絲素蛋白在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用

蔡佳麗 陳菲菲 蔣鳴謙 宋宇航 楊婉瑩

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 廣東廣州 510642）

蠶絲是人類最早利用的動(dòng)物纖維之一。作為優(yōu)良的絲織材料，蠶絲以其華麗的光澤和柔滑舒適的穿著感成為紡織材料中的貴族。隨著生命科學(xué)和材料科學(xué)發(fā)展的日新月異，這一古老的紡織材料成為生物醫(yī)學(xué)材料研發(fā)的焦點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到組織工程開發(fā)中。文章將著重介紹絲素蛋白的結(jié)構(gòu)、功能特性及在生物材料領(lǐng)域中的應(yīng)用研究，為絲素蛋白作為生物材料的進(jìn)一步開發(fā)研究提供參考。

1 絲素蛋白的結(jié)構(gòu)

蠶絲主要由絲膠（sericin）和絲素蛋白（fibroin）組成，兩者在氨基酸組成和結(jié)構(gòu)性能上存在差異。絲素蛋白約占蠶絲總質(zhì)量的70～75%，是蠶絲的主要組成成分。絲素蛋白由18 種氨基酸組成，其中絲氨酸（serine）、丙氨酸（alanine）和甘氨酸（glycine）3 種氨基酸約占其氨基酸總量的87%。絲素蛋白中存在兩種區(qū)域：以甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸殘基為主構(gòu)成的整齊且有序的結(jié)晶區(qū)；以苯丙氨酸（phenylalanine）、酪氨酸（tyrosine）、色氨酸（tryptophan）等其他氨基酸殘基構(gòu)成的松散且無(wú)序的非結(jié)晶區(qū)[1-2]。

目前一致認(rèn)為絲素蛋白由H 鏈、L 鏈及糖蛋白P25 組成，分子比為6∶6∶1。絲素蛋白主要含有Silk I 型和Silk II型兩種分子構(gòu)象，其中Silk I 型是介于α-螺旋和β-折疊之間的一種中間形態(tài)的分子構(gòu)象，而Silk II 型是一種反平行β-折疊層狀結(jié)構(gòu)。通常在不同的溶液條件和溫度影響下，Silk I容易向Silk II 轉(zhuǎn)變[3]。另外，Valluzzi 等（1999）發(fā)現(xiàn)了一種特殊的Silk III 型絲素結(jié)晶形態(tài)，立體結(jié)構(gòu)為3-折疊螺旋，其主要存在于絲素溶液-空氣界面上，說(shuō)明絲素蛋白材料的理化特性以及機(jī)械性能正是取決于其特殊的分子結(jié)構(gòu)[4]。

2 絲素蛋白材料的特性

2.1 絲素蛋白的力學(xué)性能

絲素蛋白中結(jié)晶區(qū)緊密的β-折疊結(jié)構(gòu)，使其擁有較高的抗拉伸性和良好的韌性，而非結(jié)晶區(qū)的雜亂無(wú)序和較多的極性基團(tuán)，又能使其獲得較好的彈性和延展性。雖然天然絲素材料有良好的力學(xué)性能，但再生絲素蛋白的力學(xué)性能因絲素蛋白分子原有的部分結(jié)構(gòu)遭到破壞而有所下降，這種差異可歸因于再生材料缺乏適當(dāng)?shù)亩?jí)和分級(jí)結(jié)構(gòu)[5]。由于絲素蛋白結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能之間的關(guān)系，其被應(yīng)用在生物材料領(lǐng)域時(shí)，需要在再生過(guò)程中操縱其結(jié)構(gòu)，以提升力學(xué)性能，甚至可以顯著提高再生絲產(chǎn)品的強(qiáng)度，使其達(dá)到天然纖維水平甚至更高[6]。

對(duì)蠶絲蛋白結(jié)構(gòu)的改造研究仍處于概念驗(yàn)證階段，且主要與再生纖維有關(guān)。為了提高再生絲材料的強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率，必須進(jìn)行更多的嘗試。如果可以根據(jù)應(yīng)用需求將機(jī)械性能調(diào)整到要求的水平，那么蠶絲在各種組織工程中的應(yīng)用前景將得到改善。

2.2 絲素蛋白的生物相容性

生物相容性是指材料與生物體之間相互作用后產(chǎn)生的各種反應(yīng)，包括生物反應(yīng)、物理反應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)等。絲線縫合的成功使蠶絲蛋白成為一種具有良好生物相容性的材料。在絲素蛋白的18 種氨基酸中，有11 種氨基酸為人體必需的氨基酸，且蠶絲無(wú)毒無(wú)污染，具有良好的抑菌效果和一定的抗紫外線效果。其吸濕能力和保濕能力優(yōu)良，致敏性極低。但是，由于其非哺乳動(dòng)物來(lái)源，與引起異物反應(yīng)的其他非自體生物材料一樣，不能排除某些與蠶絲蛋白相關(guān)的免疫排斥反應(yīng)。

迄今為止，科研人員已經(jīng)進(jìn)行了大量絲素支架的免疫原性和抗原性實(shí)驗(yàn)測(cè)試。Zhou 等（2010）在皮下植入電紡纖維墊長(zhǎng)達(dá)8 周，在這個(gè)過(guò)程中盡管觀察到吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞有一些典型的積累，但沒有出現(xiàn)感染跡象。根據(jù)蘇木精和曙紅染色組織的顯微鏡檢查，只有極少免疫細(xì)胞產(chǎn)生微弱炎癥[7]。Wang 等（2008）將蠶絲3-D 支架皮下植入Lewis 大鼠中，在飼養(yǎng)一年后，檢測(cè)皮下組織的TNF-α、IFN-δ、IL-4、IL-6 和IL-13 等炎癥因子指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)只會(huì)產(chǎn)生非常輕微的免疫反應(yīng)[8]。這說(shuō)明與聚乳酸和膠原蛋白等其他常用的生物材料比較，經(jīng)過(guò)適當(dāng)脫膠和滅菌的蠶絲產(chǎn)品具有良好的生物相容性[9]。

2.3 絲素蛋白的可降解性

作為一種生物醫(yī)學(xué)材料，生物降解性是材料選擇的一項(xiàng)重要指標(biāo)。生物降解性是指生物材料在生理環(huán)境下發(fā)生分解、溶解或生分子量下降，降解產(chǎn)物可以被機(jī)體吸收或釋放出體外的性質(zhì)。絲素蛋白材料無(wú)論是何種形態(tài)，在合適的酶作用下都可以被最終降解，決定其降解速率的一個(gè)重要因素即材料的微觀結(jié)構(gòu)。降解過(guò)程中，降解速度由快到慢依次為材料中的無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)部分、Silk I 結(jié)構(gòu)、Silk II 結(jié)構(gòu)。Hu Y等（2012）發(fā)現(xiàn)調(diào)整Silk II 結(jié)構(gòu)的含量后可以有效改變絲素蛋白材料的降解速率[10]。Wang等人證明了蠶絲蛋白在生物體內(nèi)的可降解性，他們的研究表明，水凝膠絲素3D 支架植入Lewis 大鼠后，在幾周內(nèi)就出現(xiàn)裂解，并在一年后完全消失。宿主免疫系統(tǒng)對(duì)三維絲素蛋白多孔支架的降解有顯著影響，絲素海綿的降解由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)，這表明絲素不僅可降解，而且可以被機(jī)體有效吸收[8]。

3 絲素蛋白在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用

目前，在組織工程技術(shù)研究中，應(yīng)用的生物材料大多數(shù)是通過(guò)化學(xué)合成，其最大問(wèn)題是降解后會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，不能大范圍使用。天然生物材料具有較好的可降解性且無(wú)毒害，如明膠、膠原、殼聚糖、海藻酸鹽等。近年來(lái)，絲素蛋白作為生物材料在組織工程中的研究越來(lái)越深入，應(yīng)用也日益廣泛。

3.1 骨組織

骨組織工程當(dāng)前研究的重要方向是制備具有骨再生功能且可生物降解的支架材料。絲素蛋白成為骨組織工程的重點(diǎn)開發(fā)對(duì)象，可形成各種形式的絲素蛋白生物材料，如絲素膜、絲素水凝膠、絲素多孔支架等。

在骨組織修復(fù)應(yīng)用中，絲素蛋白可以作為引導(dǎo)骨組織再生（guide bone regeneration，GBR）膜的重要材料來(lái)源，并通過(guò)先進(jìn)的技術(shù)來(lái)改良其性能，對(duì)骨缺損修復(fù)起到重要作用。在骨組織工程所需的支架材料中，絲素蛋白可以提供細(xì)胞生長(zhǎng)、附著和分化的空間。但由于再生的絲素蛋白力學(xué)性能大大降低，且單一絲素蛋白材料制成的支架在植入體內(nèi)后會(huì)因?yàn)樗y以成形，細(xì)胞附著能力也不強(qiáng)，導(dǎo)致支架的強(qiáng)度和應(yīng)用效果都不能滿足需求[11]。

近年來(lái)，研究人員更加致力于研究能夠滿足力學(xué)性能和抗壓指標(biāo)，具有良好骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，同時(shí)保有材料良好的生物相容性及降解性的絲素蛋白復(fù)合材料。目前，在復(fù)合材料中應(yīng)用較為廣泛的一種主要無(wú)機(jī)成分即羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA），絲素蛋白無(wú)論是作為支架主要組成還是表面修飾材料，都會(huì)提高支架的生物力學(xué)性能[12]。另一種被廣泛關(guān)注的復(fù)合材料是絲素/殼聚糖復(fù)合材料，將兩者按一定比例交聯(lián)，冷凍干燥后制成三維多孔支架，牛涵波等人的研究表明，兩者質(zhì)量比為1∶1 時(shí)，支架性能最好，且實(shí)驗(yàn)中加入碳化二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）交聯(lián)劑，可以提升支架穩(wěn)定性[13]。此外，具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性的硅基材料，也得到了學(xué)者們的關(guān)注，硅基材料由于質(zhì)地輕脆，無(wú)法作為單一的支架材料使用，但可以和絲素蛋白共混獲得復(fù)合材料來(lái)提升力學(xué)性能和骨傳導(dǎo)性等。通過(guò)生物礦化得到的絲素蛋白/硅基復(fù)合材料，不但提升了支架材料的生物活性，相較化學(xué)方法還能夠減少有毒物質(zhì)的引進(jìn)，保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性[14]。

3.2 血管組織

絲素蛋白特殊的氨基酸排列結(jié)構(gòu)使它具有一定的抗凝血功能，同時(shí)還具有抗血栓形成的表面，對(duì)高剪切應(yīng)力和血流壓力具有良好的抵抗力[15]。將蠶絲蛋白用于人造血管的材料中，不但具有良好的生物相容性，還有利于人造血管的內(nèi)皮細(xì)胞定植生長(zhǎng)。

絲素蛋白雖然具有一定的止血作用，但單一材料制成人造血管，其抗凝血能力在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中效果不佳。徐清棟等（2018）在研究中以絲素蛋白為主要材料，混入一定比例的明膠制備成復(fù)合材料，絲素與明膠比為8∶2 時(shí)，復(fù)合材料的止血性能最佳，同時(shí)其生物相容性也有所提高[16]。此外，加入甘油可增加材料的難溶性，亦可提高止血性能。余劭婷等（2019）人利用層層組裝法（layer-by-layer selfassembly，LBL）在絲素蛋白表面構(gòu)建再生絲素蛋白（regenerated silk fibroin protein，RSF）和殼聚糖多層膜，顯著提高了人工血管材料的生物相容性[17]。

3.3 神經(jīng)組織

每年有數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人遭受周圍神經(jīng)損傷，人的神經(jīng)系統(tǒng)大致分為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）和周圍神經(jīng)系統(tǒng)（peripheral nervous system，PNS）。PNS 能夠自我修復(fù)輕度傷害，而大的損傷需要通過(guò)在身體其他部位收獲的神經(jīng)移植物進(jìn)行手術(shù)治療。自體神經(jīng)移植由于術(shù)后并發(fā)癥和自體神經(jīng)量有限的問(wèn)題，并不能很好地滿足醫(yī)療需求，因此可使用人工神經(jīng)移植物橋接來(lái)達(dá)到修復(fù)目的，但人工神經(jīng)移植物的修復(fù)能力遠(yuǎn)比不上自體神經(jīng)。

尋找合適的生物材料來(lái)提高人工神經(jīng)的修復(fù)能力是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。Yang 等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白在不影響其正常表型或功能性的情況下支持背根神經(jīng)節(jié)和其細(xì)胞的活力[18]。除了膠原/絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管研究之外，占蓓蕾等人的研究發(fā)現(xiàn)，在絲素蛋白中混入絲膠蛋白可以大大提高材料的機(jī)械強(qiáng)度，制備機(jī)械強(qiáng)度優(yōu)良的高仿生絲膠蛋白/絲素蛋白共混材料人工神經(jīng)導(dǎo)管[19]。趙亞紅等研究發(fā)現(xiàn)，以3D 打印技術(shù)與靜電紡絲法相結(jié)合所制備出的聚吡咯/絲素蛋白（PPy/SF）纖維基導(dǎo)電型復(fù)合支架，支架穩(wěn)定性強(qiáng)，生物相容性好，有助于背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的粘附生長(zhǎng)和軸突的延伸生長(zhǎng)[20]。

3.4 皮膚組織

皮膚是人體第一大器官，也是重要的第一道屏障，皮膚大面積受損難以自愈時(shí)會(huì)導(dǎo)致皮膚完整性喪失，甚至導(dǎo)致死亡。成年人的皮膚主要由表皮（角質(zhì)化層）和真皮（富含膠原蛋白的層）組成。毛發(fā)和激素腺等附屬物從表皮上長(zhǎng)出，但根深蒂固在真皮內(nèi)。這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使皮膚工程成為一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。

絲素蛋白能很好地支持人類角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[21]。用絲素蛋白制成的皮膚敷料可以幫助皮膚得到更快的修復(fù)。理想的皮膚敷料應(yīng)該具有生物相容性好、力學(xué)性能接近人體皮膚、粘附性適宜的同時(shí)，還應(yīng)具有透氣性、平衡創(chuàng)面環(huán)境濕度溫度、抑菌促愈以及三維結(jié)構(gòu)維持時(shí)間久，保證血管和成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入等特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究絲素蛋白作為主要材料來(lái)制備各種形式的敷料時(shí)，主要是以絲素水凝膠形式進(jìn)行。單穎慧等（2015）通過(guò)靜電紡絲法將黃芪裝載于絲素/明膠納米纖維膜中，得到一種載藥納米纖維敷料，生物相容性好，促進(jìn)皮膚創(chuàng)口愈合且能抑制疤痕形成[22]。汪宜宇等（2017）用冷凍干燥復(fù)合技術(shù)制備一種具備不對(duì)稱雙層結(jié)構(gòu)的、以絲素和海藻酸鈉為主要成分組成的穩(wěn)定的多孔支架材料，通過(guò)對(duì)正常皮膚組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物模擬，解決了單層結(jié)構(gòu)支架力學(xué)性能差的問(wèn)題。這種支架還能夠加快毛細(xì)血管新生，具有良好生物相容性和膨潤(rùn)性，同時(shí)孔徑結(jié)構(gòu)也有助于細(xì)胞生長(zhǎng)[23]。周晗磊將構(gòu)建的負(fù)載納米銀的膠原-絲素蛋白真皮支架植入皮膚創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)這種絲素蛋白復(fù)合材料能促進(jìn)新生組織生長(zhǎng)，減少創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)[24]。

3.5 藥物緩釋載體

藥物緩釋是指使藥物緩慢進(jìn)入血液以降低血液中的藥物濃度，所以制備能使被承載的藥物緩慢釋放的載體材料是非常必要的?，F(xiàn)今常見的材料包括殼聚糖、水凝膠、聚羥基丁酸酯等。絲素蛋白也因其優(yōu)良特性在藥物緩釋中得到應(yīng)用。張海云（2015）以絲素蛋白與Fe3O4納米顆粒為主要材料，制備成一種具有磁靶向的復(fù)合微球藥物載體，其具有藥物靶向釋放能力，可以有效提高藥物利用率和控制藥物緩釋，并證明了具備良好流動(dòng)性后的絲素蛋白水凝膠的藥物傳遞效率也較高[25]。丁彪等（2018）以肖頓-鮑曼（Schotten-Baumann）化學(xué)合成法加工處理制備獲得的絲膠氨基酸表面活性劑和絲素氨基酸表面活性劑，可以作為開發(fā)抗癌藥物緩釋載體的實(shí)驗(yàn)原料，得到的緩釋載體性能穩(wěn)定且緩釋效果良好[26]。

3.6 生物傳感器

生物傳感器（biosensor）是一種對(duì)生物物質(zhì)敏感，并能將生物活性表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器，其分子識(shí)別部分（敏感元件）是由固定化的生物敏感材料制成。絲素蛋白膜可以滿足底物與產(chǎn)物的滲透，不影響酶促反應(yīng)，使酶可以被長(zhǎng)期固定與貯存。同時(shí)，絲素蛋白具有一定的柔韌性和良好的生物相容性，使其固定酶的同時(shí)也可以保持酶活性，故可以作為穩(wěn)定酶活的有效載體，如以復(fù)合材料的形式被制作成微針生物傳感器來(lái)監(jiān)測(cè)血糖[27]。康天放等（2016）利用戊二醛作為交聯(lián)劑，將乙酰膽堿酶固定在再生絲素蛋白上，再將再生絲素蛋白與碳糊電極固定，獲得的生物傳感器可以用于有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯農(nóng)藥檢測(cè)，效果較好[28]。

4 結(jié)束語(yǔ)

絲素蛋白因其良好的生物相容性和降解后無(wú)毒害作用，成為生物醫(yī)學(xué)材料研究領(lǐng)域的新寵。通過(guò)與其他有機(jī)或無(wú)機(jī)材料混合制備成復(fù)合材料來(lái)提升其力學(xué)性能成為研究的主流。目前，除了在組織工程中研究較為廣泛以外，絲素蛋白還被應(yīng)用到生物傳感器和藥物緩釋載體研究領(lǐng)域。隨著對(duì)絲素蛋白功能特性和復(fù)合生物材料的研究，必將提升蠶絲的附加值，使古老的紡織材料發(fā)展得到新機(jī)遇。