長春西汀原料藥細菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究*

陳 晨，裴宇盛，杜 穎，蔡 彤，高 華

（中國食品藥品檢定研究院，北京 102629）

長春西汀為長春花中提取的一種生物堿，臨床用于改善腦梗死后遺癥、腦出血后遺癥、腦動脈硬化癥等誘發(fā)的各種癥狀，具有起效快、耐受性好、不良反應(yīng)小等特點，在腦血管疾病的治療中占有重要地位［1－2］。為避免長春西汀注射液在生產(chǎn)過程中帶來的質(zhì)量風(fēng)險，保證用藥安全，有必要嚴格控制其原料的細菌內(nèi)毒素含量。長春西汀原料藥為白色晶狀粉末且?guī)缀醪蝗苡谒?，需使其溶解至澄清溶液后再進行細菌內(nèi)毒素檢驗，否則不溶性微粒中可能包裹細菌內(nèi)毒素導(dǎo)致假陰性結(jié)果［3］。受企業(yè)委托，根據(jù)2015年版《中國藥典（四部）》附錄1143細菌內(nèi)毒素檢查法的要求，對其原料藥細菌內(nèi)毒素的測定進行方法學(xué)研究，為該類產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考，進而對如何溶解不溶性樣品，溶解后是否對試驗造成干擾，以及難溶性樣品陽性對照如何制備等問題提供了新的解決思路?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AE240型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Vortex－Genie2型渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；ELX－808型細菌內(nèi)毒素測定儀（美國BioTek儀器公司）；WNE45型恒溫水浴鍋（德國Memmert公司）。

1.2 試藥

長春西汀原料藥（河南潤弘制藥股份有限公司，批號代號分別為A，B，C）；0.1 mol／L鹽酸標準滴定溶液（中國食品藥品檢定研究院）；酒石酸（湖南爾康制藥股份有限公司，批號為102620180401）；鱟試劑（廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號為171211，檢測限為0.005～50 EU／mL；湛江安度斯生物有限公司，批號為1802052，靈敏度為0.03 EU／mL；廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號為18011001，靈敏度為0.03 EU／mL）；細菌內(nèi)毒素國家標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150800－201601，單支效價為9000 EU）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號為171211；湛江安度斯生物有限公司，批號為1810260）；Tris緩沖液（湛江安度斯生物有限公司，批號為1808240）。

2 方法與結(jié)果［4－5］

2.1 限值確定

藥品的細菌內(nèi)毒素限值（L）＝K／M，式中，K為人每千克體質(zhì)量每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU／（kg·h）表示，M為人用每1 kg體質(zhì)量每1 h的最大供試品劑量，以mL／（kg·h）、mg／（kg·h）或U／（kg·h）表示，長春西汀原料藥供生產(chǎn)注射劑使用，以注射劑的K值為5 EU／（kg·h）計算，人均體質(zhì)量按60 kg計算，則成人每1 h最大可接受的內(nèi)毒素劑量為300 EU；依據(jù)長春西汀注射液說明書要求，成人一次最大給藥劑量為30 mg，溶入500 mL 0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液緩慢滴注（＜80滴／分），則樣品內(nèi)毒素限值為（300 EU－0.5 EU／mL×500 mL）÷（30 mg÷3）＝5 EU／mg；為嚴格控制成品質(zhì)量，依據(jù)從嚴原則，企業(yè)期望將長春西汀原料細菌內(nèi)毒素的L擬訂為每1 mg長春西汀原料藥中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于1.67 EU。

2.2 光度測定法

2.2.1 標準曲線可靠性驗證試驗

按藥典細菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進行鱟試劑的標準曲線可靠性試驗，動態(tài)顯色法鱟試劑經(jīng)細菌內(nèi)毒素國家標準品檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。

2.2.2 干擾試驗及供試品內(nèi)毒素含量檢測

1）樣品溶液制備

取長春西汀原料藥適量，精密稱定，加入細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，制成含長春西汀20 mg／mL的樣品溶液。若長春西汀溶解性差，可置37℃恒溫水浴中加熱助溶，或加入適量助溶劑。

2）有效稀釋倍數(shù)（MVD）計算

公式為MVD＝L×C／λ。式中，L為長春西汀的細菌內(nèi)毒素限值（1.67 EU／mg），C為樣品溶液質(zhì)量濃度（20 mg／mL），λ為鱟試劑標示靈敏度（0.005 EU／mL）。則長春西汀的對應(yīng)最大有效稀釋倍數(shù)為，MVD0.005＝1.67（EU／mg）×20（mg／mL）／0.005（EU／mL）＝6680倍。本試驗中選擇稀釋1000倍進行檢測。

3）試驗操作

標準曲線：取細菌內(nèi)毒素國家標準品，用細菌內(nèi)毒素檢查用水50，5，0.5，0.05，0.005 EU／mL系列標準品溶液，每個濃度做2個平行孔檢測。使用0.1 mL標準內(nèi)毒素＋0.1 mL動態(tài)顯色法鱟試劑進行檢測。以細菌內(nèi)毒素濃度（C）對數(shù)值（lg C）為橫坐標，達預(yù)設(shè)吸光度（OD）值反應(yīng)時間（T）對數(shù)值lg T為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程lg T＝6.18－0.225 lg C。

樣品溶液：取2.2項下3批次的樣品溶液，加適量0.1 mol／L鹽酸溶液，使樣品溶液呈澄清液體，以稀釋劑（如Tris緩沖液）調(diào)pH為6.0～8.0，先使用細菌內(nèi)毒素檢查用水將長春西汀稀釋100倍后，再用Tris緩沖液稀釋10倍。樣品溶液做2個平行孔，使用0.1 mL樣品溶液及0.1 mL動態(tài)顯色法鱟試劑檢測。取3個批次的長春西汀原料藥，分別與酒石酸銨1∶0.5（m／m）取樣，用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，制成含長春西汀20 mg／mL的樣品溶液，置37℃恒溫水浴中加熱助溶并振蕩，同法加入Tris緩沖液稀釋并調(diào)pH為6.0～8.0。樣品溶液做2個平行孔，使用0.1 mL樣品溶液及0.1 mL動態(tài)顯色法鱟試劑檢測。

樣品回收溶液：采用預(yù)先添加標準內(nèi)毒素的方法，取2種助溶劑配制的含20 mg／mL的長春西汀溶液0.1 mL，分別加入10μL 5000 EU／mL細菌內(nèi)毒素標準溶液，用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，置37℃恒溫水浴中加熱助溶并振蕩，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋100倍，然后再用Tris緩沖液稀釋10倍。使細菌內(nèi)毒素的最終含量為0.5 EU／mL，再加入0.1 mL鱟試劑，做回收率檢測，每個稀釋度的樣品回收溶液做2個平行孔，使用0.1 mL樣品回收溶液及0.1 mL動態(tài)顯色法鱟試劑檢測。

陰性對照：以細菌內(nèi)毒素檢查用水作陰性對照，做2個平行孔，使用0.1 mL陰性對照及0.1 mL動態(tài)顯色法鱟試劑檢測。

4）試驗結(jié)果

結(jié)果見表1。使用鹽酸為助溶劑的樣品回收率不在50%～200%間，認為在此試驗條件下樣品溶液存在干擾；使用酒石酸為助溶劑的樣品回收率符合規(guī)定，且內(nèi)毒素含量小于限值要求，3批樣品均符合規(guī)定。

表1 長春西汀內(nèi)毒素檢測結(jié)果Tab.1 Results of the endotoxin test of vinpocetine

2.2.3 高酸度對細菌內(nèi)毒素的影響

上述試驗未考察高酸度對樣品本身所含內(nèi)毒素的影響，故模擬預(yù)先添加內(nèi)毒素的方法，驗證在添加2種助溶劑時的酸度（0.1 mol／L的鹽酸和10 mg／mL的酒石酸）是否會破壞細菌內(nèi)毒素，對試驗造成干擾，從而影響結(jié)果。

1）試驗操作

標準曲線：同2.2.2試驗操作項下方法，得回歸方程lg T＝6.05－0.228 lg C（r＝0.999）。

樣品溶液：取0.1 mol／L的鹽酸和10 mg／mL的酒石酸溶液先用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋1000倍，作為樣品溶液，樣品溶液做2個平行孔，使用0.1 mL樣品溶液及0.1 mL動態(tài)顯色法鱟試劑檢測。

樣品回收溶液：取0.1 mol／L的鹽酸和10 mg／mL的酒石酸溶液各0.1 mL，分別加入10μL 5000 EU／mL的細菌內(nèi)毒素標準溶液，用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋1000倍，使最終細菌內(nèi)毒素含量為0.5 EU／mL，再加入0.1 mL鱟試劑，做回收率檢測，每個稀釋度的樣品回收溶液做2個平行孔，使用0.1 mL樣品回收溶液及0.1 mL動態(tài)顯色法鱟試劑檢測。

陰性對照：同2.2.2項下方法進行試驗。

2）試驗結(jié)果

鹽酸助溶劑回收率（8.90%）不在50%～200%間，認為0.1 mol／L的鹽酸可能會破壞細菌內(nèi)毒素，對檢測結(jié)果有影響，而10 mg／mL的酒石酸（回收率132.9%）則對細菌內(nèi)毒素?zé)o破壞作用，樣品內(nèi)毒素濃度＜5 EU／mL。

2.3 凝膠法

2.3.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

按藥典細菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進行鱟試劑的標示靈敏度復(fù)核，結(jié)果見表2。2批鱟試劑經(jīng)細菌內(nèi)毒素國家標準品檢查，λC結(jié)果均符合規(guī)定。

表2 鱟試劑靈敏度復(fù)核Tab.2 Recheck results of the sensitivity of tachypleus amebocyte lysate

2.3.2 干擾預(yù)試驗

樣品溶液配制：將長春西汀和酒石酸按1∶0.5（m／m）稱定質(zhì)量，用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，制備成含長春西汀20 mg／mL、酒石酸10 mg／mL的樣品溶液。若長春西汀溶解性差，可置37℃恒溫水浴中加熱助溶。

MVD計算：公式為MVD＝L×C／λ。式中，L，C，λ均同2.2.2項下公式，目前市售產(chǎn)品通常為0.03～0.5 EU／mL。樣品溶液的對應(yīng)最大有效稀釋倍數(shù)為，MVD0.5＝1.67（EU／mg）×20（mg／mL）／0.5（EU／mL）＝66.8倍，同法計算，MVD0.25，MVD0.125，MVD0.06，MVD0.03分別為133.6，267.2，534.4，1068.8倍，選用120，240，480，960倍4個稀釋倍數(shù)進行試驗。

試驗操作：取2.2.2項下樣品溶液，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至120倍，再使用Tris緩沖液將樣品溶液分別稀釋240，480，960倍，將該系列濃度溶液記為NPC。同時加入細菌內(nèi)毒素標準溶液，使其均含有2λ的細菌內(nèi)毒素，記該系列溶液為PPC。取2個不同廠家的鱟試劑（批號分別為1802052，1801011），分別與上述PPC和NPC進行反應(yīng)，每個濃度重復(fù)2管，并設(shè)陽性對照（PC）和陰性對照（NC）。

試驗結(jié)果：結(jié)果見表3。3批長春西汀原料至少需稀釋至480倍（即長春西汀質(zhì)量濃度為0.042 mg／mL）對2個廠家的鱟試劑均無干擾作用。

表3 長春西汀干擾預(yù)試驗結(jié)果Tab.3 Results of the interference pre－test of vinpocetine

2.3.3 干擾試驗

取2.2.2項下樣品溶液，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋120倍，然后再用Tris緩沖液稀釋480倍，按藥典中的“細菌內(nèi)毒素檢查法 凝膠法干擾實驗”項，使用靈敏度為0.03 EU／mL的鱟試劑進行試驗，結(jié)果見表4。表中Es和Et分別為系列標準溶液、樣品溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值。正式干擾試驗結(jié)果表明，3批樣品對2個廠家鱟試劑的Es和Et均在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)，均符合鱟試劑靈敏度復(fù)核的要求，確認在480倍（質(zhì)量濃度為0.042 mg／mL）稀釋下無干擾作用。且內(nèi)毒素含量均小于1.67 EU／mg，符合企業(yè)期望的質(zhì)量標準。

表4 樣品溶液的干擾試驗結(jié)果（EU／mL）Tab.4 Results of the interference test of sample solution（EU／mL）

2.3.4 細菌內(nèi)毒素檢查

分別選擇上述2個廠家靈敏度為0.03 EU／mL的鱟試劑，樣品稀釋480倍，L按小于1.67 EU／mg為判定標準，對上述3批長春西汀原料藥細菌內(nèi)毒素進行檢查，結(jié)果見表5。結(jié)果，3批樣品均符合規(guī)定。

表5 樣品溶液的細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab.5 Results of the bacterial endotoxin test of sample solution

3 討論

長春西汀原料藥幾乎不溶于水，酸性助溶劑能增加其溶解性，預(yù)試驗中以鹽酸作助溶劑使其成為澄清溶液，但動態(tài)顯色法試驗結(jié)果表明回收率低于50%，對試驗造成干擾，發(fā)現(xiàn)是由于鹽酸的酸性太強，使用Tris緩沖液稀釋后無法將其pH調(diào)至內(nèi)毒素試驗要求范圍內(nèi)，因此不能作為該樣品的助溶劑。

通過研究長春西汀注射液的工藝發(fā)現(xiàn)，其采用酒石酸作為助溶劑，因此本試驗中以酒石酸溶解長春西汀原料藥，試驗結(jié)果未受干擾，符合細菌內(nèi)毒素光度測定法的要求，且樣品內(nèi)毒素含量遠低于企業(yè)期望限值?？紤]到全國對細菌內(nèi)毒素檢測方法的使用現(xiàn)狀，又進行了凝膠法研究，結(jié)果表明，在酒石酸的助溶下，長春西汀原料需稀釋至480倍時（長春西汀質(zhì)量濃度為0.042 mg／mL），對2個廠家的鱟試劑均無干擾作用，使用0.03 EU／mL的鱟試劑所建立的方法可用于長春西汀原料藥的細菌內(nèi)毒素檢查，故長春西汀原料藥采用細菌內(nèi)毒素檢查是可行的，可采用細菌內(nèi)毒素檢查法進行質(zhì)量控制，確定其質(zhì)量標準為限值應(yīng)低于1.67 EU／mg。

對于難溶樣品，為準確檢測出細菌內(nèi)毒素含量，需尋找一種能完全溶解樣品的方法，從而進行后續(xù)研究，因此溶解樣品的方法尤為重要。目前溶解難溶性樣品的方法包括加熱、乳化、萃取、離心，以及加入適合的助溶劑等，需根據(jù)樣品本身的特性，盡量尋找不對試驗產(chǎn)生干擾的方法，如需選擇助溶劑溶解，應(yīng)首選制劑輔料相關(guān)的試劑。此外，還應(yīng)注意藥典中相關(guān)規(guī)定，為了確保溶解樣品的方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，應(yīng)預(yù)先添加標準內(nèi)毒素再稀釋樣品進行干擾試驗，在確定無干擾后，再進行細菌內(nèi)毒素檢查，為了方便試驗，在未改變試驗條件的情況下，也可使用后加標準內(nèi)毒素的方法制備陽性對照。本研究中對長春西汀原料藥細菌內(nèi)毒素測定進行方法學(xué)研究，為進一步對難溶性藥物的細菌內(nèi)毒素方法學(xué)研究提供了參考。