高效液相色譜法同時測定吳茱萸－桂枝藥對水煎液中吳茱萸堿、吳茱萸次堿、桂皮醛、桂皮酸含量*

蘭 瑩，薛 瑩，江 陽

（四川省疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

吳茱萸－桂枝藥對是《金匱要略》中溫經(jīng)湯的核心藥對［1］。吳茱萸味苦辛、性溫熱，有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉功效，常用于治療嘔吐泄瀉、厥陰頭痛、高血壓等［2］。吳茱萸堿、吳茱萸次堿是吳茱萸的主要有效成分［3］，二者具有促進腫瘤細胞凋亡、保護心臟血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等藥理活性［4－6］，其中吳茱萸堿可通過下調(diào)NOD1通路誘導(dǎo)肝癌HepG2和SMMC－7721細胞凋亡［7］，吳茱萸次堿能明顯防治模型大鼠腹主動脈狹窄所致左室肥厚［8］。桂枝味辛、甘，性溫，有散寒解表、溫通經(jīng)脈、平?jīng)_降氣等功效，常用于治療風(fēng)寒感冒、血寒閉經(jīng)、水腫、心悸等癥［9］，桂皮醛、桂皮酸是其主要有效成分，二者可降低血壓、抑制腫瘤細胞生長、保護受損的心肌等［10－11］，且桂皮醛可能通過上調(diào)肝臟胰島素信號通路Akt而發(fā)揮降血糖作用，并可抑制食管癌鱗狀細胞癌細胞Eca109的增殖，促進其凋亡［12－13］，桂皮醛、桂皮酸對缺血性心肌損傷模型大鼠心臟還具有保護作用［14］。因此，檢測茱萸堿、吳茱萸次堿、桂皮醛、桂皮酸的含量對于評價吳茱萸－桂枝藥對的質(zhì)量有重要意義。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時檢測吳茱萸－桂枝藥對水煎液中上述4種成分的含量，為該藥對的質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity HPLCTM高效液相色譜儀，包括Empower 3.0色譜工作站，四元高壓泵系統(tǒng)，在線脫氣系統(tǒng)，自動進樣器，柱溫箱和TUV檢測器，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（美國Waters公司）；XS215型分析天平、XP6型微量天平（美國Mettler Toledo公司）；KQ－500D型超聲波清洗器（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）；KW8672J型離心機（北京京立離心機有限公司）。

1.2 試藥

吳茱萸藥材（批號為190816）、桂枝藥材（批號為186018），均購自鄭州張仲景大藥房；吳茱萸堿對照品（批號為50890－1806，含量≥99.6%），吳茱萸次堿對照品（批號為280375－181102，含量≥98.9%），桂皮醛對照品（批號為110710－201821，含量≥99.6%），桂皮酸對照品（批號為28573－1914，含量≥98%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil?Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min時7%A→18%A，8～16 min時18%A→36%A，16～25 min時36%A→60%A，25～37 min時60%A→100%A，37～42 min時100%A→7%A，42～47 min時7%A）；流速：1 mL／min；檢測波長：215 nm（10～20 min，吳茱萸堿、吳茱萸次堿），290 nm（25～38 min，桂皮醛、桂皮酸）；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

稱取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、桂皮醛、桂皮酸對照品各適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度分別為2.6420，2.2910，1.9655，1.7088 mg／mL的單一對照品貯備液；各取2.5 mL，置同一25 mL容量瓶中，加甲醇定容，得吳茱萸堿、吳茱萸次堿、桂皮醛、桂皮酸質(zhì)量濃度分別為0.26420，0.22910，0.19655，0.17088 mg／mL的混合對照品溶液。按吳茱萸－桂枝藥對比例（1∶1，m／m）稱取吳茱萸、桂枝各30 g，精密稱定，置500 mL圓底燒瓶中，一煎加360 mL水，提取2 h，藥液經(jīng)200目濾布濾過，得一煎水提液。藥渣加300 mL水，提取1 h，藥液經(jīng)200目濾布濾過，得二煎水提液。合并兩煎水提液，攪拌均勻，靜置2 h，得吳茱萸－桂枝藥對水煎液630 mL。精密量取25 mL，置離心管中，3000 r／min離心10 min，精密移取20 mL，置蒸發(fā)皿中水浴減壓蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按吳茱萸－桂枝藥對水煎液處方及工藝，制備缺吳茱萸、桂枝的陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：分別取2.2項下3種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)吸收峰，陰性對照無干擾。詳見圖1。4種成分峰理論板數(shù)均大于10000，分離度均大于2。

圖1 高效液相色譜圖1.evodiamine 2.rutecarpine 3.cinnamaldehyde 4.cinnamic acid A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取2.2項下混合對照品溶液適量，稀釋成吳茱萸堿質(zhì)量濃度為0.0264，0.0528，0.0793，0.5284，0.7926，2.6420 mg／mL，吳茱萸次堿為0.0229，0.0458，0.2291，0.4582，0.6873，2.2910 mg／mL，桂皮醛為0.0196，0.0393，0.0589，0.1966，0.5897，1.9655 mg／mL，桂皮酸為0.0170，0.0342，0.0512，0.1708，0.5126，1.7088 mg／mL的系列混合對照品溶液，各精密量取10 mL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各成分的質(zhì)量濃度（X，mg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程及線性范圍。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the linear relation test（n＝6）

精密度試驗：取供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果吳茱萸－桂枝藥對水煎液中吳茱萸堿、吳茱萸次堿、桂皮醛、桂皮酸峰面積的RSD分別為0.29%，0.06%，0.08%，0.26%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液適量，室溫下分別放置0，1，2，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿、桂皮醛、桂皮酸峰面積的RSD分別為1.33%，0.38%，1.66%，1.08%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品適量，各6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿、桂皮醛、桂皮酸平均含量分別為0.9819，0.5896，0.2135，0.6798 mg／g，RSD分別為0.81%，1.01%，1.22%，2.15%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）Tab.2 Results of the recovery test（n＝9）

2.4 樣品含量測定

取樣品，按2.2項下方法平行制備2份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg／g，n＝2）Tab.3 Results of content determination of four components in the sample（mg／g，n＝2）

3 討論

3.1 流動相選擇

預(yù)試驗中分別對甲醇－水、乙腈－水、乙腈－0.05%磷酸水溶液和乙腈－0.1%磷酸水溶液4個流動相系統(tǒng)進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈－0.1%磷酸水溶液作為流動相時，各色譜峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)，因此采用乙腈－0.1%磷酸水溶液統(tǒng)作為流動相。

3.2 色譜柱選擇

預(yù)試驗中分別考察了Agilent Eclipse XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Diamonsil?Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Welch XB C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Diamonsil?Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）效果較好，故以該色譜柱進行試驗。

3.3 檢測波長選擇

對4種成分對照品溶液分別進行紫外－可見全波長（190～400 nm）掃描，發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿、吳茱萸次堿在215 nm，桂皮醛、桂皮酸在290 nm處有最大吸收，鑒于吳茱萸－桂皮藥對中4種成分最大吸收波長不同，為保證各成分在最大吸收波長處檢測，提高靈敏度，減少干擾，故本試驗中采用了HPLC法波長切換技術(shù)。

3.4 方法評價

本研究中建立的HPLC法重復(fù)性好，可操作性強，結(jié)果準確、可靠，檢測效率高，可用于同時測定吳茱萸－桂皮藥對中茱萸堿、吳茱萸次堿、桂皮醛、桂皮酸等多組分含量，所建立方法可為吳茱萸－桂皮藥對的質(zhì)量評價提供參考。中藥成分復(fù)雜，不同藥物配伍后特征成分含量可能會發(fā)生變化，個別成分消失或有新成分生成，因此，后續(xù)可對吳茱萸－桂皮藥對進行指紋圖譜研究，從而可為合理評價吳茱萸－桂皮藥對的質(zhì)量提供更多參考。