苦蕎麩皮黃酮提取物及有效成分的抑菌活性

吳萌萌， 劉 怡， 嚴(yán) 馨， 張 娜， 李 姝，， 王松濤， 沈才洪， 趙 建*

（1.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/資源微生物學(xué)及生物技術(shù)教育部重點實驗室 四川 成都610064；2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州646000）

苦蕎麥俗稱苦蕎，學(xué)名韃靼蕎麥（Fagopyrum tataricum），是一年生或多年生宿根植物，起源于中國西南部，生長范圍遍布亞洲、歐洲和北美洲[1]?？嗍w麥屬于藥食兩用作物，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及各種礦質(zhì)營養(yǎng)元素，具有極高的營養(yǎng)價值[2-3]；同時與其他糧食作物相比，其富含黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抑菌、降血糖、抗腫瘤等生理功能[4-9]。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌是常見的引起食物中毒的食源性致病菌，糞腸球菌是人畜共患病原菌且耐藥性嚴(yán)重；志賀氏菌是細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌，藤黃微球菌會引起腦膜炎、肺炎等[10-11]。隨著抗生素在人類和動物疾病治療及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的大量使用，耐藥性問題日益嚴(yán)重，天然植物源抑菌劑以其天然、安全、高效等特性已成為研究熱點[12]。已有研究表明，黃酮類化合物對許多病原微生物具有廣譜抑菌特性[13]，鑒于其不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢，深入研究含有黃酮類的天然植物源活性成分對于天然抑菌劑及抗菌藥物的研發(fā)具有至關(guān)重要的作用。有研究表明苦蕎麩皮中含有大量黃酮類化合物，其黃酮含量約為苦蕎粉的5倍，但由于其口感粗糙、食味苦澀且不易消化，所以在苦蕎制品加工過程中多被丟棄，加工利用率低[14]。

目前，對苦蕎麩皮黃酮類化合物的研究多涉及苦蕎麩皮黃酮提取工藝的優(yōu)化及苦蕎麩皮黃酮含量的檢測，對苦蕎麩皮黃酮類的抗菌活性研究較少。為探究苦蕎麩皮黃酮類化合物對常見病原菌的抗菌活性，提高苦蕎麩皮資源的利用效率，作者選取了大腸桿菌、志賀氏桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、腸球菌等6株病原菌作為供試菌，采用平板打孔法及二倍稀釋法檢測苦蕎麩皮黃酮粗品和精品的抗菌性能，通過高效液相色譜法分析粗品與精品黃酮類化合物的成分及含量區(qū)別，并在測定黃酮單體抗菌活性的基礎(chǔ)上，討論了其主要成分的構(gòu)效關(guān)系，以期為苦蕎麩皮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎麩皮原料：四川環(huán)太生物科技股份有限公司產(chǎn)品；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度均 ≥98%）：上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；山奈酚-3-O-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%）：成都普思生物科技股份有限公司產(chǎn)品；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：Sigma公司產(chǎn)品；LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂：Biofroxx公司產(chǎn)品。

供試菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococus aureus，ATCC25922）； 藤 黃 微 球 菌（Micrococcus luteus，CMCC28001）； 耐 久 腸 球 菌（Enterococcus durans）；大 腸 桿 菌（Escherichia coli，ATCC25922）；志 賀 氏 菌 （Shigella castellani）；腸 炎 沙 門 氏 菌（Salmonella enteritidis，CVCC3377）。上述指示菌株均為作者所在實驗室保藏菌種。

HZK-FA210型電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SL502N型分析天平：上海民橋精密儀器科技有限公司產(chǎn)品；YLD-2000型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上?，槴\實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；YRE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；凈品級ADS-7型大孔吸附樹脂：天津浩聚樹脂科技有限公司產(chǎn)品；LC-16型高效液相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品；PS-06A型超聲波清洗機(jī)：東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司產(chǎn)品；UV-2600型紫外可見分光光度計：日本島津公司產(chǎn)品；LDZX-30KB型立式蒸汽壓力滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；1389型生物安全柜：美國Thermo公司產(chǎn)品；SKY-211C型恒溫?fù)u床：美谷分子儀器有限公司產(chǎn)品；DZKW-D-4恒溫水浴鍋：上海蘇坤實業(yè)有限公司產(chǎn)品；HPS-250型恒溫培養(yǎng)箱：哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎麩皮總黃酮制備方法取苦蕎麩皮適量，參照文獻(xiàn)[15]提取工藝條件：料液質(zhì)量體積比1 g∶10 mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度60℃熱回流提取3 h，重復(fù)提取3次，合并提取液并減壓濃縮至干，即得苦蕎麩皮黃酮粗品。以苦蕎麩皮黃酮粗品加適量水樣品制成上樣液，通過ADS-7型大孔吸附樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附，用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液減壓濃縮至干，即得苦蕎麩皮黃酮精品。

1.2.2 抑菌活性測定

1）總黃酮樣品的制備 用二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑，稱取苦蕎麩皮黃酮粗品及精品各5 g，加入5 mL DMSO，超聲輔助溶解，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，配成質(zhì)量濃度1 g/mL藥液。

2）制備指示菌平板 將供試細(xì)菌接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。取對數(shù)生長期的供試細(xì)菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)過夜。取活化好的供試菌種，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液澄清度，將菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬s1×108CFU/mL。參照譚才鄧等[16]的方法，使用預(yù)加菌液傾注平板法制備試驗平板。向20 mL冷卻至50℃左右的LB固體培養(yǎng)基中接種1 mL菌懸液，混合均勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，水平靜置。

3）打孔法測定抑菌活性 通過平板打孔法[16-17]測定抑菌圈直徑。待指示菌平板冷卻凝固后，用外徑為8 mm的打孔器打孔（孔間距不少于25 mm，孔中心距平皿邊緣不少于15 mm），用無菌針頭小心挑去培養(yǎng)基小塊，孔中滴加少量體積分?jǐn)?shù)0.5%瓊脂封底。向各孔中分別加入苦蕎麩皮黃酮粗品（質(zhì)量濃度1 g/mL）、苦蕎麩皮黃酮精品（質(zhì)量濃度1 g/mL）、DMSO各80μL，對應(yīng)做好標(biāo)記，置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用十字交叉法測定抑菌圈直徑，每組實驗重復(fù)3次。

1.2.3 最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測定

1）樣品的制備 將苦蕎麩皮黃酮精品及粗品用DMSO溶液配制成質(zhì)量濃度200 mg/mL的溶液，0.22μm微孔濾膜過濾，用液體培養(yǎng)基依次倍比稀釋成質(zhì)量濃度100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56 mg/mL；4種黃酮單體分別用DMSO溶液配制成質(zhì)量濃度50 mg/mL的溶液，0.22μm微孔濾膜過濾，用液體培養(yǎng)基依次倍比稀釋成質(zhì)量濃度25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39 mg/mL。

2）菌懸液制備 將供試細(xì)菌接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。取對數(shù)生長期的供試細(xì)菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)過夜。取活化好的供試菌種，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液澄清度，將菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，約1×108CFU/mL。

3）MIC及MBC測定 采用二倍稀釋法[17]進(jìn)行最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定。分別吸取100μL母液及梯度稀釋樣品于96孔板的2～9孔內(nèi)，每個孔中分別加入100μL稀釋至1×108CFU/mL的菌懸液。第10孔加200μL液體培養(yǎng)基作為陰性空白對照，第11孔加100μL菌液和100μL液體培養(yǎng)基為陽性空白對照。將96孔板置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h后，通過肉眼比對發(fā)現(xiàn)微孔內(nèi)液體澄清透明經(jīng)震蕩后仍無沉淀產(chǎn)生，則此微孔對應(yīng)的藥液濃度即為此樣品對供試細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）。將無細(xì)菌生長的微孔中液體吹打混勻后取100μL涂布于無菌培養(yǎng)基平板，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，仍無菌落生長的最低藥物濃度為樣品的最小殺菌濃度（MBC）。

1.2.4 高效液相色譜法測定

1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 稱取蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚標(biāo)品粉末適量于EP管中，甲醇充分溶解，再各管吸取適量標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行混合，0.22μm微孔濾膜過濾。

2）樣品溶液制備 精密稱取苦蕎麩皮黃酮粗品及精品10 mg，10 mL甲醇充分溶解，0.22μm微孔濾膜過濾。

3）色譜條件 參照文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行改進(jìn)。Intersustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～25 min，15%～25%A；25～35 min，25%～50%A；35～45 min，50%～90%A；45～55 min，90%A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫35℃；檢測波長360 nm；進(jìn)樣量20 μL。檢測后與混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗的均值，數(shù)據(jù)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算其均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎麩皮黃酮粗品與精品的抑菌效果比較

2.1.1 抑菌圈測定打孔法測定苦蕎麩皮黃酮粗品與精品對試驗所選6種常見致病菌的抑制效果，結(jié)果見圖1和表1。由實驗結(jié)果可知，苦蕎麩皮黃酮提取物對供試菌均有一定抗菌活性，且對不同供試菌抑菌作用的大小具有顯著差異，其對革蘭氏陽性菌的抑菌活性強(qiáng)于對革蘭氏陰性菌的抑菌活性?？嗍w麩皮黃酮粗品對藤黃微球菌具有最強(qiáng)抑菌作用，其次為金黃色葡萄球菌和腸球菌，對大腸桿菌及沙門氏菌的抑制較弱。而相同濃度的精品對這5種供試菌的抑菌活性顯著強(qiáng)于粗品，且對志賀氏菌也表現(xiàn)出一定的抑制作用。以上結(jié)果表明苦蕎麩皮黃酮精品對供試菌的抑菌活性顯著強(qiáng)于苦蕎麩皮黃酮粗品。

圖1 苦蕎麩皮粗品與精品抑菌圈Fig.1 Inhibition zone of crude and refined flavonoids from tartary buckwheat bran

表1 苦蕎麩皮黃酮粗品與精品的抑菌圈直徑Table 1 Diameter of inhibition zone of crude and refined flavonoids from tartary buckwheat bran

2.1.2 MIC及MBC測定結(jié)果表2結(jié)果可知，苦蕎麩皮黃酮粗品對3種革蘭氏陽性菌的MIC值均為25 mg/mL，而在實驗最大質(zhì)量濃度100 mg/mL下，對志賀氏菌仍未能起抑制作用。而精品對這6種供試菌均具有較好的抑制作用，抑菌效果優(yōu)于粗品，且對于革蘭氏陽性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。從最小殺菌濃度結(jié)果可知，苦蕎麩皮黃酮粗品對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、藤黃微球菌的MBC值均在50 mg/mL，精品對革蘭氏陽性菌的殺菌效果比粗品好，其對金黃色葡萄球菌、腸球菌、藤黃微球菌的MBC值為25 mg/mL。

表2 苦蕎麩皮黃酮粗品與精品對6種供試菌的MIC值及MBC值Table 2 The MIC and MBC values of crude and refined tartary buckwheat bran flavone mg/mL

2.2 苦蕎麩皮黃酮粗品與精品單體成分分析

2.2.1 HPLC定性檢測為明確苦蕎麩皮黃酮粗品及精品的抑菌效果差異，采用HPLC對苦蕎黃酮粗品和精品進(jìn)行了成分分析。由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚的保留時 間 分 別 為17.108、21.693、35.328、38.586 min，將粗品與精品的出峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰保留時間進(jìn)行對比，可以看出粗品與精品中均有4個峰與標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚的出峰時間一致，初步表明苦蕎黃酮粗品和精品的主要黃酮成分均為蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素和山奈酚。

圖2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)品、苦蕎麩皮黃酮粗品、苦蕎麩皮黃酮精品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of flavonoids，crude tartary buckwheat bran flavone and refined tartary buckwheat bran flavone

2.2.2 HPLC定量檢測前期實驗結(jié)果表明，苦蕎麩皮黃酮精品抑菌效果優(yōu)于粗品，而兩者主要黃酮成分相同，因此對粗品及精品中蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素和山奈酚4種黃酮單體進(jìn)行定量分析。由表3可知，經(jīng)大孔樹脂富集精制后，苦蕎黃酮精品中蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素的含量均有所增加，精品的總黃酮含量可達(dá)79.50%，精制倍數(shù)可達(dá)2.84倍。

表3 苦蕎黃酮粗品與精品主要成分對比Table 3 The components and content of crude and refined flavonoids in tartary buckwheat bran

2.3 4種黃酮成分的抑菌活性研究

為明確4種黃酮成分在抑菌中的作用，測定了4種單體的抑菌活性，4種黃酮單體對6種供試菌的抑制作用具有選擇性和差異性。表4結(jié)果可知，槲皮素的抑菌活性最強(qiáng)，對5種供試菌的MIC值均為12.5 mg/mL；其次是山奈酚和山奈酚-3-O-蕓香糖苷，對6種供試菌的MIC值均在25 mg/mL及以下；蘆丁的抑菌活性較差，且無殺菌效果。

表4 4種黃酮單體對6種供試菌的MIC值及MBC值Table 4 MIC and MBC values of four flavonoid glycosides

3 結(jié) 語

苦蕎作為常見的藥食兩用作物，在食品加工中廣泛應(yīng)用，而其麩皮多被丟棄，作者探究了苦蕎麩皮黃酮類化合物對常見病原菌的抗菌活性，以期為苦蕎麩皮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。采用平板打孔法及二倍稀釋法對苦蕎麩皮粗品及精品的抑菌活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明苦蕎麩皮黃酮粗品及精品對大腸桿菌、志賀氏桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、腸球菌6種常見致病菌均有一定抑制作用，尤其是對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)。王麗娟等研究表明黑苦蕎中的黃酮類化合物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有較好的抑菌作用，這與本研究結(jié)果相一致[18]。

大孔樹脂富集后苦蕎麩皮黃酮的抑菌活性明顯優(yōu)于富集前，抑菌活性的強(qiáng)弱可能與黃酮含量存在量效關(guān)系或與其黃酮成分相關(guān)。通過HPLC對苦蕎麩皮黃酮粗品與精品黃酮類化合物的成分及含量進(jìn)行分析，大孔樹脂富集前后成分無變化，主要黃酮成分均為蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素和山奈酚，但精品中蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素的含量均有所增加，精品的總黃酮含量可達(dá)79.50%，精制倍數(shù)可達(dá)2.84倍。測定了4種黃酮單體的抑菌活性，研究表明含量最多的蘆丁的抑菌活性不佳，槲皮素的抑菌活性更強(qiáng)。槲皮素是黃酮醇的典型代表，它已被證實具有很強(qiáng)的抗菌活性，Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性細(xì)菌對槲皮素高度敏感，且研究表明[20]槲皮素與氨芐西林、頭孢拉定等抗生素聯(lián)合使用對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌能夠有效降低耐藥性，提高其抗菌活性。趙曉頔等[21]對從高良姜中分離得到的山奈酚的體外抗菌實驗表明山奈酚對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)抗菌活性。槲皮素與山奈酚對革蘭氏陽性菌的抑菌效果更強(qiáng)。

國內(nèi)外對山奈酚-3-O-蕓香糖苷抑菌活性的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚-3-O-蕓香糖苷對于常見食源性微生物顯示出一定抑菌效果。天然存在的黃酮類化合物大多以甙類形式存在，并在兩個芳環(huán)上常有—OH或—OCH取代基，其抗菌活性取決于其母體上羥基的取代程度。有研究表明黃酮分子中C4=O和C5—OH、C7—OH是抗菌活性的首要基團(tuán)，其次為C3—OH基團(tuán)，C3’—OH、C4’—OH也具備一定的抗菌活性，且類黃酮苷元比其相應(yīng)的糖苷具有更高的抗菌活性[22-23]。蘆丁和山奈酚-3-O-蕓香糖苷分別是槲皮素和山奈酚對應(yīng)的糖苷，它們的差異在C3位置，上述發(fā)現(xiàn)支持本研究中單體抑菌活性實驗的結(jié)果。此外，盡管蘆丁的抑菌活性弱，但有研究表明蘆丁可以增強(qiáng)黃酮類化合物的抗菌活性[24-25]。Muha-mmad等發(fā)現(xiàn)蘆丁與桑黃素單獨(dú)無活性，但聯(lián)合使用對供試細(xì)菌有活性[20]，且槲皮素與蘆丁、桑黃素三者聯(lián)合使用對供試菌的抑制作用比單獨(dú)作用有進(jìn)一步增強(qiáng)。這提示蘆丁可能通過增強(qiáng)其他3種黃酮化合物的抑菌活性，使苦蕎麩皮黃酮精品的抑菌活性優(yōu)于粗品。

通過對苦蕎麩皮總黃酮及其有效成分的抑菌活性的分析，發(fā)現(xiàn)苦蕎麩皮黃酮在抗菌方面具有廣泛的應(yīng)用潛力。使用大孔樹脂純化后可以有效提升其抑菌活性，苦蕎麩皮黃酮的抗菌活性成分蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素和山奈酚的抑菌能力大小具有一定的構(gòu)效關(guān)系，但4種黃酮單體的協(xié)同抑菌機(jī)理及苦蕎麩皮黃酮的體內(nèi)抗菌活性有待進(jìn)一步研究。本研究表明苦蕎麩皮通過浸提、濃縮、精制等技術(shù)手段，能很大提高其抑菌功能活性，提升其附加值，是一種有深度開發(fā)價值的天然抑菌資源。