細胞焦亡在膿毒癥肝損傷中的分子機制和研究進展

郭笑瀟 陳明泉

膿毒癥(Sepsis)是機體抗感染反應失調而導致的危及生命的器官功能障礙[1]，臨床表現(xiàn)復雜，其發(fā)病率和病死率居高不下。肝臟作為人體最大的腺器官，血運豐富，參與維持代謝和免疫穩(wěn)態(tài)，但也是膿毒癥最常受累的器官之一[2]。肝損傷能夠影響機體對細菌或脂多糖(LPS)的清除能力，是多器官衰竭和死亡的獨立預測因素，需盡早發(fā)現(xiàn)及干預[3]。

細胞焦亡(Pyroptosis)是一種細胞自發(fā)的程序性死亡，協(xié)助固有免疫系統(tǒng)清除病原體，同時激活強烈的炎性反應[4]。已有研究表明，焦亡在調節(jié)膿毒癥的發(fā)展和預后中起重要作用[5]，焦亡的適度激活有助于及時清除感染細胞，但過強的反應會造成大量細胞死亡、器官損傷甚至衰竭。

目前，細胞焦亡在膿毒癥肝損傷中的作用機制尚不明晰。因此，本文總結了近年來細胞焦亡分子機制的研究進展，以及焦亡在膿毒癥肝損傷中起到的作用，旨在為膿毒癥肝損傷的臨床診治提供新思路。

一、細胞焦亡的概念與分子機制

與凋亡相似，焦亡也依賴程序性死亡關鍵蛋白半胱氨酸-天冬氨酸水解酶(Caspase，又稱胱天蛋白酶)，產(chǎn)生細胞核固縮和DNA斷裂。不同的是，焦亡依賴Caspase-1/4/5/11，下游事件由打孔蛋白消皮素(Gasdermin)家族蛋白執(zhí)行，特征表現(xiàn)為細胞腫脹、胞膜微孔形成、細胞破裂和胞內容物釋放，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)染色陽性，TUNEL染色結果較凋亡細胞淺[6]。焦亡的激活途徑主要分為依賴Caspase-1的經(jīng)典途徑和不依賴Caspase-1的非經(jīng)典途徑。非經(jīng)典途徑在人類中由Caspase4/5介導，在嚙齒動物中由Caspase-11介導。

(一) 經(jīng)典途徑 細胞焦亡經(jīng)典途徑的啟動需要胞內多聚蛋白復合物炎癥小體(Inflammasome)參與識別多種炎癥激活因子。當機體遭受病原體、毒素等刺激時，胞膜上的模式識別受體(PRR)識別PAMPs或DAMPs，啟動下游炎癥小體合成。炎癥小體復合物包含受體蛋白、Caspase前體和含有Caspase蛋白活化和募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)。目前已知參與形成炎癥小體的受體蛋白有：含pyrin結構域NOD樣受體家族1(NLR family pyrin domain containing 1，NLRP1)、NLRP3、含CARD結構域NOD樣受體家族4(NLRC4)、黑素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2，AIM2)和Pyrin蛋白等[7]。這些受體蛋白均通過死亡折疊域(Death fold domains)PYD或CARD募集接頭蛋白ASC放大信號后，與Caspase蛋白前體結合，組成炎癥小體[8]。

NLRP3是目前研究最廣泛及深入的炎癥小體，能夠接受病原體、毒素、細胞損傷釋放的DAMPs等多種刺激信號的激活。NLRP3活化需要雙信號介導——啟動信號與活化信號。啟動信號(Priming signal，signal 1)由胞外的PAMPs或細胞因子與細胞膜上的PRR結合發(fā)起，上調細胞核NLRP3、白介素(Interleukin，IL)-1β前體和Caspase-1蛋白轉錄水平?；罨盘?Activation signal，signal 2)由未活化的NLRP3單體識別PAMPs和DAMPs發(fā)起，激活NLRP3單體發(fā)生寡聚并通過PYD招募集結ASC，進而誘導ASC的CARD域募集Pro-caspase-1，組成完整的NLRP3炎癥小體[9]。在病原體感染時，炎癥小體激活的Caspase-1剪切IL-1β、IL-18前體并切割Gasdermin D(GSDMD)蛋白N端。成熟的IL-1β和IL-18釋放至胞外增強炎癥反應并趨化更多固有或適應性免疫細胞，活化的GSDMD轉位至細胞膜磷脂層，形成孔洞，造成胞外鈉離子、鈣離子內流，破壞了胞內外滲透壓，最終導致細胞吸水腫脹，胞膜破裂并釋放胞內容物[10]。因此，炎癥小體能引發(fā)強烈的炎癥反應并介導細胞焦亡，在膿毒癥中起重要作用。

(二) 非經(jīng)典途徑 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的重要組成成分，致病菌中的LPS是導致膿毒癥的重要原因。已有研究發(fā)現(xiàn)，LPS與TLR4結合后激活MyD88/TRIF/NF-κB和IFNR/JAK/STAT通路促進Caspase-4/5/11水解活化，通過非經(jīng)典途徑剪切GSDMD啟動焦亡[11]。同時，活化的GSDMD也可在胞內直接促進NLRP3小體中Caspase-1激活，協(xié)同啟動焦亡的經(jīng)典途徑[12]。然而，非經(jīng)典途徑的焦亡還存在其他可能的機制，LPS可不依賴TLR4受體激活Caspase-11，但具體的受體及通路仍在研究中[13]。

二、焦亡通路在肝損傷微環(huán)境中的作用

肝臟是抵抗病原體血流入侵的重要防線，已有研究表明，肝細胞、庫普弗細胞、星狀細胞等均存在焦亡反應通路，可通過識別PAMPs或DAMPs啟動細胞焦亡，或通過細胞間交聯(lián)參與肝損傷。

(一) 肝細胞 肝細胞中炎癥小體激活和焦亡對于肝損傷的作用不容小覷。一項近期的研究中，Li等[14]發(fā)現(xiàn)了在膿毒癥急性肝損傷患者中焦亡通路相關蛋白顯著上調，而敲除GSDMD的小鼠肝損傷減少且生存率得到明顯提高。

動物感染模型為研究肝細胞焦亡通路在膿毒癥肝損傷的作用提供了依據(jù)。在盲腸結扎穿孔術(CLP)誘導的小鼠膿毒癥模型中，肝細胞焦亡相關蛋白Caspase-1和NLRP3表達增加，且與肝損傷程度正相關，而體外提前給予NLRP3或Caspase-1抑制劑能有效減少LPS對肝細胞造成的損傷[15]。大腸桿菌血流感染模型中，敲除NLRP3的小鼠生存率較野生型高，組織炎癥細胞浸潤更少，而NLRP3促進播散性細菌感染的病死率不依賴IL-1β和IL-18。作者認為，NLRP3的過度激活可能通過焦亡途徑釋放內花生酸(Eicosanoid)，最終導致膿毒癥加重[16]。除經(jīng)典途徑外，感染后的肝細胞也可發(fā)揮細胞交聯(lián)作用，協(xié)助LPS通過非經(jīng)典途徑激活巨噬細胞和內皮細胞的Caspase-11。肝細胞釋放的高遷移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)可以在胞外與LPS結合，通過晚期糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation end-products，RAGE)內吞入巨噬細胞或內皮細胞中的溶酶體。HMGB1溶解溶酶體的磷脂雙分子層，協(xié)助LPS釋放至胞內，激活caspase-11和下游的焦亡[17]。

(二) 庫普弗細胞 庫普弗細胞(Kupffer cell)指位于肝臟中的特殊巨噬細胞，具備自我更新能力，通過吞噬清除內毒素和釋放炎癥因子維持肝臟中的免疫穩(wěn)態(tài)，是肝臟微環(huán)境中主要的免疫細胞，也是肝臟中IL-1β、IL-18和NLRs的重要來源[18]。體內外研究表明，LPS誘導的膿毒癥模型中庫普弗細胞NLRP3和IL-1β表達量顯著上調，提示庫普弗細胞具有較強的焦亡通路反應能力[19]。同時，Chen等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，大量LPS可以導致庫普弗細胞釋放組織蛋白酶B，促進Caspase-11介導的非經(jīng)典途徑炎癥小體激活與細胞焦亡，降低小鼠生存率。

(三) 肝星狀細胞 肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)是位于肝臟竇周間隙的內皮周細胞，肝損傷時活化為肌成纖維細胞并分泌細胞外基質參與損傷后修復，同時HSC的激活也是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[21]。已有研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者長期肝硬化的風險增加，且與不良預后相關[22]。小鼠模型中也觀察到，膿毒癥會增加慢性肝硬化風險[23]，HSC中的炎癥小體激活后能夠上調結締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)和基質金屬蛋白酶組織抑制劑1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1，TIMP1)表達，增加肝組織中膠原蛋白沉積和肝纖維化[24]。

三、針對焦亡肝損傷的靶向治療

目前臨床上針對膿毒癥肝損傷以支持性治療為主，尚無特效方法。膿毒癥中細胞焦亡的過度激活與不良預后相關，許多靶向肝臟內細胞焦亡的體內外實驗正在進行當中，顯示出了應用前景。

生物制劑因其較好的靶向性和安全性，近年來得到了廣泛使用，許多研究發(fā)現(xiàn)其在緩解膿毒癥肝細胞焦亡中也顯示出了一定效果。谷氨酰胺(Glutamine)是體內含量豐富的游離氨基酸，有抗炎和免疫調節(jié)功能。Pai等實驗表明[25]，給小鼠預防性補充含有谷氨酰胺的飲食能夠減少膿毒癥72 h后肝臟內的細胞焦亡，減輕器官功能障礙和損傷，提示谷氨酰胺預防性使用可能對膿毒癥高?；颊哂衅鞴俦Ｗo作用。雌激素在體內兼具抗炎和抗氧化的作用，而肝臟中焦亡信號顯示與雌激素存在相關性。雌激素可以降低膿毒癥小鼠血清AST、ALT水平，減輕肝臟中線粒體超氧化反應，降低NLRP3-Caspase-1-GSDMD通路表達，從而減輕肝臟的炎癥損傷[26]。類似地，促紅細胞生成素也可通過抑制NLRP3信號減輕LPS膿毒癥大鼠肝細胞線粒體受損和肝損傷[27]。

一些體內新發(fā)現(xiàn)的分子或蛋白質顯示出了調節(jié)細胞焦亡的作用。STAT蛋白是調節(jié)細胞增殖、分化和死亡的胞內信號分子和轉錄蛋白。Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，STAT5a蛋白能夠阻斷庫普弗細胞NF-κB通路，下調Nlrp3基因表達并減少細胞焦亡，為機體抵抗膿毒癥提供保護。熱休克蛋白A12A(HSPA12A)是熱休克蛋白70家族的成員，能夠在非酒精性脂肪性肝病中調節(jié)肝臟穩(wěn)態(tài)。Liu等[29]研究表明，膿毒癥時HSPA12A能夠進入肝細胞核，通過PGC-1α上調AOAH蛋白，抑制LPS激活Caspase-11介導的肝細胞焦亡，保護肝損傷。非編碼RNA為人類和小鼠基因組重要的轉錄產(chǎn)物，且參與調節(jié)多種生理和病理過程。

多種中草藥成分因其抗炎功效而在調節(jié)膿毒癥肝損傷中表現(xiàn)出良好的效果。野黃芩苷(Scutellarin)是從黃芩中分離出的黃酮類物質，能抑制大腸桿菌感染小鼠巨噬細胞中NLRP3激活與細胞焦亡，減少肝臟中炎癥細胞浸潤和IL-1β水平[30]。6-姜酚是生姜中具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經(jīng)保護功能的化學物質，能夠抑制NLRP3介導的IL-1β分泌，Hong等的研究發(fā)現(xiàn)，6-姜酚能在體內外激活Nrf2/HO-1通路抑制巨噬細胞炎癥小體激活，阻礙焦亡通路，減輕肝損傷[31]。

四、總結與展望

膿毒癥仍是臨床上棘手的疑難重癥，肝損傷是多器官衰竭和死亡的獨立預測因素，但有時臨床醫(yī)生會忽視其對于預后的重要性。細胞焦亡的過度激活會造成大量細胞死亡并促進肝損傷甚至衰竭，靶向焦亡的研究正逐漸增多，但仍存在許多未知。例如，目前人們對于焦亡在肝損傷中的研究以基礎研究為主，多集中于炎癥小體和Caspase，而對于下游效應分子打孔蛋白的探索較少，細胞焦亡在肝損傷中的信號通路也有待進一步探索；且膿毒癥肝臟中焦亡信號的臨床證據(jù)尚不充足，靶向焦亡的治療研究不夠深入，現(xiàn)有的體內外研究與臨床應用仍有較長距離。因此，未來應進一步深入研究膿毒癥肝損傷的發(fā)病機制，開發(fā)針對焦亡的治療方法，以期降低膿毒癥病死率。