孢子絲菌病及其病原真菌的再認(rèn)識

黃懷球

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科，廣東廣州510630）

孢子絲菌?。⊿porotrichosis）是由孢子絲菌復(fù)合體引起的皮膚、皮下組織及局部淋巴管的慢性感染，是全球分布最廣的深部真菌病。孢子絲菌復(fù)合體（Sporothrixcomplex）屬于子囊菌門，長喙殼菌目，長喙殼菌科，孢子絲菌屬，由Schenck于1898年首次發(fā)現(xiàn)并分離命名為申克孢子絲菌，在我國1916年刁信德首次報道［1］。孢子絲菌常見于土壤和腐木中，通過皮膚創(chuàng)口接種感染人類或動物，因此，從事花卉、農(nóng)業(yè)和木材開采的人員易患孢子絲菌病。人類也可通過和動物密切接觸感染孢子絲菌。孢子絲菌病臨床表現(xiàn)多樣，嚴(yán)重程度不一，分為皮膚型和皮膚外型。皮膚型可分為局限在皮膚或皮下組織的固定型和沿淋巴管分布的淋巴管型，以及通過自身接種或血行播散引起的皮膚播散型，臨床上大多數(shù)孢子絲菌病表現(xiàn)為淋巴管型［2］，少數(shù)出現(xiàn)皮膚外型，如肺孢子絲菌病由于吸入孢子絲菌復(fù)合體的分生孢子導(dǎo)致肺部感染。近年來隨著免疫受損人群數(shù)量增多，孢子絲菌病在全球的發(fā)病率逐年升高［3］，在南美地區(qū)已成為嚴(yán)重危害人類健康的人畜共患?。?］，人們對孢子絲菌復(fù)合體的認(rèn)識也日益深入。本文就孢子絲菌復(fù)合體的病原學(xué)、流行病學(xué)、致病性和分子生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 病原學(xué)

1.1 孢子絲菌復(fù)合體的分類及對比

多年以來，申克孢子絲菌（Sporothrix schenckii）被認(rèn)為是導(dǎo)致孢子絲菌病的唯一病原體。既往孢子絲菌病病原菌的鑒定是基于形態(tài)學(xué)以及核糖體DNA（rDNA）分析，de Lima Barros［5］和李珊山等［6］發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)方法鑒定為同一種的菌株卻對同種治療藥物有著不同的反應(yīng)，提示該病的致病菌可能并非單一的物種。2007年Marimon等［7］根據(jù)真菌形態(tài)、糖同化實(shí)驗(yàn)等將孢子絲菌分出4個新種：巴西孢子絲菌（Sporothrix brasiliensis）、球形孢子絲菌（Sporo?thrix globosa）、墨西哥孢子絲菌（Sporothrix mexi?cana）以及盧艾里孢子絲菌（Sporothrix luriei），這幾種孢子絲菌與人類致病相關(guān)，因此稱為“臨床致病群”［8］。通過對孢子絲菌幾丁質(zhì)合成酶、β-微管蛋白和鈣調(diào)蛋白基因等分析，將孢子絲菌復(fù)合體分為5組菌株：第一組（Clade I）分離菌株來源于巴西，為巴 西 孢 子 絲 菌（Sporothrix brasiliensis）；第 二 組（CladeⅡ）菌株為申克孢子絲菌（Sporothrix schenckii），其中又被分成2個亞組：Ⅱa組來自美國和南美洲的菌株，而Ⅱb組來自南美洲；第三組（CladeⅢ）分離菌株來自中國、印度、意大利、日本、西班牙、美國和英國，為球形孢子絲菌（Sporothrix globosa）；第四組（CladeⅣ）為來自墨西哥的墨西哥孢子絲菌（Sporothrix mexicana）；第五組（Clade V）為來自歐洲的白孢子絲菌（Sporothrix pallida，原稱Sporothrix albicans）。不同組菌株的分生孢子有差異：第一組和第三組分生孢子呈球形；第二組分生孢子呈三角形；第四組分生孢子呈梭形；第五組則不存在分生孢子［9-10］。

孢子絲菌復(fù)合體在遺傳學(xué)、流行病學(xué)、耐藥性和引起的臨床表現(xiàn)等方面均存在很大差異。申克孢子絲菌在遺傳學(xué)方面具有高度的遺傳變異性，巴西孢子絲菌和球形孢子絲菌各自基因卻具有較高的同質(zhì)性［11-12］。不同亞類的孢子絲菌的分布地區(qū)存在差異：球形孢子絲菌廣泛分布于亞洲、歐洲以及美洲，亞洲是主要流行地區(qū)［13-14］；申克孢子絲菌在全球廣泛分布，主要集中在熱帶及亞熱帶地區(qū)，如阿根廷、墨西哥、秘魯、南非等；巴西孢子絲菌主要局限在巴西東南部地區(qū)［15-16］；墨西哥孢子絲菌曾被認(rèn)為只局限在墨西哥地區(qū)，巴西［15］和葡萄牙［17］也發(fā)現(xiàn)有墨西哥孢子絲菌病例；盧艾里孢子絲菌稀少且致病力低，目前只有非洲、意大利、印度有報道［18］。本課題組和國外學(xué)者開始共同關(guān)注和研究臨床藥物治療失敗菌株和無致病性環(huán)境分離株的特征［19-20］。球形孢子絲菌對唑類藥物耐藥性在逐漸增強(qiáng)，巴西孢子絲菌在體外實(shí)驗(yàn)中對大多數(shù)抗真菌藥都高度敏感［21］。球形孢子絲菌主要引起固定型孢子絲菌??；申克孢子絲菌和巴西孢子絲菌常引起典型的淋巴管型孢子絲菌病。

1.2 形態(tài)學(xué)

孢子絲菌復(fù)合體在環(huán)境中（25℃）呈菌絲相，在人體內(nèi)（37℃）呈酵母相。孢子絲菌復(fù)合體在實(shí)驗(yàn)室采用沙保氏葡萄糖培養(yǎng)基（SDA培養(yǎng)基）、酵母浸出液葡萄糖培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）中于28℃培養(yǎng)時，復(fù)合體不同菌株菌落形態(tài)相似，呈現(xiàn)灰褐色、絨毛樣菌落生長。顯微鏡下容易觀察到直徑為1~3μm的薄、透明和有隔膜的菌絲，菌絲常產(chǎn)生分枝［10］。在腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基（BHI培養(yǎng)基）37℃培養(yǎng)，可見柔軟、光滑、濕潤的酵母樣菌落生長。孢子絲菌復(fù)合體的申克孢子絲菌（Sporothrix schenckii）最重要，是孢子絲菌屬第一個被描述的菌種，申克孢子絲菌引起的病例在全世界均有報道。申克孢子絲菌在25℃SDA和37℃BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時呈現(xiàn)不同的形態(tài)學(xué)特征，SDA液基中25℃培養(yǎng)96 h后鏡檢可見細(xì)長的分枝、分隔菌絲，分生孢子梗由菌絲側(cè)呈銳角或直角生長。轉(zhuǎn)入BHI液基中37℃培養(yǎng)24 h后菌絲變粗變短，部分?jǐn)嗔?；培養(yǎng)36 h后可見短棒樣結(jié)構(gòu)形成，48 h后則可見雪茄樣、卵圓形或圓形的分生孢子。

1.3 自然生長環(huán)境

孢子絲菌復(fù)合體通常生長在溫暖潮濕如熱帶和亞熱帶地區(qū)的環(huán)境中，適宜生長的平均溫度為20℃~25℃，相對濕度高于90%。有些菌株可能存在耐熱性，另外有些菌株能在pH為3.5~9.6的范圍內(nèi)生長［3，22-24］。盡管全年都有孢子絲菌病的發(fā)生，本病一般在秋季和冬季高發(fā)，這與當(dāng)?shù)赜昙窘Y(jié)束有關(guān)，例如墨西哥在雨季結(jié)束時，環(huán)境的溫度和濕度都達(dá)到了孢子絲菌的最適生長條件；同時在這兩個季節(jié)，當(dāng)?shù)厝藭M(jìn)行收割糧食、蔬菜等與植物長時間接觸的勞作，增大了與孢子絲菌接觸的風(fēng)險。在大多該病流行的國家，孢子絲菌復(fù)合體多生長在纖維素、草、有機(jī)物、木材等含量高的土壤和環(huán)境中［3，22，25］。另外有中國學(xué)者報道從玉米的根、莖中分離出球形孢子絲菌［26］。

1.4 感染途徑

孢子絲菌入侵主要有兩種途徑：宿主創(chuàng)傷后感染和吸入性感染［27］。自然環(huán)境中的孢子絲菌為腐生菌，以菌絲相產(chǎn)生大量的分生孢子，上皮和黏膜外傷破損失去連續(xù)性被侵入，認(rèn)為這是皮膚感染的常見原因。自孢子絲菌能從動物的蹄以及牙齒中被分離出來，認(rèn)為本病也可通過動物媒介進(jìn)行傳播。如嚙齒類動物中大鼠和松鼠是常見的動物媒介；由昆蟲（如螞蟻和蜜蜂）、爬行動物、蜘蛛以及蝙蝠的叮咬造成疾病的傳播也有報道［3，22］。近年來，養(yǎng)貓、狗等作為寵物的數(shù)量越來越多，動物源性的孢子絲菌病也逐漸增多，且從動物的爪、皮損以及它們的窩中分離出孢子絲菌。特別需要指出的是，與經(jīng)典的通過污染土壤或植物的傳播方式不同，貓在巴西孢子絲菌的傳播中起到重要作用，體現(xiàn)了與巴西孢子絲菌在進(jìn)化以及傳播中的相互聯(lián)系。近10年來巴西孢子絲菌為了適應(yīng)宿主做出了適應(yīng)性改變，如提高了耐熱性。貓的體溫在38℃~39℃之間，巴西孢子絲菌更能適應(yīng)在較高溫的環(huán)境中生長。在37℃培養(yǎng)時，巴西孢子絲菌生長最好，其次是申克孢子絲菌。而其他種類的孢子絲菌，如球形孢子絲菌和墨西哥孢子絲菌對溫度更為敏感，最高可耐受的溫度為35℃。巴西不同地區(qū)的31只貓以及2條狗上分離出了33株孢子絲菌，其中32株鑒定為巴西孢子絲菌，1株鑒定為申克孢子絲菌，表明造成巴西地區(qū)貓感染的大多數(shù)為巴西孢子絲菌［15，28］。迄今為止，動物孢子絲菌病的最大疫情暴發(fā)在里約熱內(nèi)盧，疫情已經(jīng)蔓延至巴西南部地區(qū)，預(yù)估超過10 000只貓和200只狗被感染，經(jīng)檢測此次疫情主要是由巴西孢子絲菌引起［15］。人類可以通過被貓抓傷或咬傷感染，貓傳播毒性更強(qiáng)的酵母相巴西孢子絲菌，而不是其菌絲相或分生孢子。

少數(shù)情況下，孢子絲菌可通過呼吸道吸入引起原發(fā)性的肺部感染［3，22］。目前對吸入性感染的研究尚少，主要是在免疫狀態(tài)低下的病人特別是感染人類免疫缺陷病毒或是患有獲得性免疫缺陷綜合征的病人中有報道［29-30］。

2 流行病學(xué)

2.1 地域分布

孢子絲菌病主要集中于熱帶、亞熱帶，在美國，南美洲（巴西、哥倫比亞、危地馬拉、墨西哥、秘魯），亞洲（中國、印度、日本）和澳大利亞均有報道［3］。

在我國，幾乎所有省份都有孢子絲菌病病例的報道［18］，吉林省報道的病例數(shù)最多。在該地區(qū)的玉米稈、枯枝、腐爛木材、污泥和土壤等樣本中可檢出有申克孢子絲菌，其中據(jù)田亞萍等［31］的調(diào)查，在吉林地區(qū)自然環(huán)境中收集腐木、土壤等標(biāo)本70份，分離出申克孢子絲菌的陽性率為8.6%。在吉林附近的內(nèi)蒙古呼和浩特市，姜長友等［32］從69份標(biāo)本中分離出8株申克孢子絲菌，陽性率為11.6%。另外在中國東南部，紀(jì)青等［33］對廣東省珠海市金灣區(qū)的一項(xiàng)孢子絲菌生態(tài)學(xué)的研究表明，該研究從珠海金灣區(qū)自然環(huán)境中分離出了申克孢子絲菌24株，分離率為15%，可見孢子絲菌在我國廣泛存在。后來對中國收集的菌種按照新的分類方法重新鑒定，基本上結(jié)果都是球形孢子絲菌［34］。

中國北方的大多數(shù)報道［23］指出，在寒冷季節(jié)北方地區(qū)的溫度通常低于零攝氏度，此時發(fā)病率更高，與孢子絲菌適宜在溫暖濕潤的環(huán)境中生長的觀點(diǎn)截然不同，冬季發(fā)病率增高可能的原因是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民會用到玉米秸稈、蘆葦和樹枝去燃燒以及取暖。這些燃燒物上的真菌會導(dǎo)致室內(nèi)污染，因此，這可能是導(dǎo)致孢子絲菌病在寒冷季節(jié)高發(fā)的重要因素［2］。除吉林省外，孢子絲菌病在其他省份也很普遍?？傮w來看，在中國其他地區(qū)，大部分孢子絲菌病病例都聚集在長江沿岸的省份（四川和江蘇）和中國東南部的省份（廣東和廣西）。

在國外某些高流行地區(qū)，例如秘魯?shù)陌l(fā)病率為每10萬人48至98例，兒童的平均發(fā)病率為每10萬人156例［35］；在墨西哥的哈利斯科山脈和普埃布拉山脈地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計每1 000名居民中有25例患?。?8］。日本從1946年到1982年每年報告約155例［36］，現(xiàn)在已降至每年50例。相比之下，巴西的病例數(shù)逐年增加，里約熱內(nèi)盧的Evandro Chagas臨床研究所在1998年至2004年間報告了759例人類、1 503例貓和64例狗孢子絲菌病病例，這些結(jié)果與1987年至1997年只發(fā)現(xiàn)13例人類病例形成鮮明對比［37］。Barros等［38］描述了1998年至2009年間在巴西里約熱內(nèi)盧確診的大約2 200例人和3 244例貓孢子絲菌病病例，表明這20年出現(xiàn)疾病在貓科動物和人群中爆發(fā)，這是世界上有記錄以來人類和動物孢子絲菌病最大爆發(fā)的報道。巴西孢子絲菌可從動物傳播給人類，對其監(jiān)測應(yīng)包括環(huán)境、人與動物，非常迫切需要從“One health”角度提出孢子絲菌病預(yù)防的綜合方法模型，由多個部門同時有效實(shí)施和執(zhí)行孢子絲菌病蔓延的防控政策［39］。

2.2 患病的職業(yè)、性別和年齡特征

孢子絲菌病患者與職業(yè)關(guān)系密切，園林工人、狩獵者、農(nóng)民、礦工和木材開采者患病比例較大［2］，感染的概率取決于職業(yè)的暴露風(fēng)險，不同人的職業(yè)以及生活習(xí)慣影響著他們的暴露風(fēng)險。例如，犰狳獵人在烏拉圭患病率更高，由于他們在捕獵的過程中容易受傷導(dǎo)致感染［40］。女性的患病率在印度東北部和日本較高，由于她們更多地參與農(nóng)業(yè)活動［36，41］。在南非，男性患者與女性患者的數(shù)量之比約為3：1，由于男性更頻繁地參與了戶外工作以及采礦活動［42］。在秘魯安第斯山脈，兒童的發(fā)病率是成人的3倍。病例對照研究［35］表明，在莊稼地和臟地板上玩?？赡苁沁@些兒童的感染途徑。

3 致病因素分析

孢子絲菌復(fù)合體室溫下（25℃）呈無致病性的菌絲相生長，在人體內(nèi)（37℃）則呈現(xiàn)具有致病性的酵母相生長，這種由溫度誘導(dǎo)下的菌絲相向酵母相的轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是其毒力基因的表達(dá)以及致病能力形成的過程［43］。孢子絲菌復(fù)合體中的各種菌株的毒力因素存在顯著差異，Arrillaga-Moncrieff等［44］報道，在孢子絲菌復(fù)合體中，巴西孢子絲菌是毒力最強(qiáng)的，其次是申克孢子絲菌、盧艾里孢子絲菌和球形孢子絲菌。

孢子絲菌病臨床表現(xiàn)的差異與機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān)，與孢子絲菌復(fù)合體中各種菌株毒力的差異密切相關(guān)。球形孢子絲菌感染絕大多數(shù)僅引起皮膚型孢子絲菌病，以固定型和淋巴管型為常見，固定型的臨床表現(xiàn)呈多樣性，皮膚播散型少見，黏膜和皮外形偶見［45］。巴西孢子絲菌與其他種類不同具有特別強(qiáng)的毒力，可引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)的皮膚癥狀，引起眼瞼皮膚感染以及其他的眼部后遺癥，此外還引起超敏反應(yīng)，最常見表現(xiàn)包括結(jié)節(jié)性紅斑和多形性紅斑、關(guān)節(jié)痛、肌痛和關(guān)節(jié)炎，這些都與動物傳播相關(guān)［46］。

目前孢子絲菌的毒力研究主要針對細(xì)胞壁，因?yàn)榧?xì)胞壁是真菌應(yīng)對宿主免疫反應(yīng)的主要結(jié)構(gòu)。酵母相的細(xì)胞壁含有黑素，黑素在細(xì)胞表面形成致密的保護(hù)膜，具有抵抗巨噬細(xì)胞吞噬、抗氧化、增強(qiáng)細(xì)胞黏附性以及增加真菌耐藥性等作用［47］。實(shí)驗(yàn)證明［48］，產(chǎn)生黑素的分生孢子比不能產(chǎn)生黑素的分生孢子更能抵抗宿主細(xì)胞的吞噬和殺傷，甚至能抵抗氧、氮氧自由基。另外粘附力是真菌侵入宿主的先決條件，Kadry等［49］研究表明：細(xì)胞壁中的甘露糖和肽聚糖均參與了粘附的過程，并且它們在與宿主細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的粘附作用起到了關(guān)鍵的作用。Alba-Fierro、Portuondo和Rodrigues等［50-52］研究表明，申克孢子絲菌具有可識別宿主層粘連蛋白、纖維連接蛋白等的整合素或粘附素樣凝集素樣分子。Toll樣受體（TLR）家族作為重要的模式識別受體，能識別入侵的病原體介導(dǎo)各種免疫應(yīng)答，課題組驗(yàn)證了皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的TLR2和TLR4對孢子絲菌的識別作用［53］。

幾丁質(zhì)也是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分之一，可與葡萄糖、甘露糖、蛋白多糖等交聯(lián)，構(gòu)成保護(hù)屏障，是真菌重要的毒力成分［3］。本課題組發(fā)現(xiàn)從申克孢子絲菌菌絲相細(xì)胞壁提取的富含幾丁質(zhì)的多糖能增強(qiáng)感染小鼠清除真菌能力，在體外促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬真菌孢子，調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-12分泌［54］。本課題組用姜黃素處理申克孢子絲菌，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過增加細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的暴露增強(qiáng)宿主巨噬細(xì)胞殺傷作用而清除真菌［55］。姜黃素極大地上調(diào)了幾丁質(zhì)合成有關(guān)的PKC信號通路，幾丁質(zhì)合成增多，重新分配到細(xì)胞壁的外層，這被認(rèn)為是真菌應(yīng)對惡劣環(huán)境的主要適應(yīng)機(jī)制。本課題組研究發(fā)現(xiàn)用姜黃素處理的分生孢子，幾丁質(zhì)暴露在細(xì)胞壁外層，容易被巨噬細(xì)胞識別，從而調(diào)節(jié)宿主對真菌的免疫反應(yīng)。同時姜黃素可刺激巨噬細(xì)胞在早期分泌TNF-α，促進(jìn)了真菌的清除。我們還首先報道了姜黃素與特比萘芬聯(lián)合作用于申克孢子絲菌有協(xié)同作用［56］。機(jī)體可以分泌針對真菌的幾丁質(zhì)或類幾丁質(zhì)酶抵抗病原體，課題組發(fā)現(xiàn)申克孢子絲菌不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞CHI3L1表達(dá)升高，這可能導(dǎo)致了孢子絲菌病皮損慢性化難以愈合［57］。

4 基因組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

由于全世界每年都有大量的感染病例報道，對臨床相關(guān)的孢子絲菌的研究越來越引起人們的關(guān)注。本課題組聯(lián)合國際同行對臨床藥物治療失敗的臨床株的基因組進(jìn)行了比較基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)臨床藥物治療失敗菌株和低毒力無效病性臨床分離株的基因組可能具有一定特征［19-20］；進(jìn)一步分析了申克孢子絲菌菌絲相和酵母相轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜及建立了孢子絲菌基因組數(shù)據(jù)庫［58］，發(fā)現(xiàn)調(diào)控孢子絲菌菌絲相和酵母相的形成與維持的分子途徑異常復(fù)雜，可能由不同的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的表達(dá)差異以及一些尚未明確功能的蛋白質(zhì)編碼基因決定所造成。L-精氨酸在真菌中參與多種細(xì)胞活動，特別是細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生以及真菌繁殖的調(diào)控［59］，如在盾殼霉（Coniothyri?um minitans）和稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中，L-精氨酸參與調(diào)控它們無性生殖的過程，對它們分生孢子的形成至關(guān)重要。盾殼霉中由于氨基甲酰磷酸合成酶（CSP1）編碼基因（L-精氨酸合成的關(guān)鍵基因）的破壞而產(chǎn)生的突變會導(dǎo)致盾殼霉只能長出菌絲而不能產(chǎn)生孢子；在稻瘟病菌中，與盾殼霉CSP1基因的直向同源基因?yàn)镃PA2基因，CPA2基因的破壞同樣影響稻瘟病菌分生孢子的形成［59-60］。在申克孢子絲菌菌絲相中氨基甲酰磷酸酶合成基因（ORF Spsc_00280）與酵母相相比表達(dá)下調(diào)，表明L-精氨酸的生物合成參與了申克孢子絲菌的形態(tài)的轉(zhuǎn)化［58］。

近年來，組氨酸激酶（Histidine protein kinases，HPK），（在孢子絲菌中由DRK1基因編碼）被認(rèn)為是包括孢子絲菌在內(nèi)的幾種雙相真菌中菌絲相向酵母相轉(zhuǎn)化以及毒力變化的主要調(diào)節(jié)因子［61-62］。HPKs可以使組氨酸殘基磷酸化，是一大類信號傳導(dǎo)酶，HPKs與其下游的靶蛋白共同組成二組分信號系統(tǒng)。MAPKs級聯(lián)系統(tǒng)和cAMP信號通路被認(rèn)為參與真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化及致病力的形成，而兩者又都被上游的HPKs二組分調(diào)控系統(tǒng)所調(diào)控，故Nem?ecek等［63］認(rèn)為DRK1可能是調(diào)控雙相真菌形態(tài)轉(zhuǎn)化的啟動因素。據(jù)報道［61-62］，申克孢子絲菌中該基因在酵母相中的表達(dá)與菌絲相比上調(diào)，但是在本課題組的研究中發(fā)現(xiàn)申克孢子絲菌的DRK1基因在菌絲相和酵母相中的表達(dá)并無差異，原因可能是誘導(dǎo)菌絲相以及酵母相時的實(shí)驗(yàn)條件不同所致，同時指出在誘導(dǎo)成酵母相后，DRK1基因表達(dá)水平可能下降，由于其他因素維持酵母相［58］。有趣的是，該研究同時還發(fā)現(xiàn)了另一種由ORF Spsc_09813編碼的HPK，這種新發(fā)現(xiàn)的HPK在申克孢子絲菌中兩種形態(tài)間的表達(dá)存在差異，在酵母相中表達(dá)上調(diào)。真菌中雙相轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制非常復(fù)雜，取決于許多基因的表達(dá)，這些象可能由不同的化學(xué)、物理刺激引起，這些刺激通過調(diào)控特定分子通路激活特定下游分子來實(shí)現(xiàn)。

Prakash等［64］分析了致病性孢子絲菌屬的基因組特征，揭示了其基因組多個擴(kuò)增的基因家族。引起粘連的毒力相關(guān)基因（CFEM域和LysM結(jié)構(gòu)域），鐵捕獲基因（高親和力鐵離子滲透酶（high-affinity iron permease，F(xiàn)TR1）和多銅氧化酶，組織降解蛋白酶（絲氨酸和天冬氨酸蛋白酶）和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（MFS和OPT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）在孢子絲菌屬中得到擴(kuò)增。和其他雙相真菌相比，孢子絲菌含有更多的胞外結(jié)構(gòu)域，如CFEM（common in fungal extracellular mem?brane）蛋白結(jié)結(jié)構(gòu)域和LysM結(jié)構(gòu)域。CFEM結(jié)構(gòu)域是真菌獨(dú)有的一種蛋白結(jié)構(gòu)域，含有8個半胱氨酸，在宿主與病原體的相互作用中發(fā)揮重要作用［65］。含有CFEM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體和粘附分子的形成，參與鐵獲取和細(xì)胞壁的形成。孢子絲菌中CFEM結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)增表明其可能在內(nèi)皮細(xì)胞粘附、應(yīng)激反應(yīng)、從宿主獲得鐵的能力和細(xì)胞壁完整性中起作用［65-67］。真菌含有LysM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能結(jié)合碳水化合物［68］，如LysM與幾丁質(zhì)分子結(jié)合，通過掩蔽細(xì)胞壁幾丁質(zhì)分子幫助免疫逃避［69］。LysM結(jié)構(gòu)域也可能在免疫逃避中起作用，保護(hù)酵母免受吞噬和細(xì)胞內(nèi)殺滅，尚需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證LysM結(jié)構(gòu)域在人類病原真菌中的作用。

鐵是一種重要的金屬，獲取鐵的還原途徑和鐵載體介導(dǎo)的途徑均與真菌的致病力相關(guān)［70］。毛霉菌屬（Mucor sp.）中從宿主中獲取鐵是建立感染的重要機(jī)制，高親和力鐵離子滲透酶（FTR1）、多銅氧化酶和亞鐵氧化酶對與鐵的獲取對真菌毒力是必不可少的［70-71］。另外，除了鐵還原途徑，鐵載體介導(dǎo)的機(jī)制是真菌中鐵吸收的另一種主要模式［67］。在念珠菌中，鐵載體運(yùn)輸相關(guān)基因參與鐵的攝取，有助于念珠菌的侵襲以及逃避巨噬細(xì)胞的吞噬［67，72］。Prakash等［64］觀察到鐵獲取的基因在孢子絲菌屬中是保守且有擴(kuò)增，提示這些基因在孢子絲菌中可能起到增強(qiáng)真菌毒性的作用。

真菌蛋白酶是真菌入侵宿主組織所必需的［73］。編碼絲氨酸蛋白酶如脯氨酰寡肽酶（S09）、絲氨酸羧肽酶（S28）和二肽基肽酶（S15）的基因在孢子絲菌表達(dá)增加。脯氨酰寡肽酶具有胞外降解、蛋白質(zhì)成熟和液泡蛋白酶的作用。絲氨酸羧肽酶和二肽基肽酶的功能在真菌中尚不清楚［74］。除了真菌蛋白酶外，分泌型脂肪酶在孢子絲菌中也有擴(kuò)增。孢子絲菌的分泌性蛋白酶和脂肪酶可能通過幫助它們粘附在上皮細(xì)胞和組織降解上產(chǎn)生毒力導(dǎo)致感染的傳播［75］。預(yù)測孢子絲菌屬中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族是MFS（major facilitator superfamily）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（oligopeptide transporter，OPT）家族和ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABC和MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在脂肪酸代謝等各種生理?xiàng)l件下發(fā)揮重要作用，作為外排泵在真菌耐藥性中發(fā)揮重要作用。OPT家族轉(zhuǎn)運(yùn)體和MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體的亞類，如糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，對形態(tài)發(fā)生和毒力等細(xì)胞生物功能至關(guān)重要［76］。

本課題組利用RNA-seq鑒定了17 307個基因，其中11 217個被歸類為蛋白質(zhì)編碼基因，6 090個被歸類為非編碼RNA（ncRNAs），標(biāo)注的基因中大約有71%的基因發(fā)生了重疊，以不同鏈重疊型最為常見，基因表達(dá)分析顯示有8 795個基因在雙相轉(zhuǎn)化中受到不同的調(diào)控，有一半以上的基因在酵母相中的表達(dá)被上調(diào)［58］。這項(xiàng)研究描述了5 929個長鏈非編碼RNA（lncRNAs），這些基因座占申克孢子絲菌基因組中全部基因的34%以上。其中大多數(shù)發(fā)現(xiàn)的lnc RNAs為天然反義轉(zhuǎn)錄本（natural anti?sense transcripts，NATs）。NATs分為轉(zhuǎn)錄于靶基因基因座的反鏈DNA的順式NATs（cis-NATs）和轉(zhuǎn)錄于不同基因座的反式NATs（trans-NATs），NATs通過與蛋白質(zhì)編碼或非編碼的轉(zhuǎn)錄本相互作用，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［77］。報道表明許多cis-NATs是子囊菌和擔(dān)子菌中基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)劑［78］。該研究公布了申克孢子絲菌全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和建立了基因組數(shù)據(jù)庫（http：//sporothrixgenomedatabase.unime.it/），為真菌致病的分子機(jī)制研究提供強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。

5 結(jié) 語

孢子絲菌病已經(jīng)對全球的公共衛(wèi)生造成一定影響，每年都有大量的病例確診，部分地區(qū)甚至爆發(fā)流行。本文闡述了孢子絲菌復(fù)合體的病原學(xué)和流行病學(xué)等基本的生活習(xí)性以及分布情況，分析了孢子絲菌的致病毒力因素，整理了目前孢子絲菌的基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果，有助于深入了解孢子絲菌病和孢子絲菌的基礎(chǔ)研究和診斷治療。