阿爾茨海默病血液蛋白標(biāo)志物的研究進展

徐 俊

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)認知科，北京100070）

阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer's disease，AD）是以淀粉樣蛋白沉積（amyloid-β，Aβ）和Tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)為主要病理特征的進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該病目前的發(fā)病機制不明，臨床上尚無有效的治愈藥物。2011年，美國國立老年研究所-阿爾茨海默病協(xié)會（National Institute on Aging-Alzheimer's Association，NIA-AA）在AD診斷指南中指出AD是連續(xù)發(fā)展的疾病，在認知損害出現(xiàn)的至少10年之前AD患者腦內(nèi)就已有相關(guān)病理改變（稱為臨床前期）［1］。這一指南促進了早期識別AD病理的生物標(biāo)志物研究，并促進對AD進行早期診斷和干預(yù)的研究轉(zhuǎn)向。腦脊液（cere?brospinal fluid，CSF）和正電子發(fā)射計算機斷層顯像（positron emission computed tomography，PET）檢查能夠反映腦內(nèi)Aβ和Tau蛋白病理，多年來一直被推薦作為AD的特異性病理生物標(biāo)志物，是AD的早期診斷、臨床研究和藥物研發(fā)中所監(jiān)測的指標(biāo)之一。2018年，NIA-AA推薦基于＂A＂（Aβ）＂T＂（Tau）＂N＂（神經(jīng)變性）病理標(biāo)志物劃分AD和非AD譜系疾病，再次肯定了CSF和PET檢查對AD診斷的意義［2］。但CSF和PET檢測技術(shù)因價格昂貴，創(chuàng)傷性大，技術(shù)要求高，患者依從性差等缺點而無法在臨床中普及［3］，因此目前臨床上主要結(jié)合臨床表現(xiàn)和認知量表對AD進行診斷，特異性較低。

血液因具有易于采樣、安全性高、可重復(fù)實施、適于疾病追蹤隨訪等優(yōu)點，研究者們一直嘗試在其中尋找到經(jīng)濟有效的AD早期生物標(biāo)志物，以期打破AD目前面臨的診療困境。然而，既往關(guān)于血液中AD蛋白生物標(biāo)志物（主要是Aβ和Tau）與AD病理標(biāo)志物（CSF和PET）的相關(guān)性研究、血液中Aβ和Tau對AD的診斷和預(yù)測等方面的研究結(jié)果并不一致［4–9］。主要的原因包括［10］：①腦源性Aβ或Tau在外周血中的濃度較低，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測范圍有限；②血液中Aβ和tau可能還來源于外周組織；③血漿中其他含量豐富的蛋白質(zhì)如白蛋白、免疫球蛋白會影響檢測結(jié)果；（4）Aβ或Tau蛋白在血液中的半衰期較短。此外，種族差異和樣本量的大小，納入和排除的標(biāo)準(zhǔn)不同也會對研究結(jié)果產(chǎn)生影響［11-12］。近年來，超靈敏檢測技術(shù)如單分子免疫列陣（single-molecule array，Simoa），免疫沉淀-質(zhì)譜聯(lián) 用（immunoprecipitation mass spectrometry，IPMS），MSD（Meso Scale Discovery，MSD）電化學(xué)發(fā)光，免疫磁減量（immunomagnetic reduction，IMR）的應(yīng)用使得血液中AD蛋白標(biāo)志物研究有了極大的進展。相關(guān)研究結(jié)果表明血液中部分生物標(biāo)志物（如Aβ、p-Tau、外泌體）能夠早期反映AD的病理狀態(tài)，并對AD進行早期診斷和預(yù)測，有望于成為AD早期特異性體液生物標(biāo)志物。因此本文通過對近5年來血液中AD蛋白生物標(biāo)志物的研究進展進行總結(jié)，以提高對血液生物標(biāo)志物在AD診療中的認識，并為其更好的早期應(yīng)用于臨床提供指導(dǎo)。

1 血漿Aβ檢測

1.1 血漿Aβ對AD的診斷

與單獨血漿Aβ42相比，通過Simoa檢測的血漿Aβ42/Aβ40對AD的診斷更為可靠。在瑞典神經(jīng)退行性疾病早期可靠的生物標(biāo)志物（Biomarkers For Identifying Neurodegenerative Disorders Early and Reliably，BioFINDER）隊列中的一項大型回顧性研究表明［13］，與輕度認知障礙（mild cognitive impair?ment，MCI）和對照組相比，Simoa檢測的血漿Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40在AD患者中均明顯下降，但僅血漿Aβ42/Aβ40在對照組和MCI組間有顯著差異。Startin等［14］應(yīng)用Simoa比較不同患者的血漿Aβ，研究發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征（Down syndrome，DS）患者的血漿Aβ42與散發(fā)性AD（sporadic AD，sAD）和對照組相比明顯升高，sAD與對照組間的血漿Aβ42無明顯差異性；但DS和sAD的血漿Aβ42/Aβ40均顯著低于對照組。

在應(yīng)用IMR檢測血漿Aβ和Tau蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)［15–19］，與對照組相比，MCI和AD患者的血漿Aβ42和Tau蛋白水平顯著升高，血漿Aβ40水平降低。進行受試者工作特征曲線（receiver operating char?acteristic curve，ROC）分析表明，單獨血漿Aβ42、Tau，或者聯(lián)合生物標(biāo)志物Aβ42/Aβ40、Tau×Aβ42對于區(qū)分對照組和AD的曲線下面積（area under curve，AUC）均大于90%，但這些指標(biāo)區(qū)分MCI和AD的AUC僅在70%左右。一項納入83例血液生物標(biāo)志物的臨床研究進行Meta分析表明［20］，與Simoa和ELISA相比，IMR檢測的血漿Aβ42、Aβ40以及Aβ42/Aβ40在AD和對照組間均有顯著差異性?？梢钥闯?，相比于Simoa，IMR檢測的血漿Aβ對診斷AD的準(zhǔn)確度似乎更高。但在這些研究中，AD的診斷缺乏Aβ或Tau病理標(biāo)志物，因此仍需在有AD病理標(biāo)志物的隊列中進一步研究血漿Aβ對AD以及AD臨床前期的診斷價值。

值得注意的是，IMR檢測的血漿Aβ42水平往往是增加的，這與Simoa，IP-MS檢測相關(guān)的研究結(jié)果相反，原因可能在于檢測分析的過程不同［16-17］。首先，SIMOA采用磁珠純化目標(biāo)蛋白（此過程通常會導(dǎo)致目標(biāo)蛋白丟失），而IMR是直接測量目標(biāo)蛋白；其次，Simoa在檢測中使用兩種單克隆抗體，而IMR在檢測中只用一種特異性捕獲C端的抗體，這使得IMR會將血漿中Aβ42的單體，寡聚體、復(fù)合體等均檢測出來。

1.2 血漿Aβ與AD病理標(biāo)志物的相關(guān)性

在MCI和AD患者中，Smioa和IMR檢測的血漿Aβ與CSF/PET中的AD病理標(biāo)志物存在一定相關(guān)性，但其區(qū)分腦內(nèi)異常AD病理狀態(tài)的能力有待進一步驗證。Janelidze等［13］通過Simoa檢測受試者血漿中的Aβ，結(jié)果表明MCI者的血漿Aβ42與CSF中的Aβ42輕度正相關(guān)（r=0.27，P＜0.001），與AβPET輕度負相關(guān)（r=-0.295，P=0.002）。另一項應(yīng)用Si?moa檢測血漿中Aβ的研究指出［21］，遺忘型MCI（amnestic MCI，aMCI）患者的血漿Aβ42/Aβ40與CSF Aβ42/Tau的正相關(guān)性高于對照組（raMCI=0.51＞r對照=0.25）；血漿Aβ42/Aβ40預(yù)測aMCI患者腦內(nèi)AβPET異常狀態(tài)的AUC為0.86。Teunissen等［18］在荷蘭和瑞典兩組隊列的AD患者中發(fā)現(xiàn)，IMR檢測的血漿Aβ42和ELISA檢測的CSF Aβ42中度負相關(guān)（r=-0.352）。在一項中國臺灣地區(qū)AD神經(jīng)影像學(xué)計劃多 中 心 研 究 中［22］，IMR檢 測 的 血 漿Aβ42以15.58 pg/mL為分界值，結(jié)合APOEε4狀態(tài)，區(qū)分早期AD患者腦內(nèi)Aβ異常沉積狀態(tài)的能力明顯提高（AUC單獨=0.611；AUC聯(lián)合=0.875）。

與Simoa和IMR相比，IP-MS檢測的血漿Aβ能夠較為準(zhǔn)確的反映認知正常者、MCI以及AD患者的腦內(nèi)Aβ沉積水平［23］。應(yīng)用IP-MS對華盛頓醫(yī)科大學(xué)AD研究中心的41例AD患者和認知正常者的血漿Aβ進行檢測，結(jié)果表明血漿Aβ42/Aβ40反映CSF和PET檢查中的Aβ異常狀態(tài)的AUC為89%；進一步將該比值與CSF標(biāo)志物進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血漿與CSF中的Aβ42/Aβ40高度相關(guān)（r=0.7，P＜0.000 1）［24］。Kaneko等［25］采用IP-MS檢測66個受試者血漿中淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor pro?tein，APP）和Aβ，結(jié)果顯示血漿APP669-711/Aβ42區(qū)分AβPET異常狀態(tài)的能力（AUC=0.969）優(yōu)于Aβ42/Aβ40（AUC=0.798）。之后該研究團隊在日本國立老年醫(yī)學(xué)中心（National Center for Geriatrics and Gerontology，NCGG）和澳大利亞老齡化影像學(xué)，生物標(biāo)志物和生活方式研究（Australian Imaging，Bio?marker and Lifestyle Study of Ageing，AIBL）數(shù)據(jù)庫中的研究再次證實血漿Aβ42/Aβ40，APP669-711/Aβ42以及他們的復(fù)合生物標(biāo)志物均能作為檢測AβPET狀態(tài)的有效指標(biāo)（AUC＞90%）［26］。

1.3 血漿Aβ對認知進展的預(yù)測

部分SCD和aMCI患者腦內(nèi)可能出現(xiàn)AD早期病理變化因而更有可能出現(xiàn)認知功能惡化［27］，而Simoa和IMR檢測的血漿Aβ與AD病理標(biāo)志物存在相關(guān)性從而能夠在一定程度上預(yù)測認知水平的下降。Verberk等［3］對248例主觀認知下降者（sub?jective cognitive decline，SCD）平均隨訪3年，并應(yīng)用Simoa對其血漿中的Aβ進行檢測，建立Cox比例風(fēng)險回歸模型后發(fā)現(xiàn)，在調(diào)整年齡和性別因素后，血漿Aβ42/Aβ40比值下降的SCD進展為MCI和癡呆的風(fēng)險增加1.67倍（95%CI：1.15-2.44），然而血漿Aβ42、Aβ40以及Tau并不能預(yù)測MCI和癡呆的進展。Chen等［28］對22例aMCI患者平均隨訪1.5年，結(jié)果表明在調(diào)整年齡、性別、文化程度、APOE因素后，IMR檢測的血漿Aβ42、Tau或者Tau×Aβ42升高至少增加5倍以上的認知功能下降的風(fēng)險。

2 血漿Tau檢測

2.1 血漿Tau對AD的診斷

2.1.1 血漿t-Tau在AD中的診斷AD患者和正常人群中的血漿總Tau蛋白（total-Tau，t-Tau；前文中所提到的血漿Tau即指t-Tau）重疊程度較高，并不能作為AD的特異性生物標(biāo)志物，但可反映病情的進展程度。應(yīng)用Simoa檢測的血漿t-Tau雖在AD患者中顯著升高，但并不能有效的區(qū)分AD和MCI及認知正常人群［29–31］。而Yang等［32］采用IMR檢測臺灣大學(xué)醫(yī)院215例招募者的血漿t-Tau，結(jié)果顯示在17.43 pg/mL的分界值下，血漿t-Tau能夠區(qū)分癡呆與認知正常者（AUC=90.8%），但并不能有效區(qū)分AD和非AD癡呆。

2.1.2 血漿p-Tau在AD中的診斷 近來，血漿中過度磷酸化的Tau蛋白（phosphorylated tau，p-Tau）作為AD血液生物標(biāo)志物逐漸受到關(guān)注，目前研究較多的磷酸化位點有p-Tau181和p-Tau217，也有關(guān)于血漿p-Tau231在AD中的研究報道［33-34］。

血漿p-Tau181和p-Tau217在MCI階段乃至臨床前期即顯著升高，對于AD的早期診斷和鑒別診斷均具有良好的區(qū)分性能。采用IMR對73例受試者血漿p-Tau181進行檢測，結(jié)果表明在不同的分界值水平，血漿p-Tau181能夠識別認知正常者、MCI以及輕度AD患者［35］。應(yīng)用Simoa和MSD檢測血漿p-Tau181的研究發(fā)現(xiàn)［36–39］，血漿p-Tau181在Aβ+的MCI和對照組中明顯升高，在AD階段隨著病情進展進一步增加，對鑒別臨床診斷或病理解剖證實的AD與非AD退行性疾病的AUC在90%左右。Palmqvist等［40］率先應(yīng)用MSD對不同隊列人群中的血漿p-Tau217檢測發(fā)現(xiàn)，血漿p-Tau217對于區(qū)分亞利桑那州神經(jīng)病理隊列和BioFINDER隊列中的AD和其他神經(jīng)變性疾病的AUC超過95%。應(yīng)用MSD對華盛頓高地-英伍德哥倫比亞老齡化項目（Washington Heights-Inwood Columbia Aging Project，WHICAP）中的3個種族人群的血漿p-Tau進行檢測發(fā)現(xiàn)［41］，血漿p-Tau217和p-Tau181能夠有效區(qū)分解剖和臨床隊列中的不同種族的AD和對照組。

2.2 血漿Tau與AD病理的相關(guān)性

2.2.1 血漿t-Tau與AD病理標(biāo)志物的相關(guān)性 AD

患者中Simoa檢測的血漿t-Tau和CSF中AD標(biāo)志物的相關(guān)性微弱，并不能成為AD特異的病理標(biāo)志物，但能夠反映神經(jīng)損傷的嚴重程度。在梅奧臨床隊列（Mayo Clinic Study of Aging，MCSA）中的研究表明，血漿t-Tau升高與認知水平下降，海馬體積縮小以及皮層厚度減少有關(guān)，但與腦內(nèi)Aβ沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)病理并不相關(guān)［29，42-43］。一項對AD神經(jīng)影像學(xué)計劃（Alzheimer's Disease Neuroimaging Initia?tive，ADNI）數(shù)據(jù)庫中的189例認知正常、195例MCI和179例AD患者在2年內(nèi)的血漿t-Tau變化的回顧性研究分析表明［30］，在調(diào)整診斷、年齡、性別、文化程度、APOE后，血漿t-Tau升高與認知進展速度，海馬萎縮程度以及葡萄糖代謝下降水平有關(guān)；研究人員同時在對BioFINDER隊列人群中發(fā)現(xiàn)AD患者的血漿t-Tau與CSF t-Tau的相關(guān)性并不強（β=0.13，95%CI：0.039-0.22）。在紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院（New York University School of Medicine，NYUSOM）隊列中的一項研究也同樣顯示AD患者的血漿和CSF中的t-Tau無明顯相關(guān)性（r=0.2，P=0.33）［31］。

2.2.2 血漿p-Tau與AD病理的相關(guān)性 在腦內(nèi)出現(xiàn)AD病理之前，血漿p-Tau181和p-Tau217水平已有升高，二者與Aβ和Tau病理密切相關(guān)，能夠準(zhǔn)確反映AD病理。對癡呆病例登記（Dementia Case Register，CDR）和英國阿爾茨海默病研究（Alzheim?er's Research UK，ARUK）隊列中的115人的血漿p-Tau181采用Simoa進行檢測，并對參與者去世后進行神經(jīng)病理評估，研究表明AD病理出現(xiàn)的至少8年之前血漿p-Tau181就有升高，區(qū)分AD病理和非AD病理的AUC達97%［44］。在ADNI數(shù)據(jù)庫中的一項關(guān)于血漿p-Tau181（Simoa檢測）在AD病程中的變化情況的縱向研究中，研究者采用線性混合效應(yīng)模型分析表明在AβPET和CSF Aβ42達到異常水平之前，血漿p-Tau181即隨著Aβ病理的進展而升高，并且在調(diào)整了年齡，性別，認知狀態(tài)后，Aβ+組中血漿p-Tau181的縱向增加與6年后Tau蛋白的廣泛聚集相關(guān)［45］。在應(yīng)用Simoa和MSD檢測血漿p-Tau181的橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)，僅在Aβ+組（不論認知狀態(tài)）中血漿p-Tau181與CSF p-Tau以及Tau PET有顯著相關(guān)性［34，36–38，42，46］。Palmqvist等［40］關(guān)于MSD檢測的血漿p-Tau217與AD病理的相關(guān)性研究表明，在尸檢病理證實的Aβ+組中血漿p-Tau217與神經(jīng)纏結(jié)的密度評分相關(guān)（r=0.64，P＜0.001）；該團隊在BioFINDER隊列中的研究發(fā)現(xiàn)，血漿p-Tau217對識別Aβ/Tau PET異常狀態(tài)的能力可比擬CSF中的AD標(biāo)志物（AUC血液p-Tau217：0.87-0.93；AUCCSF：0.80-0.97）。對來自華盛頓大學(xué)招募的AD患者和健康對照者進行AβPET和CSF檢查，并應(yīng)用IP-MS檢測受試者血漿中的p-Tau，研究表明血漿和CSF中的p-Tau217高度相關(guān)（r＞0.7，P<0.000 1），ROC分析結(jié)果顯示血漿p-Tau217對識別AβPET異常狀態(tài)的AUC超過90%［47］。

2.3 血漿Tau對認知進展的預(yù)測

Janelidze等［36］對219例認知正常者和125例MCI患者隨訪8年，以是否轉(zhuǎn)化為AD為結(jié)局指標(biāo)建立Cox比例風(fēng)險回歸模型，結(jié)果表明在調(diào)整血漿t-Tau，Aβ42/Aβ40，神經(jīng)絲輕鏈等因素后，高血漿p-Tau181增加非癡呆者轉(zhuǎn)化為AD的風(fēng)險（HR：3.59，95%CI：2.55-5.04）。Palmqvist等［40］在哥倫比亞常染色體顯性AD登記注冊研究隊列中發(fā)現(xiàn)在PSEN1變異的AD患者至少在出現(xiàn)認知損害的20年前血漿p-Tau217即有升高。隨后該團隊對BioFINDER隊列中的250位受試者隨訪6年，使用線性混合效應(yīng)模型分析表明，在Aβ+的認知正常者和MCI人群中血漿p-Tau217隨著時間而增加，并且與認知能力 下 降 和 腦 萎 縮 相 關(guān)［48］。Brickman等［41］對WHICAP臨床隊列中的169例認知正常者進行隨訪，研究表明在調(diào)整性別、年齡、種族和APOE因素后，血漿p-Tau217和p-Tau181升高增加4年后AD的發(fā)生風(fēng)險（OR：2.27，95%CI：1.31-3.93；OR：2.74，95%CI：1.54–4.86）。

3 血液外泌體檢測

外泌體是包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種細胞所分泌的直徑為30～150納米的囊泡結(jié)構(gòu)，其可于血液、腦脊液、尿液等多種體液中分離、提取。外泌體內(nèi)含有大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、微小RNA（microRNA，miR?NA）等來自母體細胞的內(nèi)容物，因此可以作為反映中樞系統(tǒng)疾病的生物標(biāo)志物［49］。目前外泌體在AD方面的研究主要通過對其中的AD相關(guān)蛋白（Aβ、Tau、突觸蛋白等）和miRNA進行檢測。

現(xiàn)有的研究提示血液外泌體中的部分蛋白質(zhì)可以早期識別AD并且能夠準(zhǔn)確反映AD病理變化。通過ELISA檢測的外泌體Aβ、Tau、p-Tau181在AD臨床前期明顯升高，并且聯(lián)合生物標(biāo)志物對區(qū)分AD、aMCI和對照組的能力優(yōu)于單一標(biāo)志物［50-51］。在我國的一項探究血液中神經(jīng)源性外泌體（ELISA檢測）和CSF中AD標(biāo)志物的一致性的多中心研究中發(fā)現(xiàn)，血液外泌體和CSF中的Aβ42，t-Tau，p-Tau181彼此高度相關(guān)（R2=0.76-0.86，P＜0.000 1）［51］。新近的研究發(fā)現(xiàn)血液外泌體中的突觸蛋白組合能在臨床癥狀出現(xiàn)的5~7年前預(yù)測AD的發(fā)生（AUC=0.87-0.89）［52］。

4 血液其他蛋白檢測

除了上述血液中主要的AD相關(guān)蛋白標(biāo)志物外，還有研究利用高通量質(zhì)譜分析對血液中的蛋白檢測，結(jié)果表明多種血液蛋白指標(biāo)聯(lián)合往往能夠提高作為AD生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確性。在韓國AD早期診斷和預(yù)測的腦衰老研究隊列中的一項基于質(zhì)譜檢測的蛋白組學(xué)分析表明，多個蛋白生物標(biāo)志物組合可以提高對AD診斷的敏感性和特異性［53］。我國學(xué)者［54］對AD患者和對照組血清進行蛋白組學(xué)分析，選取了與APP相互作用的18個蛋白作為AD候選生物標(biāo)志物，推測這些蛋白表達水平或功能改變可能影響Aβ代謝從而參與AD發(fā)生［53］。

綜上所述，應(yīng)用超靈敏技術(shù)檢測的血漿中Aβ和p-Tau以及血液外泌體與AD病理標(biāo)志物之間存在明顯相關(guān)性，能夠早期識別AD病理；聯(lián)合生物標(biāo)志物檢測能夠增加對AD早期診斷的準(zhǔn)確性并能在一定程度上預(yù)測癡呆的進展，有希望成為AD早期生物標(biāo)志物。但不同的檢測技術(shù)在血液中AD蛋白標(biāo)志物方面的研究結(jié)果存在一定差異性，除了檢測技術(shù)原理不同之外，檢測流程、不同標(biāo)志物的分界值，以及不同種族、樣本量大小、納入標(biāo)準(zhǔn)都會對結(jié)果產(chǎn)生影響。因此需要對AD蛋白標(biāo)志物的不同檢測方法和流程以及納入的人群標(biāo)準(zhǔn)作以規(guī)范，也需要更多的Meta分析和建立以“前瞻性、多種族、多中心、大樣本、真實世界數(shù)據(jù)”為基本特征的認知隊列以明確血液蛋白標(biāo)志物在AD中的應(yīng)用價值，從而推動AD血液蛋白標(biāo)志物早期應(yīng)用于臨床。