復(fù)合益生菌株（發(fā)酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜熱鏈球桿菌）溶于適量0.9%無菌生理鹽水中制成菌懸液，取200 μL菌懸液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，置于厭氧恒溫培養(yǎng)箱（10% CO2、10% H2和80% N2，37 ℃）中培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。取活化好的菌液繼續(xù)傳代培養(yǎng)。將傳代培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液3500 r/min離心10 min，棄去上清液，用0.9%無菌生理鹽水洗滌沉淀兩次，最后加入10 mL生理鹽水重懸菌體制成菌懸液備用。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組（菊粉和葡萄糖）、LP、GP和JP組，每組均設(shè)計(jì)5個(gè)濃度（1、5、10、20、30 mg/mL）。

按照4%（V/V）的接種量將制備好的菌懸液接種至以不同多糖樣品和對(duì)照為碳源的培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后取1.5 mL測(cè)培養(yǎng)液的pH值，另取2 mL培養(yǎng)液離心（5000 r/min，10 min），去除上層清液，沉淀用等量生理鹽水重懸，以生理鹽水為空白，在600 nm處測(cè)各組OD值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。采用比濁度法，以O(shè)D600值（反映溶液中細(xì)菌總數(shù)）為評(píng)價(jià)指標(biāo)比較各多糖對(duì)益生菌增殖的影響作用。

1.2.8 正交試驗(yàn)優(yōu)化三種多糖的最佳配比

表1 LP、GP和JP復(fù)合正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors level of orthogonal test for probiotic activity of LP, GP and JP

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇10、20和30 mg/mL三個(gè)水平，以復(fù)合益生菌株在不同多糖配比下發(fā)酵48 h后的OD600值為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合多糖最佳配比，試驗(yàn)因素水平安排見表1。單因素試驗(yàn)中得到多糖益生活性最佳濃度為30 mg/mL，確定復(fù)合多糖溶液最終濃度為30 mg/mL，培養(yǎng)方法及檢測(cè)指標(biāo)參考1.2.7。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，通過SPSS 19.0.0軟件分析數(shù)據(jù)，并用Duncan檢驗(yàn)比較組間差異，以不同小寫字母表示（p＜0.05）。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用Origin 9.0和Excel軟件制表作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖基本成分

3種多糖的得率、分子量和基本化學(xué)組成見表2。JP的得率最高為4.07%，LP和GP的得率分別為1.59%和1.84%，并無顯著性差異（p＞0.05）。3種原料多糖的得率與前人研究基本一致，如本課題組前期研究的龍眼多糖得率為1.06%～8.58%[20,21]，文獻(xiàn)報(bào)道枸杞多糖得率為0.35%～14.12%[22,23]，紅棗多糖得率為2.30%～8.01%[24,25]。多糖的得率與原料品種、來源，以及提取方式等都有密切關(guān)系。

LP和JP的純度相對(duì)較高，含有一個(gè)分子量峰，GP的純度相對(duì)較差，含有2個(gè)分子量峰[26]。3種多糖主峰分子量大小為：JP＞GP＞LP。3種多糖主要由中性糖和糖醛酸組成，含有少量的蛋白質(zhì)。三種多糖的中性糖含量為：LP＞JP＞GP，且均超過70%。GP的糖醛酸含量顯著高于LP和JP（p＜0.05），而JP的蛋白質(zhì)含量顯著高于LP和GP（p＜0.05）。

表2 LP、GP和JP的得率、分子量和化學(xué)成分Table 2 Yield, molecular weight and chemical composition of LP, GP and JP

2.2 多糖的單糖組成

LP、GP和JP的單糖組成見表3。3種多糖含有5種中性糖、2種糖醛酸，且均以中性糖為主。LP和GP的單糖組成比較相似，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖組成，JP則主要由葡萄糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖組成。3種多糖中含量最高均為葡萄糖，其比例超過50%。3種多糖的單糖組成與前人報(bào)道的龍眼多糖、枸杞多糖和紅棗多糖的結(jié)果相似[27-29]。

表3 LP、GP和JP的單糖組成（摩爾比）Table 3 Monosaccharide composition of LP, GP and JP

2.3 多糖的紅外光譜

3種多糖的紅外光譜吸收峰見圖1。LP、GP和JP在3600～3200 cm-1均出現(xiàn)了強(qiáng)吸收峰，是糖類分子之間或分子內(nèi)的O-H伸縮振動(dòng)峰[30]；2931 cm-1處的吸收峰為甲基或亞甲基C-H鍵伸縮振動(dòng)吸收峰；1103 cm-1、1078 cm-1、1052 cm-1和1030 cm-1處的吸收峰是α型吡喃糖苷的C-O-C伸縮振動(dòng)特征吸收峰[31]，由這三組糖類的特征峰可以判斷，LP、GP和JP是多糖。801 cm-1處的吸收峰由呋喃環(huán)的C-H變角振動(dòng)引起的，865 cm-1和923 cm-1處的吸收峰表示含有呋喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。1614 cm-1、1420 cm-1為C=O伸縮振動(dòng)特征吸收峰，表明羧基的存在；1261 cm-1處的吸收峰為羧基-COOH的O-H變角振動(dòng)；1371 cm-1處的吸收峰是-COOH中C=O對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的，表明3種多糖均為酸性多糖。紅外光譜結(jié)果表明3種含有典型的多糖結(jié)構(gòu)特征官能團(tuán)，且均為酸性多糖，與其單糖組成結(jié)果一致。

圖1 LP、GP和JP的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of LP, GP and JP

2.4 多糖的微觀形態(tài)

3種多糖不同放大倍數(shù)的掃描電鏡圖如圖2所示。3種多糖的微觀結(jié)構(gòu)有顯著差異。在低倍率下（×200），LP為碎片化聚集體；GP呈片狀，碎屑化堆積形態(tài)；JP則為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在高倍率下（×20000），LP表面相對(duì)光滑，且有少量分散體纏繞；GP表面形貌呈干燥褶皺狀；JP表面光滑，有少量凹凸不平。

圖2 LP、GP和JP的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of LP, GP and JP

2.5 多糖的溶液特性

3種多糖的溶解性、粒徑、粒度分散指數(shù)（PDI）和Zeta電位結(jié)果見表4。三者的溶解性并無顯著性差異（p＞0.05），均在40 mg/mL以上。3種多糖的粒徑大小為：JP＞LP＞GP。PDI反映的是粒徑分布的均勻程度，PDI值越大表明分布越不均勻[21]。三種多糖的PDI大小為：GP＞LP＞JP，表明GP分布最不均勻。Zeta電位反映多糖在溶液中的帶電情況，其電位絕對(duì)值越大，表明其在溶液中越穩(wěn)定[32]。3種多糖的Zeta電位都是帶負(fù)電，表明其均為陰離子多糖；3種多糖電位的絕對(duì)值大小為：JP＞LP＞GP，表明JP最穩(wěn)定，GP最不穩(wěn)定。這與GP含有2個(gè)分子量峰結(jié)果一致，表明其不均勻性。

表4 LP、GP和JP溶解性、粒徑、粒度分散指數(shù)與Zeta電位Table 4 Solubility, particle size, particle size dispersion index and Zeta potential of LP, GP and JP

表5 各碳源對(duì)復(fù)合益生菌株增殖的影響Table 5 Effects of various carbon sources on the proliferation of compound probiotics

表6 各碳源對(duì)復(fù)合益生菌株產(chǎn)酸的影響Table 6 Effects of various carbon sources on acid production of compound probiotics

2.6 單一多糖的益生活性

3種多糖對(duì)復(fù)合益生菌株增殖作用的結(jié)果見表5。由此可知，3種多糖對(duì)復(fù)合益生菌株的增殖有促進(jìn)作用。對(duì)于同一種多糖而言，隨著多糖濃度的增加，其培養(yǎng)基的OD600值呈增大的趨勢(shì)，說明多糖的增殖效果隨其濃度的增加而增加，在多糖濃度為30 mg/mL時(shí)增殖效果最好。對(duì)于不同多糖而言，在相同濃度下，各碳源培養(yǎng)基OD600值整體趨勢(shì)為：JP≈GP＞LP＞菊粉＞葡萄糖＞空白對(duì)照組（無碳源），但在低濃度下（1 mg/mL）JP組的OD600值高于GP組，在高濃度下（20和30 mg/mL）菊粉組和LP組的OD600值相當(dāng)，說明3種多糖對(duì)復(fù)合益生菌有顯著的促進(jìn)增殖效果，其效果優(yōu)于菊粉和葡萄糖；JP和GP的益生活性相當(dāng)，均比龍眼多糖好。不同益生元的聚合度、單糖組成、支鏈結(jié)構(gòu)都會(huì)對(duì)其益生活性產(chǎn)生影響[33]，3種多糖因其理化特性不同，因而表現(xiàn)出不同的益生活性。

糖類物質(zhì)可被益生菌作為碳源酵解利用，代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸以及乳酸等，這些有機(jī)酸會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH降低，因此，可以通過測(cè)定培養(yǎng)基pH值間接判斷益生菌生長狀況。從表6可以看出，對(duì)于同一種多糖而言，隨著其濃度增加，液體培養(yǎng)基的pH值顯著減小，在30 mg/mL的添加量下pH值達(dá)到最小。對(duì)于不同多糖而言，在相同濃度下，3種多糖培養(yǎng)基pH值大小為JP＜GP＜LP，這與OD600值的變化結(jié)果相符。菊粉組和LP組在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)各濃度下pH值都無顯著性差異。葡萄糖組pH值是所有碳源組中最高的。Ji等[34]推測(cè)多糖的單糖組成影響其被腸道微生物酵解利用，如多糖中的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和甘露糖等單糖更容易被腸道微生物利用；本課題組研究發(fā)現(xiàn)多糖中的葡萄糖的相對(duì)含量越高，其益生活性越強(qiáng)；具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多糖，更易于被微生物分泌的碳水化合物活性酶分解利用[35,36]，這與本研究的結(jié)果一致。

2.7 三種多糖的最佳配比

正交試驗(yàn)優(yōu)化LP、GP和JP復(fù)合配比的結(jié)果及方差分析見表7和表8。由表7可見，3種多糖對(duì)復(fù)合益生菌增殖的影響大小為LP＞JP＞GP，復(fù)合多糖的最佳配方為A2B3C1，即LP:GP:JP=2:3:1，該最佳配比形成的復(fù)合多糖作用于復(fù)合益生菌48 h后，其OD600值最大為3.29。在表8方差分析中，LP對(duì)OD600值影響極其顯著（p＜0.01），因素JP對(duì)OD600值影響不顯著（p＞0.05），因素GP可歸為誤差，這與極差分析的因素主次結(jié)果一致。

進(jìn)一步比較最佳配比形成的復(fù)合多糖與各單一多糖在相同濃度下對(duì)復(fù)合益生菌增殖和pH的影響，結(jié)果如圖3所示，在30 mg/mL的濃度水平上，復(fù)合多糖促進(jìn)復(fù)合益生菌株增殖的效果顯著高于單一多糖及葡萄糖和菊粉對(duì)照組（p＜0.05），其對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的pH值顯著低于單一多糖和其他對(duì)照組（p＜0.05）。由此表明，LP、GP和JP多糖經(jīng)復(fù)合后，具有顯著的協(xié)同益生增效作用。分析3種多糖具有協(xié)同增效的原因，可能與其結(jié)構(gòu)以及對(duì)不同益生菌的影響不同有關(guān)。前人研究報(bào)道龍眼多糖能促進(jìn)發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌等益生菌增殖表現(xiàn)出益生活性[35]，而枸杞多糖可顯著促進(jìn)長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種等益生菌增殖[14,37]，紅棗多糖則促進(jìn)發(fā)酵乳酸菌和雙歧桿菌等益生菌增殖[38,39]。由此可見，3種多糖對(duì)不同益生菌的影響效果是不同的，因此3種多糖的復(fù)合多糖對(duì)復(fù)合益生菌的促增殖效果會(huì)顯著強(qiáng)于單一多糖。

表7 試驗(yàn)方案和極差分析結(jié)果Table 7 Test scheme and range analysis results

表8 正交試驗(yàn)的方差分析表Table 8 Variance analysis table of probiotic activity

圖3 各碳源對(duì)復(fù)合益生菌株增殖（a）和產(chǎn)酸（b）的影響Fig.3 Effects of various carbon sources on the proliferation (a) and acid production (b) of the compound probiotics

3 結(jié)論

比較龍眼多糖、枸杞多糖和紅棗多糖的理化性質(zhì)和益生活性差異，發(fā)現(xiàn)紅棗多糖得率最高、分子量最大；枸杞多糖的中性糖含量最低、糖醛酸含量最高；龍眼多糖的分子量最小、中性糖含量最高；3種多糖的微觀結(jié)構(gòu)有顯著差異，枸杞多糖在溶液中最不穩(wěn)定、紅棗多糖最穩(wěn)定；3種多糖單獨(dú)作用時(shí)均能顯著促進(jìn)益生菌增殖，經(jīng)復(fù)配后其益生活性顯著增強(qiáng)，最佳的復(fù)配比為龍眼多糖:枸杞多糖:紅棗多糖=2:3:1。有關(guān)三種多糖協(xié)同作用的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本研究可豐富植物活性多糖的理論基礎(chǔ)，又可為龍眼、枸杞、紅棗的精深加工提供理論依據(jù)。