miRNA研究向結(jié)直腸癌臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的現(xiàn)狀

李晨，杜曉輝

(解放軍總醫(yī)院普外科，北京 100853)

隨著社會生活方式多元化的改變，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)防控面臨著前所未有的挑戰(zhàn)，我國已將CRC納入精準(zhǔn)扶貧專項救治九大病種之一。目前基因工程研究雖然在CRC診治方面取得了可喜的成績，但諸多研究仍停留在實驗室階段，即便涉及臨床應(yīng)用的研究，細(xì)胞水平研究仍占多數(shù)，僅有少部分進(jìn)入動物實驗階段，能夠用于臨床的非常有限。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)作為連接基礎(chǔ)研究和臨床治療的“橋梁”和以將醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床實際運用為宗旨。我國的國家轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心建設(shè)尚處于起步運作階段，但已成為落實健康中國國策和促進(jìn)我國經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展創(chuàng)新驅(qū)動戰(zhàn)略的重要生力軍[1]。“以轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)為核心”的醫(yī)學(xué)研究理念，正在引領(lǐng)國內(nèi)醫(yī)療多學(xué)科臨床應(yīng)用的不斷突破，通過不斷提升醫(yī)療技術(shù)，更好地惠及患者。將微RNA(microRNA，miRNA)實驗室研究成果轉(zhuǎn)化為臨床成果，并加速兩者之間的轉(zhuǎn)化，已成為業(yè)界共識。CRC缺少早期檢測手段，手術(shù)治療受到相關(guān)適應(yīng)證的制約，且缺乏有效的術(shù)后復(fù)發(fā)及化療監(jiān)控措施[2]，防控形勢嚴(yán)峻?，F(xiàn)對目前miRNA在CRC早期篩查及CRC手術(shù)過程的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用現(xiàn)狀予以綜述。

1 miRNA在CRC早期篩查中的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用現(xiàn)狀

由于我國工業(yè)化、城市化進(jìn)程的加快，我國常見癌癥譜同時表現(xiàn)出發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家的雙重特征，其中CRC的變化尤為突出。CRC發(fā)病人數(shù)劇增，患者發(fā)病年齡結(jié)構(gòu)與世界CRC發(fā)病年齡結(jié)構(gòu)逐漸接近，由老年人群向青壯年人群轉(zhuǎn)變[3]；且男性發(fā)病居高不下。miRNA在CRC早期篩查中的臨床應(yīng)用起步較早，其中CRC糞便、血液miRNA檢測已開始臨床應(yīng)用，但組織miRNA檢測仍處于實驗室階段。miRNA作為CRC分子生物標(biāo)志物，完成CRC早期篩查的miRNA臨床轉(zhuǎn)化并將其應(yīng)用于臨床診治還面臨許多問題。

1.1糞便miRNA檢測CRC的現(xiàn)狀 糞便標(biāo)本易采集，故糞便miRNA檢測在CRC早期篩查中的應(yīng)用比較廣泛。miRNA具有高度穩(wěn)定性，Lee等[4]發(fā)現(xiàn)，體液中miRNA對于核糖核酸酶(Rnases)的自我消化具有抵抗能力，且糞便樣本中miRNA也保持在一定的濃度。

miRNA在CRC篩查中具有一定優(yōu)勢。Choi等[5]報道，早期CRC患者糞便中腫瘤細(xì)胞含量高，易被檢出。對糞便miRNA表達(dá)篩查CRC的敏感性及特異性的多變量分析顯示，miR-92a和miR-144與大腸癌的發(fā)生顯著相關(guān)，糞便miR-92a和miR-144檢測大腸癌的敏感性和特異性良好。研究顯示，miR-29a、miR-224、miR-17、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-224均在糞便中高表達(dá)[6-7]。

糞便內(nèi)環(huán)境復(fù)雜惡劣、經(jīng)過漫長的通道和漫長的時間排出體外、人RNA占比偏小是miRNA檢測臨床應(yīng)用的主要問題。糞便miRNA作為的CRC診斷標(biāo)志物，需進(jìn)一步優(yōu)化標(biāo)本采集、標(biāo)本分離、標(biāo)本提取和檢測技術(shù)等糞便miRNA檢測程序，從而大幅度提升標(biāo)本的可測性、再現(xiàn)性[8]，以真正實現(xiàn)CRC糞便miRNA檢測從實驗室研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。

1.2血液miRNA檢測CRC的現(xiàn)狀 miRNA可以被分泌到細(xì)胞外，是細(xì)胞微環(huán)境和機(jī)體體液中的重要調(diào)控分子，在人體外周血中保持著一定濃度。研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者血清中某些miRNA異常表達(dá)[9-11]。ElSharawy等[12]分析了血清miRNA攜帶顆粒的有效濃度是否可作為檢測生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在742個miRNA標(biāo)本中，其中45個CRC標(biāo)本的全血清和顆粒濃縮血清存在顯著差異，提示通過檢測血清miRNA載體可以檢測CRC相關(guān)的病理變化。

目前臨床常用的癌胚抗原、糖類抗原(carbohydrate antigen,CA)19-9、CA125診斷結(jié)直腸癌的靈敏度僅為50%～65%[13]。CRC患者外周血中miRNA的生物學(xué)活性和穩(wěn)定性良好，具有獲取方便、容易保存、不易降解等特點，且篩查CRC的特異性、敏感性較癌胚抗原、CA19-9、CA125等標(biāo)志物更具優(yōu)越性。

血液的稀釋效應(yīng)對單位體積miRNA起始含量的影響限制了血液miRNA檢測CRC的臨床應(yīng)用，導(dǎo)致血液miRNA檢測的準(zhǔn)確性無法保證；細(xì)胞溶血及細(xì)胞碎屑可能直接降低檢測標(biāo)本的敏感性。目前，仍需要大樣本多中心的CRC血液miRNA檢測的驗證，為臨床提供準(zhǔn)確、安全、高效的檢測方法。

1.3組織miRNA檢測CRC的現(xiàn)狀 目前，CRC組織miRNA檢測以基礎(chǔ)研究為主，通過不同miRNA在CRC及癌旁正常組織的異常表達(dá)確定異常表達(dá)miRNA的目的靶基因，根據(jù)靶基因不同作用靶點，闡述CRC的調(diào)控機(jī)制。雙熒光素酶報告基因檢測法是目前應(yīng)用最廣泛的miRNA靶基因結(jié)合位點鑒定方法，相關(guān)研究通過熒光素酶報告基因分析證實了不同miRNA靶基因的結(jié)合位點，miR-143靶向作用于結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1的3′非翻譯區(qū)；miR-152通過靶向磷脂酰肌醇-3-激酶在CRC中發(fā)揮抑癌作用；miR-150靶向作用于p53凋亡刺激蛋白家族抑制性成員的3′非翻譯區(qū)；miR-382可以靶向作用于核受體家族成員2的3′非翻譯區(qū)[14-17]。

不同miRNA靶基因的確定為揭示CRC的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。不同miRNA在CRC發(fā)病過程中的作用不同。針對miRNA在CRC發(fā)病的不同節(jié)點、不同環(huán)境、不同條件、不同特征，挖掘并制訂相關(guān)診療措施成為可能。目前，針對CRC組織的miRNA檢測較廣泛，涉及數(shù)百種miRNA，以基礎(chǔ)研究為主，基礎(chǔ)研究對發(fā)病機(jī)制的揭示是實驗室科研成果應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)及關(guān)鍵。

CRC患者糞便、血液、組織分子標(biāo)志物檢測的應(yīng)用率僅為20%～30%，其在健康篩查中的應(yīng)用率更低。價格昂貴、檢測技術(shù)不成熟、檢測標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、檢測流程不規(guī)范、檢測周期較長均是影響糞便、血液、組織分子標(biāo)志物檢測臨床推廣應(yīng)用的主要原因。此外，臨床工作者對CRC的miRNA檢測認(rèn)知度差、執(zhí)行力不足等亦制約了CRC糞便、血液、組織中分子標(biāo)志物檢測的臨床應(yīng)用，進(jìn)一步加強(qiáng)CRC檢測技術(shù)臨床轉(zhuǎn)化的研究，使實驗研究盡可能地滿足臨床需要并臨床應(yīng)用于臨床實踐，將有利于提高CRC的檢測率和檢測質(zhì)量，大大提高CRC的早期診治效率。

2 miRNA在CRC手術(shù)過程中的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用現(xiàn)狀

目前手術(shù)治療仍是CRC首選的最重要、最有效的治療方式之一[18]。為提升手術(shù)質(zhì)量，學(xué)者們嘗試將miRNA檢測轉(zhuǎn)化應(yīng)用于CRC手術(shù)全過程，包括術(shù)前手術(shù)適應(yīng)證的選擇、術(shù)中觀察手術(shù)前后miRNA的變化、術(shù)后復(fù)發(fā)及化療敏感性的監(jiān)測。

2.1miRNA檢測在CRC術(shù)前的應(yīng)用 手術(shù)適應(yīng)證的選擇是確保手術(shù)治療成功的基礎(chǔ)，目前CRC的手術(shù)適應(yīng)證仍以美國腫瘤聯(lián)合會制訂的癌癥TNM分期為基本依據(jù)。TNM分期既是臨床判斷CRC病情嚴(yán)重程度的重要標(biāo)準(zhǔn)，也是制訂CRC診療策略的基本指南[19]。miRNA在CRC患者術(shù)前檢測的應(yīng)用，對CRC手術(shù)治療較局限，僅對臨床早、中期(即TNM分期Ⅰ、Ⅱ期)CRC患者有效，對TNM分期Ⅲ、Ⅳ期的CRC效果極差，甚至無效。為解決這一難題，2016年新修訂的第8版癌癥分期系統(tǒng)引入了新的分子標(biāo)志物[20]。

隨著對miRNA與TNM分期的關(guān)系的深入研究，Arabsorkhi等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-298的異常水平與CRC腫瘤分化、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Hong等[22]報道，miR-497-5p表達(dá)水平低與CRC患者TNM分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Wang等[23]揭示miR-511-5p表達(dá)降低與組織學(xué)分化、侵襲和TNM分期呈負(fù)相關(guān)。Hu等[24]在探討miR-1229通過靶向同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2促進(jìn)血管生成的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，exomiR-1229水平顯著升高，與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期和生存不良顯著相關(guān)。

miRNA引入TNM分期系統(tǒng)，作為TNM分期的一種補(bǔ)充，極大提升了TNM分期的準(zhǔn)確性、有效性及實用性[25]。根據(jù)CRC患者術(shù)前miRNA檢測水平，依據(jù)腫瘤侵襲程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍和有無遠(yuǎn)端臟器的轉(zhuǎn)移綜合評估TNM分期，使手術(shù)適應(yīng)證的選擇更加準(zhǔn)確、有效，有助于開展個體化治療，提高精準(zhǔn)化治療水平。分子檢測手段從實驗研究進(jìn)入臨床應(yīng)用，標(biāo)志著開啟了結(jié)直腸癌“分子診斷和治療”的新時代。

2.2miRNA在CRC術(shù)中檢測的應(yīng)用 miRNA在CRC發(fā)生發(fā)展過程中呈現(xiàn)動態(tài)變化[26]，Maierthaler等[27]比較了miR-122對非轉(zhuǎn)移性與轉(zhuǎn)移性CRC預(yù)后的影響，轉(zhuǎn)移性CRC無復(fù)發(fā)率和總生存期以及轉(zhuǎn)移發(fā)生率均高于非轉(zhuǎn)移者。新近研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者miR-221-3p及miR-133a-3p過表達(dá)時，患者生存期較短[28]。

miRNA在病程不同階段的特征性演變特征，引發(fā)了學(xué)者們對CRC患者手術(shù)前后miRNA變化的關(guān)注。Ogata-Kawata等[29]通過對比CRC患者與健康人群血清16種外泌體來源的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中7種miRNA(miR-21、let-7a、miR-23a、miR-1229、miR-150,miR-1246,miR-223)的含量在CRC患者血清中顯著升高，且均在經(jīng)過手術(shù)治療后，表達(dá)水平明顯下降。Wu等[30]證實，結(jié)直腸癌和高級別瘤變腺瘤患者術(shù)前糞便脫落細(xì)胞中miR-135b的表達(dá)較健康人群升高，術(shù)后表達(dá)量下降明顯，認(rèn)為miR-135b可作為檢測CRC和晚期腺瘤的生物學(xué)標(biāo)志物，并能檢測手術(shù)治療效果。Fang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，CRC患者術(shù)前血漿miR-24、miR-320a和miR-423-5p表達(dá)水平明顯降低，而術(shù)后臨床好轉(zhuǎn)CRC患者血漿miR-24、miR-320a和miR-423-5p表達(dá)水平明顯升高。因此，CRC患者手術(shù)前后miRNA的動態(tài)變化，可作為判斷手術(shù)效果的間接證據(jù)，可能對提升手術(shù)質(zhì)量有一定的積極意義。

2.3miRNA在CRC術(shù)后檢測的應(yīng)用 CRC患者術(shù)后面臨兩大問題，即患者術(shù)后復(fù)發(fā)的檢測和術(shù)后化療的選擇。通常術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是CRC患者死亡的最重要原因。據(jù)統(tǒng)計，CRC術(shù)后患者的轉(zhuǎn)移率高達(dá)50%[32]。對于手術(shù)治療CRC患者，有效監(jiān)測術(shù)后病情變化并及時發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移傾向可為早期進(jìn)行臨床干預(yù)提供依據(jù)[33]。目前，術(shù)后復(fù)發(fā)多依賴組織病理學(xué)檢查確診，由于病理標(biāo)本的獲取受到多種因素的影響，常規(guī)病理檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)具有一定的局限性。近年來，應(yīng)用miRNA檢測預(yù)測手術(shù)復(fù)發(fā)，引發(fā)了大家的關(guān)注。有報道稱，miR-21與miR-92聯(lián)合檢測預(yù)測術(shù)后CRC復(fù)發(fā)的靈敏度為80.6%，特異度為95.3%[34]。

手術(shù)后聯(lián)合化療作為中晚期CRC的主要治療方法，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于臨床。常用化療藥物的多藥耐受性是CRC治療面臨的主要障礙之一。面對CRC對化療藥物治療應(yīng)答差的難題，學(xué)者們針對miRNA在蛋白轉(zhuǎn)運、凋亡蛋白及細(xì)胞周期調(diào)控等重要環(huán)節(jié)做了大量研究。Li等[35]研究miRNA通過轉(zhuǎn)運蛋白對化療敏感性影響發(fā)現(xiàn)，miR-34a能抑制ABC轉(zhuǎn)運蛋白泵出細(xì)胞內(nèi)過量藥物，從而提高化療效果及化療敏感性。Liu等[36]認(rèn)為，miR-15可能通過調(diào)控凋亡蛋白影響化療患者對5-氟尿嘧啶或奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平，增加藥物的敏感性。Xu等[37]研究發(fā)現(xiàn)，miR-503-5p可通過促凋亡蛋白p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子調(diào)控CRC的耐藥性。研究表明，miR-139-5p有誘導(dǎo)CRC細(xì)胞在G0/G1或S期阻滯的作用，在miR-139-5p轉(zhuǎn)染細(xì)胞化療后，對化療制劑具有更高的敏感性[38-39]。Ye等[40]應(yīng)用化療藥物5-氟尿嘧啶常規(guī)化療方案發(fā)現(xiàn)，miR-141能增強(qiáng)化療后的腫瘤細(xì)胞藥物敏感性，其機(jī)制可能通過靶向細(xì)胞周期蛋白D2發(fā)揮作用。

miRNA對化療敏感性調(diào)控，還包括對壞死蛋白調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄過程調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等環(huán)節(jié)。目前，關(guān)于miRNA預(yù)測CRC患者預(yù)后和評估化療藥物反應(yīng)的研究較多，但存在一些問題，如miRNA特征不重疊，所得實驗結(jié)果可重復(fù)性差，且相關(guān)報道的研究結(jié)果存在矛盾。因此，CRC藥物治療應(yīng)答差的問題急需解決。

3 miRNA在CRC臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用中的難點及研究熱點

近年來，腫瘤診治相關(guān)基因工程取得了巨大進(jìn)展[41]，國內(nèi)研究者通過對miRNA癌癥協(xié)會數(shù)據(jù)庫提供的可檢索分析的PubMed數(shù)據(jù)庫建庫至2017年3月所有關(guān)于人CRC中miRNA的近400多篇文獻(xiàn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，涉及診斷的miRNA研究約占18/160，涉及治療的miRNA研究約占15/160，涉及預(yù)后的miRNA研究約占41/160，涉及增殖及轉(zhuǎn)移的miRNA研究約占60/160，其中有部分是重疊使用相互交叉的研究，以處于細(xì)胞水平且涉及臨床應(yīng)用的研究占多數(shù)，僅有少部分研究進(jìn)入動物實驗階段，能夠應(yīng)用于臨床的研究非常有限[42]?？梢?，真正實現(xiàn)miRNA與CRC之間的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化仍任重道遠(yuǎn)。

由于miRNA分布廣泛、作用靶點多樣、調(diào)控方式復(fù)雜，不同種類miRNA功能之間存在重疊性、相似性。目前，同一種miRNA對不同腫瘤的作用存在不一致性、不均一性或截然相反的作用，其內(nèi)在規(guī)律還未被充分認(rèn)識和掌握，是基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用研究發(fā)展的重要難點，成為轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究的研究熱點[43]。

3.1miRNA基因表達(dá)多態(tài)性及調(diào)控復(fù)雜性對CRC臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的影響 人類健康的需求是推動科技發(fā)展以及促進(jìn)miRNA研究向CRC臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的巨大動力。為攻克基因表達(dá)的多態(tài)性及調(diào)控的復(fù)雜性的影響，眾多科研人員付出了長期艱辛的勞動。

癌癥基因組圖譜[44]運用生物技術(shù)、信息技術(shù)等一系列分子研究技術(shù)和醫(yī)學(xué)前沿實驗研究技術(shù)，進(jìn)行生物標(biāo)志物的分析與鑒定、驗證與應(yīng)用，為miRNA研究的CRC臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用、診治及精準(zhǔn)醫(yī)療和個性化靶向治療提供了基礎(chǔ)條件。個性化靶向治療是miRNA基礎(chǔ)研究的突破口，也是最受臨床期待的一種治療方法[45]。為成功實現(xiàn)CRC臨床轉(zhuǎn)化，首先要重視基因表達(dá)多態(tài)性及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的研究。

miRNA作為CRC的輔助治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。臨床miRNA模擬物的開發(fā)[46]以及miRNA拮抗劑的研制[47]成為miRNA應(yīng)用臨床的主要方式。RNAi干擾技術(shù)是驗證miRNA通過調(diào)整相關(guān)基因起作用的可靠技術(shù)，隨著該技術(shù)的成熟，miRNA模擬物及其拮抗劑逐漸應(yīng)用，可能成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療潛在的治療靶點[48]。

miRNA模擬物可通過化學(xué)方法合成，在鑒定與確認(rèn)miRNA靶標(biāo)時發(fā)揮主要作用。miRNA模擬物制作過程簡單，不需要構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)入的細(xì)胞量可控、可調(diào)整，常用作臨床腫瘤治療劑。早在2015年，miRNA模擬物的臨床開發(fā)已出現(xiàn)。利用納米技術(shù)加工處理miR-150并制成藥物制劑，采用介入療法將其緩慢置入體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，以緩慢提升細(xì)胞內(nèi)miR-150水平，發(fā)揮類似miR-150的生物學(xué)效應(yīng)，從而更大限度地發(fā)揮miR-150在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的抑癌作用，開創(chuàng)了miRNA模擬物臨床應(yīng)用的先河[49]。

miRNA拮抗劑通過阻止miRNA與相應(yīng)靶基因的互補(bǔ)配對抑制miRNA作用，其優(yōu)勢是穩(wěn)定性高、抑制效果強(qiáng)于普通抑制劑、給藥方式靈活且方便。導(dǎo)入特定miRNA拮抗劑或與miRNA前體的發(fā)夾或莖環(huán)部分結(jié)合，使其不能被Dicer加工生成成熟的miRNA，亦可與miRNA上oncomiRNA結(jié)合序列結(jié)合，進(jìn)而抑制后者和特定靶miRNA結(jié)合，從而保護(hù)靶miRNA。miRNA拮抗劑可逆轉(zhuǎn)具有促癌作用的基因功能，發(fā)揮抑癌效應(yīng)。Chen等[50]報道，應(yīng)用miR-451拮抗劑可有效抑制CRC的遷移和增殖。

miRNA作為新型特異性分子靶標(biāo)，參與了腫瘤診斷、治療的過程，現(xiàn)已明確的與腫瘤相關(guān)的miRNA有千余種，但仍缺乏對其系統(tǒng)、全面、多方位的認(rèn)知與了解。進(jìn)一步加強(qiáng)對基因表達(dá)多態(tài)性以及對基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的深刻認(rèn)識是miRNA基礎(chǔ)研究向CRC臨床轉(zhuǎn)化的重點。

3.2miRNA目的基因安全性及質(zhì)粒載體穩(wěn)定性對CRC臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的制約 目前，目的基因載體構(gòu)建(vector construction)技術(shù)[51-52]在miRNA臨床轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用最廣泛。含外源DNA質(zhì)粒的構(gòu)建是載體構(gòu)建的核心技術(shù)。質(zhì)粒作為運載體，實質(zhì)上是一種運輸工具，負(fù)責(zé)將DNA分子運送到受體細(xì)胞，并使裝載外來DNA片段的受體細(xì)胞繼續(xù)履行復(fù)制功能。在人工質(zhì)粒構(gòu)建過程中，為了確保質(zhì)粒的安全性、穩(wěn)定性、便捷性，科研人員做了大量的嘗試與努力。

傳統(tǒng)載體構(gòu)建多用腺病毒和慢病毒，病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但由于病毒本身的生物學(xué)特性，存在致病性、復(fù)發(fā)性、不確定性、不可控性以及難以大量制備等缺點，限制了其臨床應(yīng)用。同時，由于缺乏相關(guān)載體動物模型，影響了其臨床應(yīng)用。

使用非病毒載體進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建已成為當(dāng)前miRNA臨床轉(zhuǎn)化研究的首選[53]。近年來非病毒載體的研制與開發(fā)為人工載體構(gòu)建開辟新的視野。使用非病毒載體有助于解決腺病毒和慢病毒載體的種種弊端。有研究者已成功采用脂質(zhì)納米粒子，并將miR-21包裝為成熟的miRNA，以此為載體運送至腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及全身各系統(tǒng)[54]。非病毒載體的研制(在品種、有效性、準(zhǔn)確性方面)真正應(yīng)用于臨床腫瘤治療，仍需要一個漫長的過程。

3.3miRNA檢測技術(shù)限制了CRC臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用 在基因治療中，實驗技術(shù)往往決定了研究的成敗。實驗技術(shù)的成熟和進(jìn)步，使基礎(chǔ)理論研究向臨床轉(zhuǎn)化成為可能，能夠促進(jìn)實驗室前期研究向臨床治療后期研究的銜接和過渡。目前，miRNA檢測技術(shù)尚不完善、不成熟，限制了其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

miRNA檢測的常用方法包括經(jīng)典印跡雜交(Northern blot)、微陣列芯片(Microarray)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)以及測序法，它們都存在檢測過程繁瑣、費時、敏感性低、操作難、重復(fù)性差、成本高、不穩(wěn)定等缺點。滾環(huán)擴(kuò)增是目前較成熟的miRNA擴(kuò)增技術(shù)，其優(yōu)勢在于可在短時間內(nèi)使miRNA分子數(shù)量倍增，使檢測信號放大，以更多地應(yīng)用于臨床監(jiān)測；熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增可在短時間內(nèi)實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA的定位以及定量分析，對研究細(xì)胞內(nèi)miRNA的功能及相關(guān)疾病發(fā)生的分子機(jī)制有重要意義；而基于特異性酶輔助檢測以及納米孔檢測等技術(shù)，可明顯增強(qiáng)熒光信號的優(yōu)點，提升檢測的敏感性[55-57]。Duan等[58]利用信號放大機(jī)制運用等溫擴(kuò)增體系處理核酸外切酶和切口酶，有效解決了目標(biāo)靶基因觸發(fā)及寡核苷酸單鏈合成工程中的靈敏度檢測問題，大大提高了miRNA檢測技術(shù)的敏感性。

近年來，對于提高miRNA檢測技術(shù)臨床應(yīng)用可重復(fù)性及可操作性的研究較多，如系統(tǒng)檢測實施同一患者糞便、循環(huán)、癌組織；在正常人、CRC癌前病變患者及不同階段CRC患者中建立系統(tǒng)完善的miRNA差異表達(dá)譜，將有助于建立一套完善的、符合國人體征、適合中國國情的CRC篩查體制和臨床診治機(jī)制。

4 小 結(jié)

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)由“循證醫(yī)學(xué)”“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”向“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”的重要轉(zhuǎn)變過程中，“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”起著承上啟下的作用?；贑RC臨床診治的miRNA研究是成功實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)；準(zhǔn)確選擇miRNA向CRC臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的路徑是成功實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵；克服miRNA在CRC臨床應(yīng)用中的難點是成功實現(xiàn)其臨床轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。目前miRNA臨床轉(zhuǎn)化研究亟待解決的主要問題包括關(guān)鍵技術(shù)、關(guān)鍵環(huán)節(jié)、突出問題(如DNA測序技術(shù)開發(fā)、外泌體介導(dǎo)的miRNA研制)，此外應(yīng)加快miRNA激活劑及抑制劑的研制，開發(fā)更多、更安全的非病毒載體，以盡快解決miRNA分子治療中輸送途徑的安全問題。未來miRNA在CRC臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用中將發(fā)揮重要的作用。