模擬胃腸道消化對玉米低聚肽抗氧化作用的影響

張江濤， 張銘?zhàn)?高麗輝， 馮曉文， 谷瑞增， 李國明， 劉文穎*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司/北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京100015；2.北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院，北京100083；3.北京農學院 食品科學與工程學院，北京102206）

玉米缺乏賴氨酸等人體必需氨基酸，主要作為養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)的飼料，只有少部分用于食用。玉米蛋白粉、玉米粕、玉米皮和玉米黃粉等均為玉米加工的副產(chǎn)物，深度加工可提高玉米加工副產(chǎn)物的營養(yǎng)價值，促進玉米產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-3]。

玉米蛋白粉因為水溶性較差，目前主要用于生產(chǎn)飼料。玉米蛋白粉中蛋白質含量很高，質量分數(shù)達65%，此外還含有大量的類胡蘿卜素和黃色素，具有較強的抗氧化能力等多種生理活性。人體內具有特殊的寡肽吸收系統(tǒng)，其吸收效率高于氨基酸和蛋白質，可減輕小腸負擔，有益于人體健康。將玉米蛋白粉經(jīng)過特定的酶解工序處理，得到玉米低聚肽。玉米低聚肽具有抗氧化、抗疲勞等生理活性[4-5]，若作為食品添加劑添加于食品中或者作為原料做成肽類食品，具有廣闊的應用前景。

氧化應激與人體密切相關，當人體收到外源或者內源因素刺激時，會使人體抗氧化體系失衡，導致氧化應激，引發(fā)細胞凋亡、氧化損傷和線粒體損傷等，對人體健康產(chǎn)生影響[6]。玉米低聚肽具有較強的抗氧化活性，但經(jīng)人體腸道吸收后是否仍影響玉米低聚肽的抗氧化活性的研究鮮有報道，本研究旨在探索體外模擬胃腸道消化對玉米低聚肽抗氧化活性的影響，為玉米蛋白粉的高效持續(xù)利用提供可行性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米蛋白粉：北京中食海氏公司產(chǎn)品；JS-1細胞：上海冠導生物工程公司產(chǎn)品；2’，7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（DCFH-DA）、Fluorescein（熒光指示劑）、Trolox（水溶性維生素E）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、相對分子質量標準品（色譜純）：美國MCE公司產(chǎn)品；乙腈（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；ABTS自由基清除能力檢測試劑盒：碧云天生物技術研究所產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清：Hyclon公司產(chǎn)品；堿性蛋白酶、中性蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶：南寧東恒華道生物科技有限責任公司產(chǎn)品。

YCP-200 CO2培養(yǎng)箱：長沙華曦電子科技有限公司產(chǎn)品；Spectra MR多功能酶標儀：北京宏昌信科技有限公司產(chǎn)品；FACSCalibur流式細胞儀：美國BD公司產(chǎn)品；SpectraMax i3x多功能酶標儀：美國MD公司產(chǎn)品；LC-20A高效液相色譜儀：日本Shimadzu公司產(chǎn)品；HH-501型超級恒溫水浴鍋：常州國宇儀器制造有限公司產(chǎn)品；9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米低聚肽的制備參照馬勇等[7]的制備方法，詳細工藝流程為：取從北京中食海氏公司購買的玉米蛋白粉100 g，加入堿性蛋白酶（2 500 U/g）酶解，在50℃，pH為8.5條件下作用2 h；隨后中性蛋白酶（3 000 U/g）酶解，在50℃，pH為6條件下作用2 h。得到的水解物經(jīng)6 000 g離心后，上清液通過陶瓷膜和超濾膜分離純化，經(jīng)過低溫濃縮、脫色、凈化、噴霧干燥等一系列步驟獲得玉米低聚肽粉狀樣品。

1.2.2 玉米低聚肽體外模擬消化體外模擬胃環(huán)境消化試驗：將5.0 g玉米低聚肽和0.2 g NaCl于超純水中混合，pH計調節(jié)pH值=2.0，水浴溫度為37℃，隨后加入0.05 g胃蛋白酶在37℃下邊攪拌邊反應120 min，高溫條件下滅酶，待冷卻至27℃，調節(jié)pH值為7.5，容量瓶定容至100 mL?？瞻捉M除不加胃蛋白酶，其余操作工序不變[8-9]。

體外模擬腸環(huán)境消化試驗：將5.0 g玉米低聚肽和0.68 g KH2PO4于超純水中混合，pH值為7.5，設定水浴溫度37℃，立即加入0.05 g胰蛋白酶處理4 h，高溫滅酶，待冷卻至27℃后繼續(xù)加超純水到100 mL?？瞻捉M除不加胰蛋白酶外，其余條件不變[8，10]。

1.2.3 相對分子質量分布的測定使用高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)測定玉米低聚肽的相對分子質量，該系統(tǒng)配有TSKgel G2000SWXL色譜柱。流動相為體積分數(shù)0.1%三氟乙酸、45%乙腈和55%水溶液，流量為1.0 mL/min，柱溫為30℃，進樣量為10μL，紫外檢測波長為220 nm。用相對分子質量189（乙氨酰乙氨酰乙氨酸）、451（乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸）、12 400（細胞色素c）、40 000（過氧化物酶）的標準物質建立標準曲線。最后通過氨基酸分析儀分析玉米低聚肽的相對分子質量分布[11-13]。

1.2.4 DPPH自由基清除率測定用無水乙醇配制濃度為0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，用去離子水 將 樣 品 稀 釋 為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL，在96孔板中依次加入0.1 mL樣品與0.1 mL DPPH無水乙醇溶液，此為樣品組Ac；依次加入0.1 mL樣品與無水乙醇溶液，此為空白組A0；依次加入0.1 mL蒸餾水與0.1 mL DPPH無水乙醇溶液，此為對照組A1?；靹?，遮光處理，27℃反應0.5 h，517 nm處測定吸光值[14]。

1.2.5 羥基自由基清除率測定用去離子水配制1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL的 樣 品溶液，配制5 mmol/L水楊酸乙醇溶液，5 mmol/L FeSO4溶液和0.1 mL 5.6 mmol/L H2O2溶液。將0.1 mL各濃度的樣品溶液與0.2 mL水楊酸乙醇溶液，0.2 mL FeSO4溶液混勻，以0.1 mL H2O2溶液啟動反應，此為樣品組Ab；空白組（A0）以0.1 mL蒸餾水啟動反應；對照組（A1）將0.1 mL樣品溶液更改為0.1 mL蒸餾水。晃勻后，37℃水浴反應1 h，然后取各組反應液0.1～0.2 mL于96孔板中，測定510 nm處A值[15]。

1.2.6 ABTS自由基清除率測定ABTS測定采用Lin等[16]的方法進行，但略有修改。將7 mmol/L ABTS儲備液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合。讓混合物在室溫下黑暗中靜置12～16 h以產(chǎn)生ABTS·+。然后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋ABTS·+溶液。樣品也用相應的緩沖液稀釋。在96孔微孔板中加入200μL工作液和10μL樣品后，在734 nm處測定吸光度，用等體積0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液代替樣品作為空白。ABTS·+用磷酸鹽緩沖液稀釋，在波長為734 nm時，吸光值為0.70±0.02。以Trolox為標準抗氧化劑。計算ABTS自由基清除活性，并繪制Trolox濃度圖，以獲得標準曲線。最終樣品的抗氧化能力以mmol/g表示[17]。

1.2.7 ORAC值測定氧自由基吸收能力（ORAC）測定基于Coscueta等[18]提出的方法。反應在37℃下在75 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中進行，最終的分析混合物（200μL）含有100μL熒光素（0.8 μmol/L）、75μL AAPH（150 mmol/L）和25μL標準品或25μL樣品或25μL 75 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）。在120 min內記錄熒光（5 min/次，共24個循環(huán)）。使用激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm的酶標儀，黑色聚苯乙烯96孔微孔板。所有反應混合物制備重復3次。最終ORAC值表示為μmol/g Trolox[19]。

1.2.8 玉米低聚肽對HSC增殖影響測定對HSC細胞進行傳代培養(yǎng)，待細胞生長至試驗所需量，通過消化、離心、稀釋得到所需的細胞濃度1×105個/mL，每孔移取接種0.2 mL細胞懸液于96孔板中。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約1 d。用完全培養(yǎng)基配制50、100、200、400μg/mL的樣品，加入到細胞培養(yǎng)液中，空白對照孔不加樣品。細胞培養(yǎng)箱中持續(xù)孵育1 d后，收集培養(yǎng)液。各孔加入0.02 mL質量濃度為5 mg/mL的噻唑藍，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中反應約4 h，加入二甲基亞砜，震蕩0.5 h后，570 nm處測定吸光值[20]。

式中：X1為細胞增殖比；AX為樣品組吸光值；A0為空白對照組吸光值。

1.2.9 HSC細胞ROS測定將HSC細胞于6孔板培養(yǎng)，6個孔分別標記為空白組、模型組、胃（胰）蛋白酶對照組、胃（胰）蛋白酶消化組。2 d后除空白組以外，將100、400μg/mL的樣品加入到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。1 d后向6孔板中加入1.0 mL DCFH-DA，于細胞培養(yǎng)箱反應0.5 h后加入1.0 mL AAPH，過20 min后用流式細胞儀測定細胞熒光強度的變化[21]。

式中：X2為熒光強度比；AX為樣品組吸光值；A0為空白對照組吸光值。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析每組數(shù)據(jù)平行測定3次，使用Origin Pro 8.5軟件（OriginLab Corp.，Northampton，MA，USA）處理數(shù)據(jù)。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 消化前后玉米低聚肽相對分子質量分布

玉米低聚肽的相對分子質量主要集中在150～1 000，總比例占90%以上，表明其水溶性好、易吸收[4]。胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，玉米低聚肽的相對分子質量分布變化幅度不大，重均相對分子量分別下降1.47%、0.05%，與未消化組比較，均無顯著性變化（P＞0.05）（表1）。由此看出，玉米低聚肽對胃蛋白酶和胰蛋白酶消化均具有穩(wěn)定性，小肽尤其是具有抗氧化活性的短肽基本受蛋白酶作用的影響非常小。因此，玉米低聚肽是一種潛在的可能在消化后保持一定抗氧化活性的肽類物質。

表1 不同處理的玉米低聚肽相對分子質量分布Table 1 Relative molecular weight distribution of corn oligopeptides with different treatments

2.2 消化前后玉米低聚肽的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力是利用電子轉移和電荷中和原理，其非常穩(wěn)定，被廣泛用于測定抗氧化劑的功效[22]。當DPPH自由基含量逐漸變少時，溶液的顏色會由紫色逐漸變?yōu)闇\黃色[23]。圖1顯示了胃蛋白酶和胰蛋白酶消化前后對玉米低聚肽的DPPH自由基清除能力的變化。玉米低聚肽的DPPH自由基清除能力與濃度呈明顯的量效關系。模擬消化對玉米低聚肽DPPH自由基清除能力無顯著性影響（P＞0.05），在質量濃度為20 mg/mL時清除率都達到75%～85%，模擬胃環(huán)境消化前后IC50值分別約為1.41、1.50 mg/mL，模擬腸環(huán)境消化前后IC50值分別約為1.39、1.48 mg/mL，說明玉米低聚肽具有較高的DPPH自由基清除能力和消化穩(wěn)定性。王貝貝等[24]以羊皮膠原肽為試驗原料，研究了模擬胃腸消化對羊皮膠原肽抗氧化活性的影響，其DPPH自由基清除能力變化趨勢與本研究一致。

圖1 不同處理的玉米低聚肽對DPPH自由基清除作用Fig.1 DPPH free radical scavenging effect of corn oligopeptides with different treatments

2.3 消化前后玉米低聚肽的羥基自由基清除能力

羥基自由基作為氧自由基中最活潑的一種，可以對幾乎所有鄰近的生物分子造成嚴重損害。圖2為玉米低聚肽經(jīng)模擬胃環(huán)境和模擬腸環(huán)境消化前后的羥基自由基清除能力變化。玉米低聚肽的羥基自由基清除能力在試驗濃度范圍內與濃度呈正相關。經(jīng)模擬消化處理后，其羥基自由基清除能力與空白對照組相比，僅有輕微下降，無顯著性變化（P＞0.05）。玉米低聚肽在模擬胃環(huán)境消化前后IC50值分別約為10.3、12.3 mg/mL，模擬腸環(huán)境消化前后IC50值分別約為8.1、9.5 mg/mL，因此，模擬胃腸消化對玉米低聚肽羥基自由基清除能力影響很小，消化后仍具有較高的羥基自由基清除能力?？赡苁怯捎谟衩椎途垭闹写嬖诤苌俚哪鼙幌柑禺愋运獾慕Y構，使得玉米低聚肽水解物羥基自由基清除能力仍保持穩(wěn)定[25]。

圖2 不同處理的玉米低聚肽對羥基自由基清除作用Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging effect of corn oligopeptides with different treatments

2.4 消化前后玉米低聚肽的ABTS自由基清除能力

該方法以ABTS為顯色引發(fā)劑，加入抗氧化性物質后ABTS自由基的電荷被中和，顏色變淺，吸光值降低，根據(jù)下降趨勢可表征出所檢測物質抗氧化活性的強弱[26]。圖3為根據(jù)Trolox標準品繪制的ABTS標準曲線。表2為消化酶處理前后玉米低聚肽的ABTS自由基清除能力。可以看出模擬胃環(huán)境消化處理提高了玉米低聚肽的ABTS自由基的清除能力，提高幅度為25.47%；同時模擬腸環(huán)境消化處理也提高了玉米低聚肽的ABTS自由基的清除能力，提高幅度為1.39%。毛小雨[27]以蕓豆蛋白為研究對象，結果表明胃腸道消化提高了蕓豆蛋白ABTS自由基的清除能力。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是胃、胰蛋白酶處理使得玉米低聚肽的不同肽段中的抗氧化氨基酸殘基更加充分暴露而使總抗氧化活性有了較大幅度提升。

圖3 ABTS標準曲線Fig.3 ABTSstandard curve

表2 不同處理的玉米低聚肽對ABTS自由基清除作用Table 2 ABTS free radical scavenging effect of corn oligopeptides with different treatments

2.5 消化前后玉米低聚肽的ORAC值

ORAC法被譯為抗氧化能力指數(shù)或氧自由基清除能力，是基于氫原子轉移的評價方法，采用熒光定量，靈敏度高。不同濃度Trolox標準品的動態(tài)熒光衰減曲線見圖4，繪制的標準曲線如圖5所示，玉米低聚肽消化前后ORAC值的變化結果如表3所示。模擬胃腸消化使得玉米低聚肽的ORAC值降低了10.4%；而胰蛋白酶消化使得玉米低聚肽的ORAC值提高了1.4%。這與豌豆低聚肽經(jīng)模擬胃腸消化后的變化規(guī)律一致[20]?？赡苁怯捎谖傅鞍酌柑禺愋悦附饬瞬糠志哂懈呋钚缘碾亩?，使得低聚肽的氧自由基清除能力有一定的降低。在模擬腸道消化條件下，一些肽段被胰蛋白酶特異性酶解成如二肽或三肽以及氨基酸，某些相對分子質量越小的肽段抗氧化活性越強，從而提高ORAC值[28]。

圖4 不同濃度Trolox的動態(tài)熒光衰減曲線Fig.4 Dynamic fluorescence attenuation curve of Trolox at different concentrations

圖5 Trolox標準曲線Fig.5 Trolox standard curve

表3 不同處理的玉米低聚肽的ORAC值Table 3 ORAC values of corn oligopeptides with different treatments

2.6 消化前后玉米低聚肽對HSC增殖的影響

以未加入玉米低聚肽的HSC為空白對照，經(jīng)數(shù)據(jù)處理分析得到結果如圖6所示。在細胞生長過程中加入不同消化處理、不同質量濃度（50、100、200、400μg/mL）的玉米低聚肽，均能使得HSC細胞增殖速度加快，但量效關系不明顯，且與空白對照組增殖速度相比差別不明顯（P＞0.05）。說明玉米低聚肽在試驗濃度范圍內均不會影響HSC的正常生長。綜合細胞增殖實驗結果，選擇100、400μg/mL作為測定消化前后玉米低聚肽對細胞ROS清除能力的質量濃度。

圖6 玉米低聚肽對HSC增殖的影響Fig.6 Effect of corn oligopeptides on HSC proliferation

2.7 消化前后玉米低聚肽對HSC中ROS生成的影響

ROS是生物體中內源性和外源性氧自由基的總稱，當機體機能正常時，機體內自由基生成和清除能力相平衡；當受到紫外線、金屬離子刺激及體內炎癥反應發(fā)生時，將引起細胞內ROS水平的升高，過量的ROS會進攻細胞的脂質膜、DNA等，進而誘發(fā)相關疾病[29-30]。由圖7可知，相對于空白組，陽性模型組細胞內ROS含量顯著提高約40%～60%（P＜0.05），表明ROS陽性模型建立成功。玉米低聚肽作用后對細胞內ROS具有明顯的清除能力，相對于陽性模型組，降低了約20%～30%（P＜0.05）。模擬胃環(huán)境消化后，100μg/mL和400μg/mL玉米低聚肽的ROS清除能力增強了，分別增強了1.42%、16.78%，模擬腸環(huán)境消化后降低了100μg/mL玉米低聚肽的ROS清除能力，降低了1.71%，而400μg/mL玉米低聚肽對ROS清除能力提高了2.61%，但模擬胃腸液消化后對其ROS清除能力均沒有顯著性影響（P＞0.05）。由此可見，不同質量濃度的玉米低聚肽經(jīng)胃腸消化后對ROS清除能力不同，經(jīng)模擬胃環(huán)境和模擬腸環(huán)境消化后玉米低聚肽的抗氧化活性有所不同，可能是因為兩種酶的作用位點和作用機理不同，使得肽水解成不同的肽段，從而造成抗氧化作用的不同。

圖7 玉米低聚肽對HSC中ROS生成的影響Fig.7 Effect of corn oligopeptides on ROS generation in HSC

3 結 語

以兩步酶解法工序加工玉米蛋白粉制備得到玉米低聚肽，通過測定相對分子質量分布、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、ORAC值以及ROS試驗，研究了模擬胃腸消化對玉米低聚肽抗氧化作用的影響。結果表明，玉米低聚肽的主要成分為相對分子質量低于1 000的短肽，模擬胃環(huán)境、模擬腸環(huán)境消化后重均相對分子質量分別降低1.47%、0.05%。模擬胃環(huán)境消化前后，DPPH自由基清除能力IC50值分別約為1.41、1.50 mg/mL，模擬腸環(huán)境消化前后，IC50值分別約為1.39、1.48 mg/mL；模擬胃環(huán)境消化前后，羥基自由基清除能力IC50值分別約為10.3、12.3 mg/mL，模擬腸環(huán)境消化前后，IC50值分別約為8.1、9.5 mg/mL；模擬胃環(huán)境和腸環(huán)境消化后，ABTS自由基清除能力分別增加了25.47%、1.39%；模擬胃環(huán)境消化后ORAC值降低了10.4%，模擬腸環(huán)境消化后ORAC值增加了1.4%；模擬胃環(huán)境消化后，100μg/mL和400μg/mL玉米低聚肽對ROS清除能力分別提高1.42%、16.78%，模擬腸環(huán)境消化后，100μg/mL玉米低聚肽對ROS清除能力降低1.71%，而400μg/mL玉米低聚肽對ROS清除能力提高2.61%。本試驗證明玉米低聚肽在經(jīng)模擬胃腸液消化后仍具有較強的抗氧化活性。