長鏈非編碼RNA在結(jié)核病發(fā)病過程中的作用

林劍文，王輝，師志云，施建黨，楊宗強，牛寧奎

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院脊柱骨科，銀川 750004)

結(jié)核病主要由胞內(nèi)致病菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起，可累及全身各器官組織，隨著病情進展臨床表現(xiàn)為消瘦、乏力、盜汗、癱瘓、大小便失禁等癥狀[1]。結(jié)核病是威脅人類健康的主要疾病之一，更是傳染病導(dǎo)致死亡的首要原因[2]。國內(nèi)外對結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)不同人群感染MTB后可誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，宿主感染MTB后的轉(zhuǎn)歸受宿主免疫功能狀態(tài)影響，當(dāng)宿主免疫功能狀態(tài)良好時，MTB能以休眠狀態(tài)在宿主體內(nèi)長期生存，當(dāng)宿主免疫力降低時，MTB將轉(zhuǎn)入增殖期[3]，在宿主各器官組織形成病灶，導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)生。結(jié)核病是受多種基因調(diào)控、由多條信號通路參與并相互作用形成的炎癥性疾病，其發(fā)病機制十分復(fù)雜[4-5]。許多與結(jié)核病發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)及信號通路的功能目前仍未明確，部分蛋白質(zhì)及信號通路在結(jié)核病發(fā)病的不同時間、不同部位可能表現(xiàn)出相反的功能。而炎癥反應(yīng)的發(fā)生與基因轉(zhuǎn)錄、翻譯水平以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的動態(tài)變化密切相關(guān)，其中長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA，lncRNA)能夠在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)，廣泛參與包括細(xì)胞分化及個體發(fā)育在內(nèi)的重要生命過程[6]，且異常表達(dá)的lncRNA常提示疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前，已在腫瘤、炎癥等多個領(lǐng)域展開了針對lncRNA的研究，并取得了一定進展[7-10]?，F(xiàn)就lncRNA在結(jié)核病發(fā)病過程中的作用予以綜述。

1 lncRNA概況

1.1lncRNA的性質(zhì) 在人類基因組共30億個堿基對中，約有75%可轉(zhuǎn)錄為RNA，其中近74%的RNA為非編碼RNA[11]。非編碼RNA不僅包括核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA、核小RNA、小核仁RNA、微RNA(microRNA，miRNA)等多種已知功能的RNA，還包括未知功能的RNA，如lncRNA、環(huán)狀RNA等，其中，lncRNA是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，在真核細(xì)胞內(nèi)普遍轉(zhuǎn)錄，位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，但不具有編碼蛋白的功能[12]。根據(jù)位置不同lncRNA又可分為反義長鏈非編碼RNA、內(nèi)含子非編碼RNA、基因區(qū)間lncRNA等不同類型[13]。與小核仁RNA、miRNA相比，lncRNA的序列保守性較低，但這并不影響其在功能上的保守性[14]。

1.2lncRNA的功能及作用途徑 lncRNA主要定位于細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄水平低于蛋白質(zhì)編碼基因，相對于信使RNA，lncRNA在通常情況下會顯示出更強的細(xì)胞或組織特異性，細(xì)胞可以lncRNA為地址，招募或隔離已存在的蛋白質(zhì)，調(diào)整特定區(qū)域的生理活動，參與表觀遺傳、可變剪接、入核轉(zhuǎn)運等過程，也可通過細(xì)胞微結(jié)構(gòu)原件、miRNA前體等發(fā)揮功能，lncRNA轉(zhuǎn)錄和功能失調(diào)可導(dǎo)致相關(guān)生理活動異常，參與腫瘤、炎癥的發(fā)生[15]。lncRNA發(fā)揮功能的機制多樣，既可作為miRNA的前體存在，也可通過RNA-DNA、RNA-RNA或RNA-蛋白質(zhì)等多種作用方式發(fā)揮調(diào)控功能，調(diào)節(jié)機體生理、病理活動[6,16-17]。

2 lncRNA在結(jié)核病發(fā)病中的作用

既往研究表明，MTB感染可誘發(fā)宿主體液免疫和細(xì)胞免疫，這一過程涉及多種不同免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子[18]。MTB在宿主體內(nèi)多個相互影響的信號通路調(diào)控下，引發(fā)一系列生理及病理性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)生[5]。

2.1通過表觀遺傳的改變調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)的表達(dá) 表觀遺傳指在基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)水平發(fā)生變化，包括DNA甲基化、基因沉默以及RNA編輯等。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的表達(dá)水平可能會影響鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[19-20]。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在活動性結(jié)核病患者的CD8+T細(xì)胞中，lncRNA-CD244的表達(dá)升高，lncRNA-CD244通過介導(dǎo)infg/tnfa位點H3K27的三甲基化向抑制染色質(zhì)狀態(tài)發(fā)展，抑制CD8+T細(xì)胞中γ干擾素、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)，抑制宿主對MTB的清除，導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)?。粸檫M一步證明上述機制，研究者敲除了小鼠的lncRNA-CD244基因，發(fā)現(xiàn)該小鼠在感染MTB后γ干擾素、TNF-α的表達(dá)均較對照組增加，同時對MTB的清除能力增強，感染程度降低，lncRNA-CD244可通過調(diào)節(jié)γ干擾素、TNF-α的表達(dá)參與結(jié)核病的發(fā)病過程，證明了lncRNA的表達(dá)水平可對鄰近的蛋白編碼基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。此外，對結(jié)核病患者及健康人群進行l(wèi)ncRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，多數(shù)lncRNA在表達(dá)水平出現(xiàn)差異的同時也常伴有鄰近信使RNA表達(dá)水平的改變，通過后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試驗發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者與健康人群lncRNA及信使RNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[22]。目前，部分蛋白質(zhì)在結(jié)核病發(fā)病過程中的作用研究已取得了一定進展。LINC00229作為增強子樣lncRNA，可增加其鄰近信使RNA Rho GTP酶激活蛋白8(Rho GTPase activating protein 8，ARHGAP8)的表達(dá)，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞周期進程和細(xì)胞遷移功能[23]，通過促進MTB進入宿主細(xì)胞參與結(jié)核病的發(fā)病過程[24]?；騾^(qū)間lncRNA XLOC_009016可抑制信使RNA酸性海藻糖酶樣蛋白1(acid trehalase-like protein 1，ATHL1)，降低Ⅳ型膠原纖維的降解，在MTB感染后，基因區(qū)間lncRNA XLOC_009016表達(dá)降低導(dǎo)致的信使RNA ATHL1表達(dá)水平升高可能與結(jié)核病導(dǎo)致的機體組織破壞有關(guān)[25]。活動性結(jié)核病患者lncRNA XLOC_012582高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3高表達(dá)[26]，進而導(dǎo)致結(jié)核病的進展[27]。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3既可促進人T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)生白細(xì)胞介素-17的輔助性T細(xì)胞，降低CD4+T細(xì)胞的體外增殖，導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭[28]，也可抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)3的激活，STAT3在阻斷吞噬酶體成熟、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬和凋亡、降低巨噬細(xì)胞免疫保護作用的同時，還可增強T細(xì)胞免疫保護作用，并參與記憶細(xì)胞的分化[29]。

多數(shù)在結(jié)核病患者及健康人群中呈差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在結(jié)核病發(fā)病過程中的作用目前尚未明確。例如，增強子樣lncRNA Rp4-781K5.4可增加信使RNA 1號染色體開放閱讀框31(chromosome 1 open reading frame 31，C1orf31)的表達(dá)，C1orf31是一種線粒體復(fù)合體Ⅳ組裝因子，對環(huán)加氧酶2的生物發(fā)生至關(guān)重要，可刺激CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，調(diào)節(jié)機體的免疫耐受功能[30]，但C1orf31與結(jié)核病的發(fā)病過程是否有關(guān)仍需要進一步研究；而基因區(qū)間lncRNA XLOC_007896可抑制信使RNA序列相似家族69成員B的表達(dá)，序列相似家族69成員B可能作為鈣依賴的激酶發(fā)揮作用，并參與蛋白質(zhì)的磷酸化，進而參與機體生理活動[31]。盡管lncRNA無法編碼蛋白質(zhì)，但可通過表觀遺傳的改變調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)水平，影響相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而廣泛地參與調(diào)節(jié)機體包括細(xì)胞分化及個體發(fā)育在內(nèi)的重要生命過程。

綜上所述，lncRNA雖無法編碼蛋白質(zhì)，但在基因表達(dá)過程中通過對表觀遺傳的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。結(jié)核病患者體內(nèi)異常表達(dá)的lncRNA可通過表觀遺傳的改變調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子及蛋白質(zhì)的表達(dá)，進而影響各信號通路功能，導(dǎo)致機體免疫功能改變，借此參與MTB抵抗宿主免疫系統(tǒng)清除、休眠于巨噬細(xì)胞及轉(zhuǎn)入增殖期的生物學(xué)行為以及炎癥的發(fā)生、機體組織的破壞，在結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2.2通過信號通路參與調(diào)節(jié)機體免疫功能 結(jié)核病發(fā)病是受多基因調(diào)控、多條信號通路參與的復(fù)雜的炎癥反應(yīng)過程。參與結(jié)核病發(fā)病的信號通路主要包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路[32]、TNF-α通路[33]、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路[4,34-35]、Janus激酶(Janus kinase，JAK)-STAT信號通路[36]以及NF-κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB，RANK)/NF-κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)信號通路[37]等，這些通路均在結(jié)核病的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。

2.2.1TGF-β信號通路 既往研究表明，MTB可導(dǎo)致活性TGF-β產(chǎn)生，作為抗炎細(xì)胞因子，TGF-β可通過TGF-β/Smads經(jīng)典通路抑制γ干擾素和TNF-α的活性，阻斷γ干擾素與TNF-α可抑制MTB在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力，促進MTB在巨噬細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)存在和生長[38-39]；TGF-β還可抑制T淋巴細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，降低機體對MTB的抵抗力[40-41]。有研究發(fā)現(xiàn)，非致病性分枝桿菌(如污垢分枝桿菌)感染巨噬細(xì)胞后可導(dǎo)致lncRNA人母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)上調(diào)，lncRNA MEG3通過形成RNA-DNA三鏈結(jié)構(gòu)下調(diào)TGF-β表達(dá)，增強機體對MTB的清除能力[42]。此外，TGF-β還可通過TGF-β/Smads通路及蛋白激酶途徑誘導(dǎo)TGF-β2基因位點相反鏈轉(zhuǎn)錄TGF-β2-反義RNA(antisense RNA 1，AS1)，TGF-β2-AS1屬于lncRNA，可抑制TGF-β的表達(dá)，進而抑制TGF-β/Smads信號通路[43-44]。這說明TGF-β/Smads信號通路可能通過調(diào)控部分lncRNA對TGF-β/Smads信號通路的信號輸出進行負(fù)反饋調(diào)節(jié)[44]。

2.2.2TNF-α信號通路 TNF-α通路在機體清除MTB過程中發(fā)揮重要作用。在活動性結(jié)核病患者體內(nèi)，CD8+T細(xì)胞中高表達(dá)的lncRNA-CD244可抑制TNF-α的生成，抑制TNF-α信號通路對MTB的清除作用，導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展[21]。TNF-α也可抑制機體對MTB的清除，脊柱結(jié)核患者病灶中上調(diào)的lncRNA 小核仁RNA宿主基因15通過增加RANK和RANKL基因及蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)RANK/RANKL途徑，使白細(xì)胞介素-6和TNF-α分泌增加，增加破骨細(xì)胞的形成和增殖[37]，而MTB可減少破骨細(xì)胞凋亡，抑制壞死，降低破骨細(xì)胞對刺激反應(yīng)的敏感性，從而促進破骨細(xì)胞內(nèi)潛伏的MTB逃逸，對抗免疫細(xì)胞的殺菌作用[45-46]。此外，TNF-α還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，抑制巨噬細(xì)胞清除細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌的自噬作用，該過程受lncRNA-PC酯酶結(jié)構(gòu)域1B(PC-esterase domain containing 1B，PCED1B)-AS1調(diào)節(jié)，在MTB感染后，lncRNA-PCED1B-AS1下調(diào)，減少lncRNA-PCED1B-AS1與巨噬細(xì)胞miR-155的結(jié)合，抑制TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，促進巨噬細(xì)胞自噬，消除細(xì)胞內(nèi)的分枝桿菌[47]。

2.2.3其他信號通路 除TGF-β信號通路和TNF-α信號通路外，lncRNA還可通過其他信號通路參與結(jié)核病的發(fā)病過程。例如，lncRNA XLOC_012582高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3高表達(dá)，通過抑制STAT3的表達(dá)抑制JAK-STAT信號通路的功能，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫功能紊亂，促進結(jié)核病的進展[29]。lncRNA-MEG3參與調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路，lncRNA-MEG3的減少可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞通過自噬消除巨噬細(xì)胞中的分枝桿菌[48]。在MTB感染過程中，lncRNA-核富集轉(zhuǎn)錄本1的表達(dá)增加，lncRNA-核富集轉(zhuǎn)錄本1可通過c-Jun氨基端激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路影響巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)，上調(diào)TNF-α和白細(xì)胞介素-6的表達(dá)，增強巨噬細(xì)胞對胞內(nèi)MTB的清除[49]。lncRNA-ROCKI(regulator of cytokines and inflammation)是由TLR信號通路誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，可與脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1結(jié)合，減少ROCKI轉(zhuǎn)錄以及隨后的鈣離子信號和炎癥基因的表達(dá)，以負(fù)反饋方式抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生[50]。lncRNA-AC145676.2.1-6能與45個miRNA相互作用，在感染MTB后miR-29a顯著上調(diào)，并抑制涉及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用及TLR信號通路的主要靶基因的表達(dá)[51]。同時，巨噬細(xì)胞與Marcks效應(yīng)域肽的孵育不僅可以阻止Marcks的磷酸化及其與膜的解離，還可抑制脂多糖誘導(dǎo)的p38、c-Jun氨基端激酶及NF-κB的激活，進而抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[52]。

綜上所述，機體感染MTB后出現(xiàn)差異表達(dá)的lncRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子及蛋白質(zhì)的表達(dá)，參與多種不同信號通路的信號傳遞過程，引起巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、破骨細(xì)胞等功能改變，調(diào)節(jié)機體免疫細(xì)胞的功能，降低宿主對MTB的清除能力，導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展[53-54]。

2.3作為診斷標(biāo)志物 結(jié)核病患者與健康人群中部分lncRNA表達(dá)存在顯著差異，在這些lncRNA中有部分lncRNA相關(guān)聯(lián)的信使RNA目前尚未明確，因此無法判斷這部分lncRNA在結(jié)核病發(fā)病過程中的作用。例如，lncRNA-HNF1B-3：1[55]、lncRNA-tgs1-1[56]、MIR3945HG V1和MIR3945HG V2[22]、ENST00000-360485[22]、ENST00000354432和ENST00000427151[57]以及l(fā)ncRNA-AC079767.4[58]等相關(guān)聯(lián)的信使RNA目前尚未明確，但這些lncRNA在結(jié)核病患者與正常人群中的表達(dá)存在顯著差異，因此可作為結(jié)核病潛在的診斷標(biāo)志物，用于結(jié)核病的早期診斷及治療。此外，還可通過基因敲除或基因沉默，探索lncRNA相關(guān)聯(lián)的信使RNA或表觀遺傳途徑，作為結(jié)核病發(fā)病機制的進一步研究方向。

3 小 結(jié)

lncRNA雖然無法編碼蛋白質(zhì)，但可通過對表觀遺傳的調(diào)節(jié)參與調(diào)控細(xì)胞因子及蛋白質(zhì)的表達(dá)，調(diào)節(jié)機體免疫功能，并參與結(jié)核病的發(fā)病過程。目前，針對lncRNA在結(jié)核病發(fā)病過程中作用的研究已經(jīng)取得了部分成果，但仍未闡明MTB抵抗宿主免疫系統(tǒng)清除、休眠于巨噬細(xì)胞及轉(zhuǎn)入增殖期的生物學(xué)行為以及MTB介導(dǎo)的對組織破壞行為的分子生物學(xué)機制。lncRNA的表達(dá)異常與結(jié)核病的發(fā)病過程密切相關(guān)，且部分lncRNA在機體早期感染MTB后即可在血液中出現(xiàn)差異表達(dá)，因此lncRNA可作為結(jié)核病的早期診斷指標(biāo)。對差異表達(dá)lncRNA功能的研究是深入探索機體感染MTB后結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展機制的有效方法，未來仍需進一步深入研究lncRNA在結(jié)核病發(fā)病過程中的作用。