功能低聚糖對(duì)植物乳桿菌ZDY2013發(fā)酵乳發(fā)酵特性及冷藏效果的影響

張娜，占英，孟迎平，李一娟，陶雪瑩，魏華,2，張志鴻,2*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047）

（2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌 330047）

益生菌是指攝入一定量后對(duì)人體產(chǎn)生有益健康作用的一類活的微生物。目前，研究和應(yīng)用廣泛的益生菌主要包括乳酸桿菌和雙歧桿菌，其中益生菌開發(fā)的乳制品廣受歡迎。乳品是益生菌遞送的最常見食品基質(zhì)，能有效保護(hù)菌株免受食品加工、儲(chǔ)存和胃腸道環(huán)境損傷，并促進(jìn)其抵達(dá)腸道發(fā)揮益生功效[1]。研究表明，每天攝入一定量含109～1011cfu活菌的發(fā)酵乳能有效預(yù)防腸道炎癥、II型糖尿病和心血管疾病等[2-4]。

植物乳桿菌ZDY2013是一株分離于自然發(fā)酵酸豆角的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)勢(shì)乳酸桿菌，其能夠耐受胃腸道的酸和膽鹽環(huán)境，順利通過胃腸道消化系統(tǒng)，并能調(diào)節(jié)腸道菌群來改善宿主健康[5]。另外，前期研究發(fā)現(xiàn)，利用植物乳桿菌ZDY2013制作的發(fā)酵奶能預(yù)防食源性致病菌污染，并能防止產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌對(duì)小鼠造成腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡[6,7]。

發(fā)酵乳制品中添加益生元（如牛蒡多糖、菊粉和功能低聚糖等）被認(rèn)為是提高產(chǎn)品質(zhì)量、貨架期和功能的有效策略，主要表現(xiàn)為提高乳酸菌在產(chǎn)品貯藏過程中的存活率、改善發(fā)酵乳風(fēng)味[8]和增強(qiáng)其功能特性（抗肥胖、抗菌、抗糖尿病、緩解氧化應(yīng)激等）[9-12]。例如，虞嬌嬌等[13]發(fā)現(xiàn)低聚果糖和低聚半乳糖可以顯著增加發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)，同時(shí)改善發(fā)酵乳的粘稠度；Madhu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳中添加低聚果糖可以促進(jìn)植物乳桿菌CFR 2194和發(fā)酵乳桿菌CFR 2192的生長代謝，提高發(fā)酵乳的抗氧化活性?？寡趸钚砸恢北徽J(rèn)為是乳制品的一種基本營養(yǎng)特性[1]，其可延長發(fā)酵乳的保質(zhì)期及保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[14]。

低聚木糖具有良好的抗氧化活性[15]，且可改善Ⅱ型糖尿病[16]、抗肥胖和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等益生功能；低聚異麥芽糖可顯著促進(jìn)體內(nèi)雙歧桿菌活性，提高腸道免疫和減少腹瀉[17]等益生性。然而，添加低聚木糖和低聚異麥芽糖對(duì)發(fā)酵乳功能特性的影響報(bào)道甚少。為此，本文在發(fā)酵乳中添加低聚木糖、低聚異麥芽糖或者兩種低聚糖的組合物來探究其對(duì)植物乳桿菌ZDY2013發(fā)酵特性及對(duì)發(fā)酵乳的影響，同時(shí)對(duì)冷藏期發(fā)酵乳抗氧化活性進(jìn)行解析。本研究將為功能低聚糖乳制品的研發(fā)與工藝優(yōu)化提供參考，并為植物乳桿菌ZDY2013功能應(yīng)用提升研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZDY2013為本團(tuán)隊(duì)分離于自然發(fā)酵酸豆角，保存于食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

鄰苯二甲醛、三氯乙酸、β-巰基乙醇、鄰菲啰啉均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2’-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、低聚異麥芽糖（純度≥90%），低聚木糖，上海源葉生物科技有限公司；過氧化氫、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、四硼酸鈉，十二烷基硫酸鈉，甲醇，乙醇、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉等均為國產(chǎn)分析純；脫脂乳，金薄金生態(tài)科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司。

Basal MRS（BMRS）培養(yǎng)基配方：10.0 g蛋白胨、5.0 g牛肉膏、5.0 g酵母膏、3.0 g氯化銨、4.0 g磷酸氫二鉀、2.6 g磷酸二氫鉀、0.102 g七水硫酸鎂、0.05 g四水硫酸錳、0.5 g半胱氨酸和1.0 g吐溫-80，加去離子水至1000 mL，加熱溶解，調(diào)pH至6.2，121 ℃滅菌15 min，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

厭氧培養(yǎng)箱，美國Gene Science公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；PHS-3E pH計(jì)，上海偉業(yè)儀器廠；立式蒸汽滅菌鍋，上海博訊儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平，德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵期實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1.1 樣品配制

配置含12 g/100 mL脫脂乳液體、BMRS培養(yǎng)基，10%、15%、20%、25%、30%（m/V）葡萄糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖和低聚木糖與低聚異麥芽糖組合物（1:1）溶液，滅菌（115 ℃、20 min）后分裝待用。

1.3.1.2 菌株活化

從-80 ℃冰箱中取出凍存菌株，用接種環(huán)進(jìn)行劃線至MRS平板中，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，取活化后的單菌落接種于5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。傳代培養(yǎng)兩次，接種量為1%。

1.3.1.3 培養(yǎng)基發(fā)酵液中菌株濃度和pH值測(cè)定

將上述活化后的植物乳桿菌ZDY2013接種至4 mL BMRS培養(yǎng)基中，加入1 mL 10%（m/V）不同低聚糖使得其終濃度為2.0%（m/V），陽性對(duì)照組加入同濃度的葡萄糖，接種量為1%，厭氧培養(yǎng)24 h，每隔3 h測(cè)定發(fā)酵液OD600值和pH值，比較不同種類低聚糖對(duì)菌株生長的影響。

1.3.1.4 發(fā)酵乳的pH值及植物乳桿菌生長量的測(cè)定

在12%（m/V）脫脂乳液體中分別加入滅菌后15%、20%、25%、35%（m/V）的葡萄糖、低聚糖（低聚異麥芽糖、低聚木糖或兩種低聚糖的組合物），使發(fā)酵乳中葡萄糖或低聚糖的終濃度為1.5%、2.0%、2.5%和3.0%（m/V），其中低聚糖組合物的混合比為1:1，葡萄糖組為陽性對(duì)照組。取活化后的菌株以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于上述脫脂乳中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后測(cè)定發(fā)酵乳活菌數(shù)和pH值。

1.3.1.5 發(fā)酵乳中菌株生長曲線

根據(jù)1.3.1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以最高活菌計(jì)數(shù)為指標(biāo)，選取2種適宜濃度的低聚糖添加量作為菌株的生長條件，在BMRS培養(yǎng)基中分別加入菌種生長適宜濃度的低聚糖，靜置培養(yǎng)0～24 h時(shí)，每隔3 h取出發(fā)酵乳，測(cè)定發(fā)酵乳活菌數(shù)和pH值，測(cè)定菌株生長曲線。

1.3.2 冷藏期發(fā)酵乳指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)1.3.1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)間為發(fā)酵結(jié)束時(shí)間，并進(jìn)行4 ℃貯藏，貯藏期的1 d、7 d、14 d、21 d測(cè)定發(fā)酵乳中活菌數(shù)、pH值、持水性、抗氧化活性及蛋白水解能力。

1.3.2.1 冷藏期發(fā)酵乳pH值及活菌數(shù)變化

對(duì)冷藏期的發(fā)酵乳樣品（葡萄糖組為對(duì)照組）進(jìn)行取樣，采用梯度稀釋法對(duì)植物乳桿菌ZDY2013進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；使用電子pH計(jì)測(cè)定冷藏期各階段樣品的pH值。

1.3.2.2 持水性

持水性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[18]并稍作修改。稱取空的10 mL離心管質(zhì)量記為W0，加入5 mL成品發(fā)酵乳（葡萄糖組為對(duì)照組）質(zhì)量記為W1。在3000 r/min，4 ℃的條件下離心10 min。棄去上清液，稱取質(zhì)量記為W2，平行測(cè)定3次。持水力計(jì)算公式如下：

1.3.2.3 抗氧化活性

（1）DPPH自由基清除能力

對(duì)發(fā)酵乳（葡萄糖組為對(duì)照組）進(jìn)行8000 r/min離心10 min，再用0.44 μm濾膜過濾，獲得發(fā)酵乳清；取1.5 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L，95%甲醇作為溶劑）與0.5 mL的發(fā)酵乳清樣品或95%甲醇（對(duì)照）混合均勻，在室溫下反應(yīng)30 min。4 ℃條件下8000 r/min離心10 min，取上清液，于517 nm處測(cè)定吸光值。DPPH自由基清除率計(jì)算公式[19]如下：

式中：

A0——95%甲醇（對(duì)照）存在時(shí)的吸光值；

A1——加入乳清樣品的吸光值。

（2）ABTS+自由基清除能力

參照Perna等[20]的方法并作修改。先用95%乙醇溶液將ABTS溶液稀釋到OD734=0.700±0.020（A0）。將150 μL乳清樣品與3 mL ABTS溶液混合搖勻，避光反應(yīng)30 min后，在734 nm處測(cè)吸光度Ai，通過添加150 μL乙醇溶液代替樣品作為空白對(duì)照，測(cè)得吸光度為A0，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。ABTS+自由基清除能力計(jì)算公式如下：

式中：

A0——未添加樣品的吸光度；

Ai——添加不同樣品反應(yīng)后的吸光度。

（3）羥自由基清除能力

參照文獻(xiàn)[21]所述方法測(cè)定。首先將2.5 mmol/L鄰-菲羅琳溶液中，0.02 mol/L PBS（pH 7.4）和蒸餾水等體積混合，混合均勻后，加入等體積2.5 mmol/L FeSO4溶液和20 mmol/L H2O2溶液，充分混勻后，37 ℃恒溫水浴1 h。根據(jù)536 nm處吸光度變化判斷受試物清除羥自由基的能力。羥自由基清除率按下式計(jì)算。

式中：

Aa——發(fā)酵乳清代替蒸餾水的吸光度；

A1——混合液的吸光度；

Ab——蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度。

1.3.2.4 蛋白水解力

鄰苯二甲醛（OPA）溶液的配制參考Church等[22]的方法。OPA溶液的配制：混合100 mmol/L四硼酸鈉25 mL、20%十二烷基硫酸鈉2.5 mL、40 mg OPA溶解于1 mL甲醇、β-巰基乙醇100 μL，最后用去離子水稀釋到體積為50 mL。OPA試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。發(fā)酵乳樣品（葡萄糖組為對(duì)照組）2.5 mL與0.75%三氯乙酸5 mL，混合均勻并靜置10 min，4000 r/min離心10 min（4 ℃），收集上清液。取上清液150 μL，加入OPA試劑3 mL，混勻，室溫下反應(yīng)10 min后于340 nm測(cè)定吸光值。發(fā)酵乳樣品A340的值與蛋白水解力呈正比例關(guān)系，值越大，說明產(chǎn)生的游離氨基越多，從而反映蛋白的水解程度越高。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為平行測(cè)定三次的值，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用雙因素方差分析（Two-Way ANOVA）的Tukey多重檢驗(yàn)比較數(shù)據(jù)平均值的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)植物乳桿菌ZDY2013體外代謝的影響

植物乳桿菌ZDY2013全基因組測(cè)序結(jié)果顯示其具有多種碳水化合物代謝相關(guān)酶[23]，說明其可以代謝多種碳水化合物。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，功能低聚糖代替培養(yǎng)基中的葡萄糖可以顯著促進(jìn)乳酸桿菌的生長[24,25]。選取低聚木糖、低聚異麥芽糖及其組合物改良的培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行體外發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能以低聚木糖、低聚異麥芽糖及其組合物為碳源進(jìn)行生長代謝，且低聚異麥芽糖優(yōu)于低聚木糖（圖1a）。然而，菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期的生物量均不及以葡萄糖為碳源時(shí)，這可能是由于葡萄糖是小分子碳源，易于被代謝。植物乳桿菌ZDY2013利用不同碳源代謝前3 h比較緩慢，而進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間均為9 h。與此結(jié)論相一致的是，發(fā)酵上清pH值在3 h內(nèi)無明顯變化，在9 h之后均進(jìn)入穩(wěn)定期（圖1b）。另外本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖為碳源時(shí)，進(jìn)入穩(wěn)定期的pH值最低，而低聚木糖為碳源時(shí)最高，這與代謝最終生物量高低相反，說明植物乳桿菌ZDY2013代謝能力越強(qiáng)，pH值越低，這可能是由于其代謝產(chǎn)有機(jī)酸的原因[6]。綜上所述，不同碳源對(duì)植物乳桿菌ZDY2013的代謝有影響，而低聚異麥芽糖相比低聚木糖具有更強(qiáng)的促進(jìn)代謝能力。

圖1 不同碳源對(duì)植物乳桿菌ZDY2013生長代謝的影響Fig.1 The effect of carbon sources on metabolism ofL. plantarum ZDY2013

2.2 不同碳源濃度對(duì)植物乳桿菌ZDY2013發(fā)酵乳的影響

2.2.1 發(fā)酵乳中活菌數(shù)的差異

圖2 不同碳源濃度對(duì)發(fā)酵乳中活菌數(shù)的影響Fig.2 The effect of concentrations of different carbon sources on the viable count ofL. plantarum ZDY2013 in fermented milk

在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中添加益生元（如功能低聚糖）來開發(fā)功能性乳制品是未來乳品行業(yè)發(fā)展新趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，脫脂牛奶中添加同質(zhì)量濃度的低聚木糖、低聚異麥芽糖及其組合物有利于維持植物乳桿菌ZDY2013在發(fā)酵乳中的活菌濃度（圖2）。相比葡萄糖，添加1.5%和3.0%兩種低聚糖的組合糖提高植物乳桿菌ZDY2013在發(fā)酵乳中的濃度最顯著，分別達(dá)到9.33×108cfu/g（p＜0.001）和1.05×109cfu/g（p＜0.0001）。隨著低聚糖添加量的增加，發(fā)酵乳中活菌數(shù)并非一直遞增，尤其是單獨(dú)添加低聚木糖、低聚異麥芽糖時(shí)，植物乳桿菌的濃度均在108cfu/g左右，說明低聚糖添加量與發(fā)酵乳活菌數(shù)并非呈現(xiàn)線性增長關(guān)系。綜上結(jié)果表明，低聚木糖和低聚異麥芽糖的混合糖最適宜維持植物乳桿菌ZDY2013在發(fā)酵乳中的濃度。

2.2.2 發(fā)酵乳pH的差異

圖3 不同碳源濃度對(duì)發(fā)酵乳pH的影響Fig.3 The effect of concentrations of different carbon sources on pH in fermented milk

發(fā)酵乳最終pH值可以判定發(fā)酵乳的環(huán)境是否適合乳酸菌生存。由圖3可知，當(dāng)糖濃度為2.0%或者2.5%時(shí)，發(fā)酵乳的pH無顯著性差異，均在pH 5.20左右；當(dāng)糖濃度為1.5%或者3.0%時(shí)，低聚木糖和低聚異麥芽糖的組合組pH值均低于其他3個(gè)組，其中濃度為3.0%時(shí)有顯著差異（p＜0.0001）；隨著低聚糖添加量的增加，發(fā)酵乳的最終pH值并未發(fā)生明顯變化，除低聚木糖和低聚異麥芽糖的組合物濃度為3.0%，時(shí)pH為4.87，其余組pH值在5.07～5.19之間。說明低聚糖的添加量不容易影響發(fā)酵乳的最終酸堿環(huán)境，結(jié)合前期研究證實(shí)的植物乳桿菌ZDY2013具有耐受酸能力的結(jié)論[6]，表明該菌株在發(fā)酵乳環(huán)境中將保持良好活力。

2.2.3 發(fā)酵乳中菌株的生長

根據(jù)圖2結(jié)果，我們確定質(zhì)量濃度為1.5%和3.0%的低聚糖組合物為發(fā)酵乳的適宜添加量，在此進(jìn)一步對(duì)植物乳桿菌在該條件下的代謝特性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4。植物乳桿菌ZDY2013在兩種條件下的生長動(dòng)力學(xué)曲線相似，濃度均在12 h達(dá)到穩(wěn)定，分別為7.94×108cfu/g和1.05×109cfu/g，相比體外發(fā)酵約推遲3 h（圖1），說明菌株在添加低聚糖的發(fā)酵乳中生長代謝緩一點(diǎn)。特別的是，發(fā)酵乳的pH值均呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，且變化基本一致，說明菌株在發(fā)酵乳中持續(xù)產(chǎn)有機(jī)酸。

圖4 植物乳桿菌ZDY2013在低聚糖發(fā)酵乳中的生長特性Fig.4 The growth characterization ofL. plantarumZDY2013 in oligosaccharides fermented milk

2.3 冷藏期低聚糖發(fā)酵乳活菌數(shù)和pH變化

上述結(jié)果表明添加功能低聚糖組合物有利于提高發(fā)酵乳中植物乳桿菌的濃度以及降低發(fā)酵乳pH值。為進(jìn)一步探究這種特征可以維持多久，測(cè)定了冷藏期發(fā)酵乳中的活菌數(shù)和pH值。結(jié)果如圖5a所示，無論添加的是不同濃度低聚糖組合物還是對(duì)照的葡萄糖，活菌數(shù)在冷藏期均出現(xiàn)下降，下降趨勢(shì)類似，且在第21 d出現(xiàn)顯著差異（p＜0.0001），但是下降均不到一個(gè)數(shù)量級(jí)，這說明發(fā)酵乳在儲(chǔ)存期有效維持了植物乳桿菌較高活菌濃度（2.34×108cfu/g以上），這一結(jié)果與虞嬌嬌等[13]研究結(jié)果類似，其發(fā)現(xiàn)添加低聚果糖的發(fā)酵乳在冷藏期對(duì)瑞氏乳桿菌MB2-1具有一定的保護(hù)作用。發(fā)酵乳pH值在冷藏期也均發(fā)生相同下降趨勢(shì)，不同的是pH值在第7 d即發(fā)生顯著下降（p＜0.0001），隨后pH值處于維持狀態(tài)（圖5b）。然而，添加低聚糖組合物的發(fā)酵乳冷藏期的pH值高于對(duì)照的葡萄糖（pH 4.80左右），尤其是添加1.5%組合物的組，pH值停留著5.20左右。這可能是由于在低溫條件下植物乳桿菌代謝葡萄糖的能力更強(qiáng)，產(chǎn)生的有機(jī)酸更多，而添加益生元低聚糖能防止發(fā)酵乳在冷藏期的后酸化，改善其風(fēng)味和質(zhì)量[26]。

圖5 冷藏期發(fā)酵乳中的活菌數(shù)和pH變化Fig.5 Viable bacteria counts and pH value of fermented milk during refrigerated storage

2.4 冷藏期低聚糖發(fā)酵乳持水性變化

持水性是評(píng)價(jià)發(fā)酵乳質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，其與蛋白、固形物的的含量相關(guān)，良好品質(zhì)的發(fā)酵乳持水性高，乳清析出少，質(zhì)地均一粘稠。本研究發(fā)現(xiàn)，添加低聚糖的發(fā)酵乳持水性相比對(duì)照組更高，且隨著冷藏時(shí)間的延長，發(fā)酵乳的持水性顯著提高（圖6；p＜0.0001）。當(dāng)?shù)途厶墙M合物添加濃度為1.5%時(shí)，發(fā)酵乳的持水性從第7 d開始一直保持在90%以上，而濃度為3.0%時(shí)，持水性略低，從第14 d開始達(dá)到約90%，這可能是滲透壓差異導(dǎo)致的。整體而言，添加低聚糖更能改善發(fā)酵乳品質(zhì)，且不一定要高濃度，這對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義，添加適當(dāng)濃度的低聚糖才有利于增強(qiáng)發(fā)酵乳持水性。發(fā)酵乳良好的持水性主要是冷藏過程中，pH值變低，小分子肽和酪蛋白增加，后者在酸性的環(huán)境下相互作用形成三維空間膠體結(jié)構(gòu)，包容更多的水分子，從而提高了發(fā)酵乳的持水力[27,28]。

圖6 發(fā)酵乳在冷藏期間的持水性Fig.6 Water holding capacity of fermented milk during refrigerated storage

2.5 冷藏期低聚糖發(fā)酵乳抗氧化活性變化

發(fā)酵乳具有多種益生特性，抗氧化活性是發(fā)酵乳的一項(xiàng)重要功能，決定其貨架期和品質(zhì)。圖7為添加了功能低聚糖的植物乳桿菌發(fā)酵乳在冷藏期的抗氧化活性變化。添加不同濃度低聚糖組合物及對(duì)照組的發(fā)酵乳在冷藏期DPPH自由基清除率均高于60%，尤其是第7 d均達(dá)到最高90%左右（圖7a）。類似的ABTS+自由基清除率也從第7 d開始，由70%～80%下降到40%～50%（圖7b；p＜0.0001）。這些結(jié)果與Habibi Najafi等[29]觀察到含有菊粉和小麥纖維的發(fā)酵乳在冷藏期自由基清除率下降，以及李思寧等[30]在發(fā)酵乳冷藏期發(fā)現(xiàn)的DPPH自由基清除率的變化趨勢(shì)相似。這可能是由于冷藏期具有清除這些自由基的生物活性肽發(fā)生水解和裂解導(dǎo)致的[29]。另外，同等碳源濃度條件下，添加低聚糖的發(fā)酵乳自由基清除能力強(qiáng)于添加葡萄糖的發(fā)酵乳（p＜0.05），這可能與低聚糖能改善植物乳桿菌在發(fā)酵乳中的濃度和代謝產(chǎn)物的活性有關(guān)[10,31,32]，也可能與低聚木糖本身的抗氧化活性相關(guān)[15]。不同于DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力的變化，冷藏期發(fā)酵乳清除羥自由基的能力持續(xù)下降（圖7c；p＜0.0001）。相同質(zhì)量濃度的碳源條件下，添加低聚糖組合物的羥自由基的清除能力整體好于葡萄糖，尤其是濃度為3.0%時(shí)的第1 d和第7 d；而濃度為1.5%時(shí)，添加低聚糖組合物的發(fā)酵乳冷藏兩周后的羥自由基清除能力依然能維持70%左右，說明發(fā)酵乳中添加適量的功能低聚糖，有利于增強(qiáng)其抗氧化活性[30,33]。

圖7 發(fā)酵乳在冷藏期間的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of fermented milk during refrigerated storage

2.6 冷藏期低聚糖發(fā)酵乳蛋白水解活性變化

乳酸菌在發(fā)酵牛乳期間，分泌的胞外蛋白水解酶會(huì)水解牛乳蛋白，釋放游離氨基酸和小分子的肽，而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的抗氧化肽能發(fā)揮抗氧化活性[34]。測(cè)定添加功能低聚糖的植物乳桿菌發(fā)酵乳在冷藏期的蛋白水解活性可間接反映其抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，隨著冷藏時(shí)間延長，不同處理組的發(fā)酵乳蛋白水解活性持續(xù)增強(qiáng)，其在第14和21 d與第1 d有顯著性差異（p＜0.0001），推測(cè)其釋放了更多的游離氨基和肽。冷藏期間，添加1.5%或3.0%低聚糖組合物的發(fā)酵乳的蛋白水解活性均高于含相同濃度葡萄糖的發(fā)酵乳，且在相同時(shí)間點(diǎn)，添加1.5%低聚糖組合物的發(fā)酵乳的水解活性最高，這些結(jié)果與圖7抗氧化能力更強(qiáng)結(jié)論一致。

圖8 發(fā)酵乳在冷藏期間的蛋白水解活性Fig.8 Proteolytic activity of fermented milk during refrigerated storage

3 結(jié)論

植物乳桿菌ZDY2013發(fā)酵乳具有預(yù)防乳品被雜菌污染和恢復(fù)由產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌引起腸道穩(wěn)態(tài)紊亂的功能。本文選用該菌能利用的低聚木糖、低聚異麥芽糖作為益生元添加在乳品中進(jìn)行植物乳桿菌ZDY2013發(fā)酵，分析其對(duì)發(fā)酵乳活菌數(shù)和pH值的影響，并評(píng)價(jià)發(fā)酵乳在4 ℃冷藏期活菌數(shù)、pH值、持水性、以及抗氧化活性的變化特點(diǎn)。結(jié)果表明，添加低聚木糖和低聚異麥芽糖組合物的發(fā)酵乳能顯著改善植物乳桿菌的活菌數(shù)，維持菌株生存的較好環(huán)境，提高其品質(zhì)，增強(qiáng)其貨架期內(nèi)抗氧化活性。本研究為具有益生元特性的功能低聚糖在發(fā)酵乳中的應(yīng)用，及植物乳桿菌ZDY2013的功能深度開發(fā)奠定基礎(chǔ)。