外泌體在肝病診斷中的作用研究進(jìn)展

劉偉 江梅 邵勇

外泌體最初是從體外培養(yǎng)的羊網(wǎng)織紅細(xì)胞的上清液中發(fā)現(xiàn)的，直徑30～150 nm，密度為1.10～1.18 g/mL的囊泡樣小體。研究表明，含有多種蛋白質(zhì)、mRNA及miRNA各種脂類 ,可作為信息傳遞的載體 ,參與體內(nèi)多種生命活動(dòng)過(guò)程，成為細(xì)胞交流的一種新的方式[1]。外泌體因其獨(dú)特的有脂質(zhì)雙分層膜結(jié)構(gòu)[2]，能在長(zhǎng)期極低的溫度下維持穩(wěn)定狀態(tài)保護(hù)生物學(xué)特性，故用來(lái)研究多種疾病的病理生理、診斷、治療及預(yù)后。

肝臟作為人體最重要的器官之一，多種肝臟細(xì)胞均可以分泌外泌體，或做為外泌體的靶細(xì)胞，如肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞(HSC)、單核巨噬細(xì)胞、自然殺傷T 淋巴細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等，不同細(xì)胞分泌的外泌體有著不同的功能。外泌體參與肝癌、病毒性肝炎、肝纖維化、酒精性及非酒精性脂肪肝等疾病的發(fā)生發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的外泌體蛋白及miRNAs是多種疾病的潛在生物標(biāo)志物。本綜述總結(jié)了近年來(lái)外泌體在肝病診斷中的作用研究進(jìn)展。

一、肝細(xì)胞癌(HCC)

肝細(xì)胞癌是指由肝細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，是原發(fā)性肝癌最常見(jiàn)的病理類型。腫瘤來(lái)源外泌體是癌癥特定信號(hào)的重要載體，并影響腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Sohn等[3]報(bào)道分析了慢性乙型肝炎(CHB )、肝硬化(LC)和 HCC患者血清分離的外泌體差異，HCC患者的血清外泌體miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224水平明顯高于CHB或LC患者；HCC患者的血清外泌體miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195水平低于CHB患者。Wang等[4]研究比較30例HCC患者和30例慢性乙型肝炎病毒 (HBV ) 感染患者，HCC患者的血清外泌體含有更高水平的miR-21。 Liu等[5]比較了HCC患者與健康個(gè)體，miR-122在HCC患者中表達(dá)較低，miR-21在HCC患者中較高。目前研究發(fā)現(xiàn)，肝癌中miRNA-122表達(dá)降低，miRNA-21則升高，提示這兩者作為肝癌診斷的標(biāo)志物的可能性，miR-122可抑制肝腫瘤的生長(zhǎng)，這與Wu等[6]的發(fā)現(xiàn)一致，在體外，敲除miR-122后抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，上調(diào)HCC細(xì)胞活力，提示miR-122有可能作為監(jiān)測(cè)HCC治療效果的指標(biāo)。

Sugimach等[7]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)患者外泌體中miR-718顯著下降，提示miR-718可以作為判斷肝癌復(fù)發(fā)以及判斷肝癌治療的預(yù)后的候選標(biāo)志物；Liu等[8]發(fā)現(xiàn)血清外泌體中的miR-125b可作為肝癌預(yù)后指標(biāo)，血清外泌體miR-125b水平低的肝癌患者復(fù)發(fā)時(shí)間縮短，生存率低，他還發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA (miRNA-10b, miRNA-21, miRNA-122, miRNA-200a)可能用于HCC早期階段(肝硬化)的診斷和預(yù)測(cè)，miRNA-10b在HCC發(fā)展的早期階段，表達(dá)顯著增加。在ROC曲線中，miRNA-10b預(yù)測(cè)肝硬化具有非常高的靈敏度；miRNA-21比miRNA-10b的特異性低；miRNA-122特異性與肝癌細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡和血管生成相關(guān)的靶基因結(jié)合，起到抑癌和抑制肝癌發(fā)展的作用；miRNA-122a也可以用預(yù)測(cè)肝硬化；miRNA-200a在組織和血清中均隨著HCC的發(fā)展而降低，由此他們推測(cè)AFP與外泌體聯(lián)合判斷對(duì)HCC的預(yù)測(cè)能力強(qiáng)于單獨(dú)使用AFP。此外Ahmed等[9]發(fā)現(xiàn)：miR-1246和miR-210可能是區(qū)分原發(fā)與繼發(fā)性肝癌的指標(biāo)：他們統(tǒng)計(jì)了33例原發(fā)性肝癌、22例繼發(fā)性肝癌與30例正常組對(duì)照，原發(fā)組與繼發(fā)組患者血清miR-210和miR-1246水平存在差異表達(dá)，miR-210與miR-1246在繼發(fā)性肝癌中表達(dá)均顯著高于原發(fā)性肝癌，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)他們利用ROC曲線分析miR-210在肝細(xì)胞癌與轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤鑒別中的敏感性和特異性分別為73.7%和64.28%，而miR-1246則分別為72.2%和67.8%。

二、藥物誘導(dǎo)性肝損傷(DILI)

藥物引起的肝損傷，一般是有兩個(gè)途徑，第一是藥物本身的毒性引起的肝臟損害，第二，是藥物誘導(dǎo)的自身免疫性的肝損害。目前臨床診斷DILI主要依靠排除法，這種方法并不能很及時(shí)的診斷DILI，導(dǎo)致其誤診率及漏診率增加。Conde-Vancells等[10]提取了DILI大鼠與正常大鼠尿液中的外泌體發(fā)現(xiàn)DILI大鼠表達(dá)CD26、CD81減少，血清中這種差異卻不明顯，這可能說(shuō)明某些肝病的生物標(biāo)記物只能根據(jù)特定體液中分離的外泌體進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。DILI時(shí)，在血漿中可檢測(cè)到肝臟來(lái)源的微小RNA (miRNAs)和全長(zhǎng)mRNAs，其中miR-122具有肝臟特異性，敏感性高，可用于對(duì)乙酰氨基酚所致DILI的早期診斷，且其半壽期短，可更好地反映肝損傷的消退。Cho等[11]研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)血漿外泌體中的miR-122 與miR-192在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷中升高, 并且用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸處理可恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，同樣提示了miR-122與miR-192作為診斷DILI指標(biāo)的可能性。Zheng等[12]發(fā)現(xiàn)在中藥如川楝子引起的肝損傷中血清外泌體microRNA-370-3p下降明顯，這些均提示了外泌體在DILI的潛在診斷意義。

三、酒精性肝炎(AH)與非酒精性脂肪肝病(NAFLD)

酒精性肝炎是長(zhǎng)期過(guò)量飲酒所致的一種肝臟疾病；非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的獲得性代謝應(yīng)激性肝損傷，包括單純性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝硬化。miR-122在肝細(xì)胞癌中的水平降低，而在酒精性肝病中升高，血清中miR-122 水平的升高可能與肝損害有關(guān)。血漿外泌體中miRNA-30a、miRNA-192 和CD40配體均有助于診斷酒精性肝炎。Verma等[13]發(fā)現(xiàn)乙醇通過(guò)激活半胱天冬酶3依賴的通路，刺激肝細(xì)胞分泌含有CD40配體的外泌體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化，加重肝臟的炎癥；另外一個(gè)研究[14]提示了血漿外泌體中miRNA-30a、miRNA-192有助于診斷酒精性肝炎，該研究發(fā)現(xiàn)miRNA -192和miRNA-30a 在長(zhǎng)期飼飲乙醇的小鼠和慢性酒精性肝炎患者的血清中提取的EVs(細(xì)胞外囊泡)中表達(dá)均升高，在這些miRNAs中，miRNA192對(duì)酒精性肝炎的診斷準(zhǔn)確性相對(duì)較高。Babuta等[15]發(fā)現(xiàn)ALD中，酒精誘導(dǎo)miR-155的增加，影響ALD自噬途徑中的多個(gè)基因，降低溶酶體水平，抑制溶酶體相關(guān)膜蛋白1 (LAMP1)和溶酶體相關(guān)膜蛋白2 (LAMP2)，致使溶酶體功能失調(diào)，從而導(dǎo)致ALD，提示miR-155也可能作為酒精性肝炎的診斷標(biāo)志物。

LEE等[16]發(fā)現(xiàn)晚期NAFLD患者較早期NAFLD患者血清中循環(huán)外泌體miR-192的水平升高，表明miR-192可能是NASH(非酒精性脂肪性肝炎)進(jìn)展相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。Ibrahim等[17]發(fā)現(xiàn)在非酒精性脂肪性肝炎患者中，肝細(xì)胞能釋放含有趨化因子CXCL10的外泌體, 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活化，加重肝臟的炎癥；Kakazu等[18]研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)可能通過(guò)刺激肝細(xì)胞分泌含有神經(jīng)酰胺的外泌體，通過(guò)S1P依賴的途徑增加巨噬細(xì)胞的數(shù)量, 加重肝臟的炎癥；提示血漿外泌體中CXCL10、神經(jīng)酰胺和S1P均有可能成為診斷非酒精性脂肪性肝炎的指標(biāo)。

四、病毒型肝炎

病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的以肝臟病變?yōu)橹鞯囊环N傳染病，常見(jiàn)的病毒性肝炎包括乙肝與丙肝。外泌體細(xì)胞間的通信作用可參與病毒感染期間的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。有學(xué)者從丙型肝炎病毒感染患者血清中分離出外泌體，含有丙型肝炎病毒核糖核酸、高濃度蛋白質(zhì)和熱休克蛋白90[19]，這些外泌體易于提取，具有一定的特異性，但目前尚未用于臨床診斷病毒性肝炎。研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的病毒，如人類免疫缺陷病毒，HBV和HCV通過(guò)外泌體將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)和功能miRNA轉(zhuǎn)移到未感染的細(xì)胞中，研究中比較20例HBV患者與對(duì)照組血清外泌體，miR-18a、miR-221、miR-222，miR-224增加，而miR-101，miR-106b 、miR-122和miR-195 減少，miR-21沒(méi)有顯著區(qū)別，提示這些蛋白質(zhì)可能參與HBV的發(fā)生發(fā)展，對(duì)其診斷有一定的指導(dǎo)意義。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-155是一種與炎癥相關(guān)的miRNA，在慢性HCV感染患者的血清和外周血單核細(xì)胞中表達(dá)水平升高，Welker等[20]發(fā)現(xiàn)慢性丙肝患者血清外泌體中CD81含量與炎癥活動(dòng)以及肝臟纖維化嚴(yán)重程度有關(guān)。Zhao等[21]通過(guò)比較來(lái)源于HBx(HBV中HBx基因)感染的Huh7細(xì)胞及對(duì)照組外泌體的蛋白成分，發(fā)現(xiàn)其中含肝癌相關(guān)蛋白(如VCP)，表明血清外泌體的某些特異蛋白可作為HBV或HBV導(dǎo)致的肝癌的標(biāo)記物。

五、肝臟纖維化

肝臟纖維化是細(xì)胞壞死以及炎癥刺激等引起肝臟細(xì)胞外基質(zhì)沉積的病理過(guò)程，肝纖維化是一個(gè)病理生理過(guò)程，肝硬化是肝纖維化長(zhǎng)期發(fā)展的晚期階段。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞(HSCs)與肝纖維化的形成密切相關(guān)，Chen等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)miR-124和miR-199a-59經(jīng)外泌體在HSCs間轉(zhuǎn)運(yùn)，減緩肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程，在肝臟發(fā)生纖維化時(shí)，外泌體攜帶的miR-214表達(dá)降低，推測(cè)miR-214可能是一種抑制肝纖維化的的標(biāo)志物，此研究還提示了血清外泌體中CTGF有助于診斷肝纖維化。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體可調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的活性；Momen等[25]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的miR-122有減少HSCs的增值和分化的作用；外泌體中的miRNA-10b在肝硬化中表達(dá)增加，在肝癌階段明顯增加，可達(dá)正常水平的10倍以上。這些指標(biāo)均有望在臨床上成為觀察肝纖維化早期以及進(jìn)展階段的指標(biāo)。

六、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)

ICP主要發(fā)生在妊娠晚期，以瘙癢和血清膽汁酸水平升高為特征。目前診斷ICP主要靠血清的膽汁酸水平。Jiang等[26]比較分析存在于ICP患者和健康孕婦尿液的外泌體，發(fā)現(xiàn)括miR-21、miR-29a和miR-590-3p在ICP患者和健康孕婦中有差異表達(dá)，它們的上調(diào)表達(dá)降低了細(xì)胞間黏附分子1 (ICAM1)的表達(dá)，進(jìn)而增加了ICP的發(fā)生率，提示尿液中的miR-21、miR-29a和miR-590-3p可能成為ICP的新型篩選及診斷標(biāo)志物。Zou等[27]發(fā)現(xiàn)ICP患者的miR-371a-5p、miR-6865-5p和miR-1182的表達(dá)水平顯著高于正常孕婦組，也提供了外泌體miRNA可能成為ICP診斷標(biāo)志物的證據(jù)。Zhang等[28]與Rao ZZ[29]等發(fā)現(xiàn)miR-148a與ICP的形成有潛在的聯(lián)系。Ma等[30]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-671-3p和hsa-miR-369-5p在ICP患者尿液中表達(dá)明顯上調(diào)，提示母體尿miRNAs很有可能成為ICP診斷的非侵入性新型生物標(biāo)志物。

綜上所述，外泌體參與了多種肝病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可能成為各種肝臟疾病發(fā)生進(jìn)程、診斷、判斷治療效果及預(yù)后的指標(biāo)。肝病是一個(gè)世界性的難題，微創(chuàng)肝活檢是大多數(shù)肝病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，外泌體作為新的熱點(diǎn)研究方向，可能成為新型、更可靠和非侵入性診斷標(biāo)志物。