微生物多級(jí)發(fā)酵對(duì)中藥方劑功能活性及有效組分的影響

張紅艷， 冉淦僑， 韓姍姍， 殷 紅， 譚建新， 張 強(qiáng)*

（1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，陜西 西安710043；2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心，陜西 西安710043；3.陜西樂麗鑫生物科技有限公司，陜西 渭南714005）

發(fā)酵作為一種重要的中藥炮制方法，其目的是改變?cè)兴幮?，產(chǎn)生新的治療作用。發(fā)酵后的中藥制劑具有去毒存效、增強(qiáng)藥效、提高中藥提取率等作用[1]。中藥的有效成分主要存在于植物細(xì)胞中，被細(xì)胞壁等組織包裹在細(xì)胞內(nèi)部，而微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶系可以將植物細(xì)胞壁降解，促使有效成分更易釋放，從而起到增加藥效的作用。

傳統(tǒng)發(fā)酵炮制通常是利用環(huán)境中的野生微生物對(duì)藥渣或藥液進(jìn)行自然發(fā)酵，存在條件簡陋、易染雜菌、發(fā)酵質(zhì)量難以保證等缺點(diǎn)[2]。

現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)是利用益生菌和酶特有的生物轉(zhuǎn)化能力，使中草藥的有效成分被充分提取，不僅能減毒增效，還能產(chǎn)生新的易被人體吸收的活性物質(zhì)[3]。

國內(nèi)許多研究者[4-9]對(duì)中藥發(fā)酵進(jìn)行了研究，結(jié)果表明中藥發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、多糖以及總黃酮、總皂苷等都有不同程度的增加。潘楊等[10]研究表明發(fā)酵炮制可使中藥巴豆的毒性降低。蘇建樹等[11]研究發(fā)現(xiàn)川烏、附子經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，烏頭堿、次烏頭堿等毒性物質(zhì)顯著減少。以上大多數(shù)研究都是采用單一菌株進(jìn)行發(fā)酵或者是固體發(fā)酵，對(duì)多菌株多級(jí)液體發(fā)酵中藥的研究較少。

中藥方劑JGZF是由藥食同源組分配比煎熬而成。JGZF藥液含有牛膝皂苷、蛻皮甾酮、齊墩果酸及其衍生物、地骨皮甲素、菟絲子糖苷酸、肉桂酸、檸檬酸、壬二酸、棕櫚酸甲酯、杜仲木脂素、L-酪氨酸、精氨酸、金絲桃苷等天然活性成分，同時(shí)富含鈣、鐵、鋅、鎂等多種微量元素。作者采用3種方式（直接煎熬、自然發(fā)酵、人工發(fā)酵）對(duì)JGZF進(jìn)行處理，對(duì)比不同處理方式下JGZF藥液中微量元素、抗氧化活性、抑菌活性以及其他藥效成分的變化，旨在考察不同的發(fā)酵炮制方法對(duì)JGZF方劑的功能活性及有效組分的影響，為今后發(fā)酵炮制技術(shù)在JGZF方劑中的工業(yè)化應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 中藥方劑JGZF桂圓、杜仲、蒺藜、山藥、菟絲子、枸杞、當(dāng)歸、懷牛膝、魚鰾，按一定比例混合粉碎而成，由陜西樂麗鑫生物有限公司提供。

1.1.2 菌種產(chǎn)朊假絲酵母 （Candida utilisCICC31126）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeHansen GIM2.137）、 植 物 乳 桿 菌（Lactobacillus plantarumCICC20265）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseiCGMCC1.574）、 青 春 雙 歧 桿 菌（Bifidobacterium adolensentisCICC6176）：由陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所保藏提供；高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基 （g/L）：麥芽膏粉130，pH 6.4±0.1；強(qiáng)化羧菌培養(yǎng)基（g/L）：蛋白質(zhì)10.0牛肉粉10.0，酵母粉3.0，葡萄糖5.0，可溶性淀粉1.0，氯化鈉5.0，醋酸鈉3.0，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，pH 6.8±0.1（25℃）；MRS肉汁培養(yǎng)基（g/L）：蛋白質(zhì)10.0，牛肉粉8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氫二鉀2.0，檸檬酸氫二銨2.0，乙酸鈉5.0，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.04，吐溫80 1.0，pH 5.7±0.2（25℃）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海秋佐科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FL-30流水式中藥粉碎機(jī)：瑞安市富力中藥機(jī)械廠產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 直接熬制取1kg中藥按配方比例混合粉碎后，按質(zhì)量比1∶2加入飲用水浸泡煎熬兩次，濾網(wǎng)粗濾后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60℃）濃縮藥液至1 L，離心 （10 000 r/min，20 min）后滅菌 （121℃，20 min），得到直接熬制的中藥原液。

1.3.2 自然發(fā)酵取1 kg中藥按配方比例混合粉碎后，按質(zhì)量比1∶4加入飲用水浸泡1 h后用食醋調(diào)pH至4.8～5.0，加入復(fù)合酶粉（8 g/L），37℃酶解過夜，酶解后的中藥按上述方法煎熬兩次，濾網(wǎng)粗濾后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60℃）濃縮藥液至1 L，離心（10 000 r/min，20 min）后滅菌（121℃，20 min），得到中藥酶解原液。

將酶解后的藥液倒入已滅菌的玻璃發(fā)酵罐中，室溫下自然發(fā)酵5周。定期取樣檢測(cè)營養(yǎng)活性成分。

1.3.3 人工發(fā)酵取1 kg中藥按配方比例混合粉碎后，按1.3.2制備中藥酶解原液，按比例將產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、面包酵母（質(zhì)量比為2∶1∶1）接入到上述的酶解中藥原液中，30℃好氧發(fā)酵7 d（有濃郁的酒香味道）。好氧發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行滅菌（121℃，滅菌20 min），再按比例接入植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、青春雙歧桿菌（質(zhì)量比為1∶1∶1），37℃，厭氧（靜置）發(fā)酵7 d。厭氧發(fā)酵結(jié)束后，將中藥發(fā)酵液按之前方法煎熬兩次，兩次煎熬的藥液混合在一起，離心（10 000 r/min，20 min）去除沉淀，上清經(jīng)雙層濾紙過濾后滅菌（121℃，20 min），得到人工發(fā)酵的中藥原液。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

發(fā)酵樣品外包檢測(cè)全部冷鏈配送，微量元素檢測(cè)由陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所渭南大荔基地完成，抗氧化活性檢測(cè)由杭州晶百檢測(cè)技術(shù)有限公司完成，基于代謝組的中藥有效成分由上海阿趣生物科技有限公司完成。

1.4.1 微量元素檢測(cè)微量元素檢測(cè)參照《食品中鈣的測(cè)定GB5009.92—2016》《食品中鐵的測(cè)定GB5009.90—2016》《食品中鎂的測(cè)定GB5009.241—2017》《食品中銅的測(cè)定GB5009.13—2017》《食品中鋅的測(cè)定GB5009.14—2017》等標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2 抗氧化活性成分檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)：參考《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定GB/T5009.171—2003》；清除DPPH自由基能力的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行；羥基自由基清除作用的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行；總多酚的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行；抑菌活性的測(cè)定：牛津杯瓊脂擴(kuò)散法[15]?；诖x組的中藥有效成分分析：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對(duì)JGZF中微量元素質(zhì)量濃度的影響

微量元素是中草藥組分的重要組成部分，其不僅可以作為人體必需的營養(yǎng)物加以補(bǔ)充，還可能具有特殊的生物活性[16]。微量元素除了游離移動(dòng)狀態(tài)存在形式，還有一部分主要存在于植物的細(xì)胞壁中。

對(duì)直接熬制、自然發(fā)酵以及人工發(fā)酵3種方式得到的JGZF藥液的5種常見微量元素質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。JGZF人工發(fā)酵液中微量元素質(zhì)量濃度順序?yàn)椋衡}（10.23 mg/L）＞鐵（5.74 mg/L）＞鎂（2.73 mg/L）＞鋅（1.91 mg/L）＞銅（0.24 mg/L）。跟直接熬制相比，JGZF經(jīng)發(fā)酵（自然發(fā)酵和人工發(fā)酵）處理后，微量元素（鈣、鐵、鋅、銅）的含量得到了顯著提高。由于兩種發(fā)酵方式在熬制前均有浸泡和酶解的步驟，充分的浸泡以及復(fù)合酶對(duì)藥材中的纖維素及半纖維素等物質(zhì)的降解，再加上發(fā)酵過程中微生物的快速生長也會(huì)促使JGZF溶出更多的微量元素。結(jié)果顯示，人工發(fā)酵與直接熬制相比，鋅元素提高了7.3倍，銅元素提高了6.8倍，鐵元素提高了3.7倍，鈣元素提高了2.2倍。

圖1 不同處理方式對(duì)JGZF中微量元素質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effects of different treatments methods on the contents of trace elements in JGZF

2.2 不同處理方式對(duì)JGZF體外抗氧化活性的影響

中藥的酚類、黃酮、生物堿、多糖、皂苷等有效成分均具有較好的抗氧化活性，可調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體特異性及非特異性免疫功能，抑制自由基的產(chǎn)生，或直接對(duì)抗自由基對(duì)細(xì)胞及組織的損傷作用[17]。實(shí)驗(yàn)采用紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)藥液的過氧化物歧化酶SOD活性、DPPH自由基的清除能力、羥基自由基的清除能力以及總多酚含量來評(píng)價(jià)不同處理方式對(duì)JGZF體外抗氧化活性的影響。

本實(shí)驗(yàn)條件下，自然發(fā)酵方式的JGZF藥液中生長的微生物經(jīng)鏡檢主要是酵母菌和少許雜菌，而人工發(fā)酵好氧階段接入復(fù)合酵母菌，厭氧階段接入復(fù)合乳酸菌。酵母菌本身就能代謝出具抗氧化功能的甘露聚糖等物質(zhì)，而且微生物在發(fā)酵代謝過程中分泌的胞外酶可將藥物成分分解轉(zhuǎn)化，會(huì)產(chǎn)生種類豐富的初生或次生代謝產(chǎn)物，有些代謝產(chǎn)物本就是很好的活性物質(zhì)[18]。此外，以JGZF中藥液中的一些代謝產(chǎn)物為前體，再經(jīng)過一系列酯化、氧化、葡萄糖基化等多種生物轉(zhuǎn)化途徑后，也會(huì)促使生成新的活性成分。由圖2可見，跟直接熬制相比，JGZF經(jīng)自然發(fā)酵和人工發(fā)酵處理后，SOD活性和羥基自由基的清除能力均有提高。此外人工發(fā)酵的另外兩個(gè)抗氧化活性指標(biāo)（DPPH自由基的清除能力和總多酚含量）也有顯著提高，分析原因如下：厭氧階段接入的乳酸菌具有抵抗氧脅迫、調(diào)控信號(hào)通路途徑、清除自由基系統(tǒng)、抑制脂質(zhì)過氧化，具有一定的抗氧化能力[19]。人工發(fā)酵接入的菌種更有針對(duì)性，采用好氧與厭氧微生物的多級(jí)發(fā)酵方式更有利于抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生和富集。

圖2 不同處理方式對(duì)JGZF中活性成分的影響Fig.2 Effects of different treatments methods on the active ingredients in JGZF

檢測(cè)結(jié)果顯示，JGZF人工發(fā)酵液中的體外抗氧化活性結(jié)果為：SOD活性35.7 U/mL，DPPH自由基的清除能力51.4%，羥基自由基的清除能力117.6%，總多酚質(zhì)量濃度為5.65×103μg/mL。與直接熬制相比，SOD活性提高了1.5倍，DPPH自由基的清除能力提高了2.2倍，羥基自由基的清除能力提高了4.2倍，總多酚含量提高了2.2倍。

2.3 不同發(fā)酵方式對(duì)JGZF抑菌活性的影響

食源性疾病對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的危害，有60%以上的食源性疾病為細(xì)菌性致病菌污染食物所致[20]。采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法測(cè)算JGZF藥液對(duì)4種標(biāo)準(zhǔn)菌株（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、志賀氏菌、沙門氏菌）的抑菌圈直徑，考察3種不同處理方式（直接熬制、自然發(fā)酵、人工發(fā)酵）對(duì)JGZF中藥液抑菌活性的影響。

結(jié)果如圖3所示，跟直接熬制相比，自然發(fā)酵JGZF對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌的抑制效果得到了顯著提高。其中，對(duì)沙門氏菌的抑菌效果提高了2.5倍，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果提高了2.3倍。而對(duì)志賀氏菌的抑菌效果幾乎不變，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性略有下降。人工發(fā)酵JGZF和直接熬制相比，沙門氏菌的抑菌效果提高了2.2倍，大腸桿菌的抑菌效果提高了1.9倍，而志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果卻略有降低。

圖3 不同發(fā)酵方式對(duì)JGZF抑菌活性的影響Fig.3 Effects of different treatments methods on antibacterial activity of JGZF

對(duì)結(jié)果分析可知，酶降解纖維素、木質(zhì)纖維素和益生菌發(fā)酵可促進(jìn)藥液釋放更多的抑菌活性成分，而且益生菌自身代謝系統(tǒng)有可能產(chǎn)生了新的抗菌活性物質(zhì)[21]，例如厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸、丁酸等一些有機(jī)酸[22]，也可能是能增強(qiáng)藥液抑菌活性的原因之一。此外，發(fā)酵過后部分抑菌活性有所降低的原因推測(cè)可能與微生物將一些抑菌活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無活性的物質(zhì)有關(guān)。綜上所述，中藥組分和選用的菌種是直接影響中藥發(fā)酵液具體抑菌功能的兩大因素。

2.4 不同處理方式對(duì)JGZF主要有效組分的影響

中藥發(fā)酵炮制過程也是中藥化學(xué)成分變化及藥效偏轉(zhuǎn)的過程，單一化學(xué)成分研究很難反映炮制產(chǎn)品整體質(zhì)量的變化。而對(duì)中藥液進(jìn)行高通量檢測(cè)，運(yùn)用植物代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)海量數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別，可以對(duì)炮制品化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行全面研究[23]。作者采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)藥液樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測(cè)、提取、分類及識(shí)別，重在考察不同處理方式對(duì)JGZF主要有效組分的影響。

經(jīng)檢測(cè)，人工發(fā)酵JGZF中最多的有效成分如圖4所示，依次為：牛膝皂苷＞檸檬酸＞壬二酸＞蛻皮激素＞齊墩果酸＞肉桂酸＞金盞花苷E＞蒺藜皂苷K＞菟絲子糖苷酸A3＞地骨皮甲素＞甜菜堿（三甲基甘氨酸）＞香豆素糖苷＞竹節(jié)參皂苷IVA＞山奈酚3-龍膽雙糖苷＞硼替佐米（二肽）＞棕櫚酸甲酯＞川芎內(nèi)酯＞L-酪氨酸＞肉桂丙烯醛＞菟絲子糖苷酸A2。將上述20種主要的有效成分進(jìn)行歸類，詳見表1。

圖4 不同處理方式對(duì)JGZF主要有效組分的影響Fig.4 Effects of different treatments methods on the main medicinal ingredients of JGZF

表1 人工發(fā)酵JGZF中的主要藥效成分Table 1 Main medicinal ingredients in artificially fermented JGZF

由圖4還可以看出，牛膝皂苷和檸檬酸是JGZF人工發(fā)酵液中含量最高的兩種藥效物質(zhì)，含量對(duì)比：人工發(fā)酵＞直接熬制＞自然發(fā)酵，分析原因可能跟酶解過程增加牛膝皂苷的溶出以及人工發(fā)酵接入乳酸菌可促使葡萄糖轉(zhuǎn)化成部分檸檬酸[24]有關(guān)。而自然發(fā)酵的微生物生長除了酵母菌還會(huì)有其他雜菌，這可能是導(dǎo)致牛膝皂苷前體被降解的原因。同時(shí)也能看出蛻皮激素、香豆素糖苷、異麥芽糖、金絲桃苷等在兩種方式發(fā)酵后比直接熬制的含量降低，應(yīng)該跟兩種發(fā)酵中都存在酵母菌有關(guān)，具體機(jī)理和轉(zhuǎn)化途徑待進(jìn)一步研究分析。

人工發(fā)酵前后JGZF藥液中藥效成分的變化結(jié)果如圖5所示。L-苯丙氨酸（人體必需氨基酸）、黃芩素（抗炎）、色胺（血清張力素）、硬脂酸（潤滑液）、Tribestin（睪丸激素）和Prototribestin（睪丸激素）的含量增加了上億倍；Parvispinoside C（蒺藜皂苷）的含量增加了上千倍；雙氯非那胺（青光眼藥）和桃葉珊瑚苷（護(hù)肝）的含量增加了數(shù)百倍。同時(shí)，人工發(fā)酵處理后某些物質(zhì)的含量也被降低了。比如，五味子苷B（蒺藜皂苷，活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)）、去甲基蟛蜞內(nèi)酯（香豆素，抗炎）、7-羥基香豆素（解痙鎮(zhèn)痛）和脫乙酰谷氨酸（抗炎鎮(zhèn)痛）的含量降低了上億倍；槲皮素-3-O-木糖苷（刺激神經(jīng)中樞）、甘油二酯、紫云英（黃芪素，抗炎、抗氧化）、氯法齊明（抗炎藥）、蘆丁、多肽、氨基香豆素（抗菌藥）和松酯醇二葡萄糖苷（杜仲木脂素，鎮(zhèn)痛藥）的含量降低了數(shù)百倍。

圖5 人工發(fā)酵前后JGZF中有效成分的變化Fig.5 Changes of medicinal ingredients in JGZF before and after artificial fermentation

3 結(jié)語

1）跟直接熬制相比，中藥方劑JGZF經(jīng)自然發(fā)酵和人工發(fā)酵處理后，其微量元素鋅、銅、鐵和鈣的含量得到了顯著提高，這是由于自然發(fā)酵和人工發(fā)酵方式中浸泡、酶解步驟以及微生物的快速生長促進(jìn)了藥液中微量元素的溶出。

2）人工發(fā)酵能顯著提高JGZF的體外抗氧化活性。與直接熬制相比，人工發(fā)酵JGZF藥液中SOD活性提高了1.5倍，DPPH自由基的清除能力提高了2.2倍，羥基自由基的清除能力提高了4.2倍，總多酚含量提高了2.2倍。微生物在發(fā)酵代謝過程中會(huì)產(chǎn)生種類豐富的初生或次生代謝活性產(chǎn)物，經(jīng)過一系列酯化、氧化、葡萄糖基化等生物轉(zhuǎn)化途徑后，生成新的活性成分。而且有針對(duì)性性的人工接種多級(jí)發(fā)酵更有利于抗氧化活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

3）發(fā)酵后的JGZF中藥液對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌活性更強(qiáng)，但對(duì)志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性不變或略有降低。生物酶降解纖維素等、益生菌發(fā)酵均可促使藥液釋放或者產(chǎn)生更多抑菌成分，同時(shí)微生物也可能將一些抑菌活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無活性物質(zhì)。

4）基于代謝組學(xué)技術(shù)的分析，結(jié)果表明JGZF經(jīng)人工發(fā)酵后，人體必需氨基酸L-苯丙氨酸、抗炎物質(zhì)黃芩素等藥效物質(zhì)含量顯著增加；五味子苷B、7-羥基香豆素、農(nóng)藥殘留等含量有顯著降低。中藥發(fā)酵過程會(huì)產(chǎn)生或者降解一些藥效物質(zhì)，從而導(dǎo)致藥效含量有不同的變化。有效成分、非有效成分以及其他特殊物質(zhì)與發(fā)酵微生物之間的相互作用機(jī)制、生物轉(zhuǎn)化途徑有待更深入的研究。

總體來說，微生物發(fā)酵炮制，尤其是人工定向發(fā)酵可以促進(jìn)中藥液微量元素的溶出、有利于抗氧化活性物質(zhì)的產(chǎn)生、增強(qiáng)了藥液對(duì)部分致病菌的抑菌活性、提高了部分藥效成分含量并且降低了部分農(nóng)藥殘留，對(duì)中藥材的減毒增效具有積極意義。