IRGM/Irgm1調(diào)節(jié)自噬和凋亡在炎癥性疾病中的研究進展

孫松，郝欣然，鄒小乙，萬鑫，張芳妮，孫博，于波，房紹紅

(1.心肌缺血教育部重點實驗室，哈爾濱 150086； 2.哈爾濱醫(yī)科大學神經(jīng)生物學教研室，哈爾濱 150086；3.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，哈爾濱 150086)

人類基因組中有3個免疫相關GTP酶(immunity related GTPase，IRG)基因，即IRGC、IRGQ和IRGM，但只有IRGM在固有免疫應答中起作用[1]。IRGM基因位于5q33.1染色體上，具有5個外顯子，其中第一個外顯子編碼181個氨基酸，另外4個外顯子自第一個外顯子向下游延伸超過50 kb[2]。GTP酶家族成員尤其是IRGM/Irgm1可介導對多種病原體的先天免疫[3-4]。IRGM亞科在宿主抗性中具有最重要作用[5]。研究已經(jīng)確定，人類IRGM基因是克羅恩病[6]和結(jié)核分枝桿菌感染[7]的易感等位基因。IRGM/Irgm1是分子量為47 000的γ干擾素誘導性GTP酶，廣泛表達于有核細胞(尤其是巨噬細胞和淋巴細胞)的高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[8]。目前，國際上對IRGM/Irgm1的研究多集中在炎性腸病、腫瘤等疾病[9-10]。在克羅恩病實驗小鼠模型中，Irgm1可通過抑制炎癥小體的激活調(diào)控細胞焦亡，保護小鼠免受熱休克和腸道炎癥的影響[11]。在黑色素瘤實驗小鼠模型中，Irgm1還可通過細胞凋亡和B細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma，Bcl)-2基因相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)相互作用因子1依賴性自噬的雙重調(diào)節(jié)，促進黑色素瘤的發(fā)生[12]。作為各種細胞應激的正常程序性死亡現(xiàn)象，細胞凋亡與自噬的調(diào)控機制及信號通路均存在復雜性、多樣性的特點，既相互獨立又密切相關[13]?，F(xiàn)就IRGM/Irgm1調(diào)節(jié)自噬和凋亡在炎癥性疾病中的研究進展予以綜述。

1 IRGM/Irgm1與自噬的關系

自噬是一種高度保守的生物機制，可分解細胞內(nèi)過量以及功能失調(diào)的成分(如錯誤折疊/聚集的蛋白質(zhì)、受損的細胞器和入侵的病原體)，在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的生理作用[14]。根據(jù)細胞內(nèi)物質(zhì)向溶酶體轉(zhuǎn)移的具體機制，自噬可分為3種類型，即巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，主要的自噬過程包括：①形成選擇性識別和隔離底物的雙膜自噬體；②雙膜自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體；③自噬產(chǎn)物在自噬溶酶體中的降解[15-16]。基本水平的自噬是細胞生存所必需的，可選擇性消除不需要或受損的蛋白質(zhì)和細胞器[15]。然而，過多的自噬活動會非選擇性地降解大部分細胞器(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體)，從而對細胞產(chǎn)生不利影響，功能失調(diào)自噬涉及各種生理或病理條件[16]。

近年來，已有30多個自噬相關基因(autophagy associated gene，ATG)和蛋白被發(fā)現(xiàn)[17]，它們均直接參與了自噬過程。一般情況下，自噬過程可分為誘導、起始、伸長、成熟和降解等步驟[15]。不同的ATG參與自噬的不同階段，其中，一些高度保守的基因(如ATG5、微管相關蛋白輕鏈3、自噬受體p62和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1)在自噬中起關鍵作用[18-19]。除ATG外，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和Beclin-1復合物等信號轉(zhuǎn)導通路也參與了自噬的調(diào)節(jié)。目前，兩種主要的調(diào)節(jié)自噬的信號通路已被闡明：①Ⅰ類磷脂酰肌醇-3-激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，該通路可抑制自噬[20-21]；②Ⅲ類磷脂酰肌醇-3-激酶/Beclin-1通路，該通路可促進自噬[22]。

越來越多的證據(jù)表明，自噬發(fā)生的級聯(lián)反應可由宿主衍生的細胞因子(如γ干擾素)或模式識別受體(包括Toll樣受體和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體2)誘發(fā)[23-24]。IRG，特別是Irgm1，被認為在γ干擾素誘導的自噬中發(fā)揮關鍵作用[25]。有研究報道，在永久性大腦中動脈閉塞小鼠模型中，Irgm1能夠促進神經(jīng)元細胞自噬、抑制凋亡，從而減少梗死面積，為缺血性腦卒中提供了新的治療策略[26]。人類IRGM蛋白被RNA病毒廣泛靶向，其中一些病毒可以利用人類細胞的自噬提高其復制能力[27-28]。近年研究發(fā)現(xiàn)，利用小干擾RNA抑制IRGM的表達可直接或間接導致細胞自噬的減少[29]。同時，有研究報道，抑制自噬可以恢復IRGM介導核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3與人細胞凋亡相關斑點樣蛋白降解，但不能挽救核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3-人細胞凋亡相關斑點樣蛋白的齊聚缺陷[30]。由此可見，IRGM/Irgm1與細胞自噬的關系是雙向的。

2 IRGM/Irgm1與凋亡的關系

程序性細胞死亡(又稱凋亡)在發(fā)育和疾病的細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用。細胞凋亡的復雜機制涉及不同的調(diào)控途徑，主要包括內(nèi)源性和外源性兩種途徑，這兩種凋亡途徑最終激活效應胱天蛋白酶(caspase)，其中最重要的是caspase-3和caspase-7[31]。外源性途徑主要依賴腫瘤壞死因子受體家族的死亡受體與其配體的結(jié)合，在激活caspase-8的各種蛋白質(zhì)相互作用的驅(qū)動下，觸發(fā)細胞內(nèi)級聯(lián)反應，最終激活caspase-3和caspase-7，而caspase-3和caspase-7是細胞凋亡的最后“執(zhí)行者”[32]。內(nèi)源性途徑是由線粒體/細胞色素C介導的通路，關鍵步驟是線粒體外膜通透化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)增加，釋放細胞色素C和其他蛋白質(zhì)到細胞質(zhì)[33]。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1結(jié)合導致凋亡蛋白酶激活因子-1的構(gòu)象發(fā)生變化并齊聚，形成一種稱為凋亡體的七聚體結(jié)構(gòu)[32]。凋亡體可促進caspase-9向活性caspase-9的聚集和裂解，而caspase-9反過來又激活caspase-3和caspase-7，而caspas-3和caspase-7是執(zhí)行不可逆凋亡的最后步驟[34]。MOMP是細胞啟動凋亡的關鍵步驟?？沟蛲鯞cl家族蛋白共包括4個特征性BH(Bcl-2 homology)結(jié)構(gòu)域，即Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w和Mcl-1；Bcl-2通過調(diào)控BH3結(jié)構(gòu)域和效應蛋白抑制MOMP[35]。促凋亡蛋白分為兩個亞家族，其中一個亞家族僅包含BH3域，僅含BH3的蛋白質(zhì)通過檢測細胞死亡的信號可激活內(nèi)源性凋亡途徑；另一個亞家族由Bax、Bcl-2拮抗/殺傷蛋白(Bcl-2 antagonist/kill protein，Bak)和一種研究較少的蛋白質(zhì)Bcl-2相關卵巢殺傷蛋白(Bcl-2-related ovarian killer，BOK)組成，它們是細胞凋亡的效應器，由BH1-3結(jié)構(gòu)域決定[36]。只有含BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能與Bax或Bak結(jié)合，這種結(jié)合可促進Bax和Bak的同源齊聚，從而形成MOMP[37]，形成MOMP的過程就是被家族中抗凋亡成員抵消的過程。Bax、Bak和BOK通過抑制BH3蛋白與Bax/Bak的相互結(jié)合發(fā)揮Bax、Bak和BOK的抗凋亡作用[38]。細胞內(nèi)促凋亡因子和抗凋亡因子相互作用的平衡決定了細胞與凋亡閾值的距離，大多數(shù)癌癥的治療最終均通過誘導MOMP后腫瘤細胞的凋亡而起作用，一種有效的治療藥物或調(diào)控靶點可精準殺死癌細胞而不殺死正常細胞，這一概念依賴于不同細胞類型具有不同凋亡閾值的特征[39]。

IRGM(+313)rs10065172位點的純合TT基因型與嚴重膿毒癥中IRGM的表達降低及較高的病死率相關[40-41]。有文獻報道，Irgm1基因缺陷也可通過促進活化CD4+T細胞凋亡，抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生[42]。小鼠實驗性腦卒中研究發(fā)現(xiàn)，Irgm1在早期可有效激活自噬，保護缺血區(qū)神經(jīng)元免于死亡，促進半影區(qū)細胞凋亡[43]。研究表明，Irgm1的增加對敗血癥相關性腦病小鼠具有保護作用，而且還可激活p38促分裂原活化的蛋白激酶信號通路，誘導海馬神經(jīng)元凋亡和自噬[44]，為臨床預防和治療敗血癥相關性腦病患者提供了新的可能，表明Irgm1是一個有效的治療靶點。綜上可知，IRGM/Irgm1在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中通過調(diào)控細胞凋亡發(fā)揮作用，但具體機制目前尚不明確。

3 IRGM/Irgm1調(diào)節(jié)自噬與凋亡在炎癥性疾病中的作用

3.1IRGM/Irgm1在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病中的作用 腦卒中是嚴重威脅人類生命的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中。缺血性腦卒中占腦卒中患病總數(shù)的87%，通常由腦血流的短暫或永久性減少引起[45]。在缺血期間，急性營養(yǎng)和氧氣剝奪可能導致神經(jīng)元死亡，而壞死和凋亡是缺血后神經(jīng)元死亡的兩種主要方式[46]。自噬是影響許多細胞類型存活的重要細胞平衡機制，在自噬過程中，胞質(zhì)器官首先被隔離在雙膜囊泡中，然后被輸送至溶酶體進行降解，在短期內(nèi)該過程可提供能量以保持細胞的“功能正?！盵47]。研究顯示，自噬在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有保護神經(jīng)元存活的作用[48]。有研究表明，Irgm1在調(diào)節(jié)小鼠缺血性腦卒中模型神經(jīng)元自噬和細胞凋亡中起重要作用，對于決定神經(jīng)元的命運和缺血性腦卒中的總體預后至關重要，這可能是由于在缺血早期γ干擾素誘導Irgm1在缺血后的神經(jīng)元中迅速表達增加，引起神經(jīng)元自噬的激活，保護神經(jīng)元免受缺血壞死[26]。此外，嚴重膿毒癥時全身炎癥反應可導致膿毒癥誘導腦損傷，同時通過免疫調(diào)節(jié)、活化單核巨噬細胞發(fā)揮抗炎作用的γ干擾素表達上調(diào)，而γ干擾素可促進Irgm1在神經(jīng)元中的表達，誘導細胞自噬，從而包裹、降解清除神經(jīng)元內(nèi)的某些毒素、變性的胞質(zhì)成分，避免神經(jīng)元遭受進一步損傷[48]。另有研究在自身免疫性腦脊髓炎中也證實了Irgm1對M1亞型巨噬細胞具有調(diào)控作用[49]。由此可見，IRGM/Irgm1在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中參與了巨噬細胞炎癥的調(diào)控。

3.2IRGM/Irgm1在消化系統(tǒng)炎癥性疾病中的作用 克羅恩病是由一種腸道慢性免疫介導的炎癥性疾病。全基因組相關研究已經(jīng)確定了編碼先天免疫系統(tǒng)組成的多個克羅恩病風險等位基因，包括細胞因子(白細胞介素-23)、細菌識別受體(核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體2)和新近發(fā)現(xiàn)的ATG(ATG16L1和IRGM)[50]。有研究使用Irgm1基因敲除小鼠檢驗Irgm1蛋白在抑制實驗性結(jié)腸炎中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Irgm1是小腸和結(jié)腸炎癥反應的關鍵調(diào)節(jié)劑[51]。在小鼠腸梗阻疾病模型中發(fā)現(xiàn)，當敲除Irgm1基因后，Paneth細胞的形態(tài)和功能發(fā)生了實質(zhì)性改變，最顯著的是其分泌顆粒的外觀發(fā)生了顯著改變[52]。Paneth細胞是抵抗腸道病原體的腸道上皮細胞，通過形成和釋放富含抗菌肽的分泌顆粒來調(diào)節(jié)腸道微生物群；當Paneth細胞釋放的分泌顆粒暴露于右旋糖酐硫酸鈉后，Irgm1基因敲除小鼠的結(jié)腸和回腸急性炎癥增加，臨床反應惡化；即使未暴露于右旋糖酐硫酸鈉，Irgm1基因敲除小鼠的Paneth細胞位置和顆粒形態(tài)的顯著改變也存在；Irgm1基因敲除與腸道細胞(包括Paneth細胞)的線粒體吞噬及自噬受損有關，可通過頻繁的腎小管和線粒體腫脹以及微管相關蛋白輕鏈3陽性自噬結(jié)構(gòu)的增加來證明[53]。而微管相關蛋白輕鏈3陽性結(jié)構(gòu)通常包含Paneth細胞顆粒，Irgm1基因敲除Paneth細胞分泌顆粒顯著減少，微管相關蛋白輕鏈3陽性自噬室分泌顆粒增多[51]，提示Irgm1可能是自噬過程中的一個重要調(diào)節(jié)因子。這些結(jié)果表明，Irgm1可能通過調(diào)節(jié)腸道自噬過程調(diào)節(jié)小鼠腸道的急性炎癥反應，這可能對Paneth細胞的正常功能至關重要。Irgm1缺乏對腸道炎癥易感性和上皮功能的影響嚴重依賴于環(huán)境因素。

3.3IRGM/Irgm1在呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病中的作用 結(jié)核病是一個公共衛(wèi)生問題，尤其在發(fā)展中國家。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報告，每年約有200萬人死于結(jié)核病；在世界上1/3的結(jié)核病感染者中，只有10%會發(fā)展為臨床疾病，其中宿主遺傳因素在結(jié)核病易感性中起重要作用[54]。結(jié)核分枝桿菌是一種細胞內(nèi)病原體，盡管可引起強烈的適應性免疫應答，但是仍可以在宿主巨噬細胞內(nèi)持續(xù)存在。結(jié)核分枝桿菌可以駐留在巨噬細胞的吞噬體內(nèi)，并可阻止吞噬體的成熟[55]。自噬是細胞內(nèi)成分在細胞溶酶體中降解的過程，對細胞內(nèi)病原體(如分枝桿菌)起關鍵作用[56]。CD4+和CD8+T細胞產(chǎn)生的巨噬細胞活化因子γ干擾素是結(jié)核分枝桿菌免疫反應的重要組成部分，在小鼠被病原體感染的細胞中γ干擾素可刺激免疫相關的p47 GTPases(Irgm1)的產(chǎn)生[57]。Irgm1被募集到分枝桿菌吞噬體[58]，促進成熟和酸化[59]。Irgm1缺陷小鼠對結(jié)核分枝桿菌高度易感，是因為Irgm1缺陷小鼠無法控制肺部細菌的復制[60]。已有研究顯示，IRGM可誘導巨噬細胞自噬，以控制結(jié)核分枝桿菌[61]。Irgm1在小鼠中具有抵抗一系列細胞內(nèi)病原體(包括李斯特菌、弓形蟲和結(jié)核分枝桿菌)的作用[62]。IRGM基因啟動子區(qū)的變化已經(jīng)顯示出Irgm1與結(jié)核菌素的風險增加相關[61-62]。

目前，關于IRGM多態(tài)性與結(jié)核病相關性的信息較少。Singh等[63]研究發(fā)現(xiàn)，鼠Irgm1可誘導自噬并產(chǎn)生大的溶酶體細胞器，以消除胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌；同時還發(fā)現(xiàn)，人類IRGM在自噬和減少細胞內(nèi)負荷方面也發(fā)揮了作用。Intemann等[64]首次證實了IRGM基因型與結(jié)核之間的關系，發(fā)現(xiàn)IRGM基因型-261 TT提供了針對結(jié)核分枝桿菌的相對保護作用，但對非洲結(jié)核分枝桿菌或牛結(jié)核分枝桿菌則未提供保護作用；與-261 C IRGM變體相比，-261 T IRGM變體破壞了多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，并顯著增加了-261 T IRGM變體的表達，表明TT基因型可能增強IRGM蛋白的表達，由此認為，IRGM和自噬在預防結(jié)核分枝桿菌方面起一定作用。Che等[65]對1.7 GM IRGM啟動子區(qū)域進行了測序，發(fā)現(xiàn)了29個基因多態(tài)性，包括11個新位點，其中IRGM的-1208A等位基因和-1208AA基因型與結(jié)核病的易感性降低相關。與此相反，另一項研究檢查了伊朗人群樣本中IRGM-1208A/G、-1116C/T和-947C/T多態(tài)性對肺結(jié)核風險的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了人群中-1161C/T和-947C/T多態(tài)性對肺結(jié)核的保護作用，而且對照組與肺結(jié)核組在IRGM-1208A/G多態(tài)性方面差異無統(tǒng)計學意義[1]。

3.4IRGM/Irgm1在循環(huán)系統(tǒng)疾病中的作用 動脈粥樣硬化是人類循環(huán)系統(tǒng)疾病中最常見的慢性炎性血管疾病[66]。動脈粥樣硬化的確切病因目前尚不清楚。研究表明，高脂血癥是心血管疾病最重要的危險因素之一，與動脈粥樣硬化密切相關[67]。脂蛋白，特別是低密度脂蛋白在動脈內(nèi)膜中的異常蓄積可通過常駐巨噬細胞中的氧自由基等進行調(diào)節(jié)，從而導致單核細胞衍生巨噬細胞的進一步募集[68]。單核細胞衍生巨噬細胞與平滑肌細胞共同吞噬了修飾的低密度脂蛋白，進而轉(zhuǎn)化為泡沫細胞,這些泡沫細胞可以釋放各種促炎細胞因子，并引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，導致動脈粥樣硬化斑塊的形成[69]。巨噬細胞通過清道夫受體攝取氧化低密度脂蛋白是泡沫細胞形成和動脈粥樣硬化的關鍵步驟，但具體機制目前尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，Irgm1可調(diào)節(jié)巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白，在動脈粥樣硬化期間，氧化低密度脂蛋白可上調(diào)巨噬細胞中的Irgm1，進而調(diào)節(jié)受體-配體復合物CD36的內(nèi)吞作用，并促進氧化低密度脂蛋白的攝取，這種正反饋過程涉及Irgm1對F-肌動蛋白聚合的調(diào)節(jié)[70]。還有研究發(fā)現(xiàn)，IRGM/Irgm1在人和小鼠損傷的巨噬細胞中均高表達，與動脈粥樣硬化發(fā)展緩慢的野生型小鼠(Irgm1+/+)相比，Irgm1單敲鼠(Irgm1+/-)損傷的M1巨噬細胞浸潤顯著減少；Irgm1單倍體缺陷可影響干擾素調(diào)節(jié)因子5和干擾素調(diào)節(jié)因子8的表達，但對M2相關轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子4的表達影響較小[48]。鑒于巨噬細胞的不同表型在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，巨噬細胞極化干預是動脈粥樣硬化潛在的治療策略。

4 小 結(jié)

IRGM/Irgm1與多種生物功能相關，IRGM/Irgm1通過調(diào)節(jié)自噬和凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病等炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起重要作用。目前國際上的心血管研究對于不穩(wěn)定斑塊的早期診斷、形成機制以及調(diào)控靶點仍不明確，值得未來進一步深入探討。因此，明確IRGM/Irgm1通過自噬和凋亡調(diào)控動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的具體機制，可以為臨床不穩(wěn)定斑塊的早期干預和有效治療提供理論依據(jù)，有效地減少或預防急性心血管事件的發(fā)生，并為臨床尋找新的藥物靶點提供參考。