基質(zhì)血管組分對肌腱損傷修復(fù)的研究進展*

林順 陳津 肖杰 林荊鵬 韓雪松**

（1.福建醫(yī)科大學福總臨床學院，福建福州 350004；2.聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院骨二科，福建福州 350001；3.聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院福建省干細胞應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，福建福州 350001）

肌腱損傷是一種臨床常見的骨科疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。外傷、負荷過大可導致肌腱部分撕裂或完全斷裂等急性損傷，而肌腱過度使用、組織老化是造成肌腱病變和肌腱炎等慢性損傷的常見原因。目前，臨床上對肌腱損傷的常規(guī)治療方法包括休息、冰敷、非甾體抗炎藥、物理治療、手術(shù)縫合等，但往往效果不佳。嚴重的肌腱損傷即使通過手術(shù)和后期護理也很難恢復(fù)其原來的強度和彈性[1]，且存在康復(fù)時間長、再損傷率高等問題[2]。干細胞具有促進組織修復(fù)與再生的功能，一些研究證實，干細胞對肌腱損傷的修復(fù)具有一定效果[3,4]?；|(zhì)血管組分（stromal vascular fraction,SVF）來源于自體脂肪，富含多種功能細胞和干細胞，在組織修復(fù)和再生中呈現(xiàn)出巨大的治療潛能。目前，已有大量關(guān)于SVF治療骨科疾病的臨床研究，如半月板撕裂[5]、骨關(guān)節(jié)炎[6]、椎間盤退變[7]等，本文就SVF 的功能、制備方法以及其在肌腱損傷修復(fù)方面的研究進展進行綜述。

1 SVF的概念

SVF是利用中性酶消化或利用機械切割等方式從脂肪組織中獲取，富含脂肪干細胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）、前脂肪細胞、周細胞、內(nèi)皮細胞、T細胞和M2型巨噬細胞等的多功能細胞群[8,9]。SVF 中富含的ADSCs可直接分化為肌腱細胞[10]，使肌腱組織的修復(fù)再生成為可能。前脂肪細胞、周細胞、血管內(nèi)皮細胞和各種免疫細胞屬于支持細胞，可通過旁分泌途徑調(diào)節(jié)微環(huán)境并趨化參與再生和修復(fù)。SVF 因制備方式的不同，分為細胞SVF（cellular-derived SVF,cSVF）和類組織SVF（tissue-like SVF,tSVF），前者涉及酶的消化，后者主要是使用機械法來獲取異質(zhì)細胞群。cSVF 是不同基質(zhì)細胞表型的懸浮液，而tSVF 還保留了細胞-基質(zhì)和細胞-細胞之間的相互作用[11]。脂肪微血管片段(adipose microvascular fragments,Ad-MVF)是一種新型的cSVF，含有細胞外基質(zhì)和血管段，比傳統(tǒng)的cSVF 擁有更大的血管生成潛能[12]。根據(jù)國際脂肪治療與科學聯(lián)合會和國際細胞治療學會關(guān)于SVF的聲明，SVF的概念是動態(tài)變化和不斷更新的，通常通過表型CD45-、CD235a-、CD31-、CD34+，以及其他的標志物CD13、CD73、CD90、CD105等來鑒定[13,14]。

2 SVF的功能

SVF具有促血管生成、抗凋亡、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和營養(yǎng)作用等功能。其中一些功能與ADSCs的存在相關(guān)，而另一些則與血管壁龕和SVF中所有細胞表型之間的相互作用有關(guān)。在血管生成的過程中，SVF中的血管壁龕是與血管相關(guān)的細胞表型的重要來源，包括周細胞（外膜位置）、內(nèi)皮祖細胞（管腔位置）、間充質(zhì)前體細胞、外膜上的脂肪基質(zhì)細胞（像鞘一樣包繞著血管）和內(nèi)皮細胞[15]，可作為血管生成的平臺。內(nèi)皮祖細胞和ADSCs 是SVF 中的兩個主要干細胞群。內(nèi)皮祖細胞在體外形成集落，同時具有血管生成和造血的能力[16]。新生血管形成是肌腱損傷修復(fù)的前提，為肌腱修復(fù)提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)，新生血管退化后，肌腱完成重塑與塑形。而內(nèi)皮細胞和ADSCs 之間的相互作用對于誘導ADSCs 的促血管生成是必要的[17]。

SVF 中含有M2 型極化的巨噬細胞，可表達白細胞介素-10（interleukin-10,IL-10）和白細胞介素-1拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist,IL-1ra），抑制促炎性因子表達和炎癥細胞的激活。此外，ADSCs可抑制樹突狀細胞的激活，通過產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細胞來抑制隨后的獲得性免疫，調(diào)節(jié)性T 細胞參與維持M2 表型的巨噬細胞[18]。肌腱炎愈合期是以M2型巨噬細胞為主的抗炎、修復(fù)的過程[19]。事實上，ADSCs 自身也能夠合成并釋放具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和促進血管生成細胞因子[20,21]。同時，ADSCs 可以減少轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的表達[22]，而TGF-β 是與組織器官纖維化最為密切的因子，因此SVF 擁有抗纖維化的功能。TGF-β1 在肌腱愈合過程中可導致肌腱組織黏連[23]，而肌腱黏連將引起患者疼痛、功能受限、運動障礙。但也有研究認為SVF 可促進TGF-β 的分泌[24]，這可能與組織、器官的條件有關(guān)，也可能受宿主組織微環(huán)境的影響，SVF 發(fā)揮其治療功效及生物學活性的機制還需進一步去研究。

3 SVF的制備方法

SVF是從脂肪組織中分離獲取的，其制備方法主要可以分為酶消化法和機械法。

3.1 酶消化法

酶消化法一般利用Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白酶，通過破壞細胞外基質(zhì)中的膠原纖維來消化脂肪組織，隨后加入培養(yǎng)基終止消化，再經(jīng)離心及過濾，得到的最下層沉淀即為SVF[25]。分離過程中得到的紅細胞是SVF 顆粒中的主要污染物，可以通過裂解紅細胞，以分離出更純凈的SVF 細胞[26]。與機械法相比，酶消化法可以從同等重量的組織中分離出更多的有核細胞，同時酶消化法獲取的細胞群中所占比例最多的是基質(zhì)細胞與干細胞，造血細胞只占其中的一小部分[27,28]，細胞在分離后0 h 和72 h 的存活率更高[29]。然而，酶消化法也具有一定的風險，如果在分離過程中沒有充分中和蛋白酶，可能會引發(fā)過敏反應(yīng)和體內(nèi)不必要的組織降解。

3.2 機械法

機械法包括洗滌、搖晃、振動、離心等技術(shù)，從吸脂物中分解脂肪組織并分離出基質(zhì)細胞群。因為膠原蛋白的緊密結(jié)合，脂肪組織中的細胞僅靠機械作用很難從中分離出來[30]，機械法的細胞產(chǎn)量也因此比酶消化法少很多。Tonnard 等[31]通過兩個注射器來回推注30次來實現(xiàn)脂肪的乳化，獲得“納米脂肪”，但實際上沒有脂肪細胞在乳化過程中存活下來，并且移植的細胞中含有豐富的CD34+ADSCs。許多研究者在此基礎(chǔ)上做了改進，使SVF 中的ADSCs 濃度更高[32]。盧沛伶等[33]在離心管中加入玻璃珠，利用震蕩產(chǎn)生的剪切力對脂肪組織進行破碎，與內(nèi)置式超聲波破碎法效果相似，對SVF 細胞的損傷較小，保障了SVF 細胞的活性。市面上已經(jīng)開發(fā)出適用于臨床再生的一次性自動化設(shè)備，如Lipogems、Fatstem、Mystem等，且都獲取得了一定成效。與酶消化法相比，機械法制備而成的SVF擁有完整的血管周圍壁龕，可釋放出更多的生長因子和細胞因子，促進組織修復(fù)和血管生成[34]，加上其更經(jīng)濟、耗時更少、安全性更高等優(yōu)勢，在臨床治療上也更受青睞。

4 SVF對肌腱損傷的修復(fù)

肌腱細胞結(jié)構(gòu)單一，有絲分裂頻率較低，導致?lián)p傷愈合較慢。Gon?alves 等[27]的研究表明，SVF 中分離出腱調(diào)蛋白陽性的ADSCs 與未分選的細胞群相比，在培養(yǎng)28 d 后，肌腱基因表達上調(diào)、合成的細胞外基質(zhì)富含Ⅰ型和Ⅲ型膠原，具有肌腱祖細胞的表型特征。在生物化學方法誘導下，SVF 可分化成肌腱細胞，使肌腱再生成為可能。Polly等[35]將馬的肌腱細胞與同種異體的SVF 或SVF 細胞群分離培養(yǎng)的基質(zhì)細胞進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子-1（insulin like growth factor,IGF-1）、基質(zhì)細胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α）、TGF-β3 和TGF-β1 在SVF 組與基質(zhì)細胞組中的濃度都顯著升高。在肌腱愈合過程中，SDF-1α 具有強大的趨化作用[36]，TGF-β1、TGF-β3 和IGF-1 則參與調(diào)節(jié)細胞增殖和分化[37]。

4.1 SVF在屈肌腱損傷修復(fù)中的應(yīng)用

屈肌腱橫斷是手部常見的損傷之一，多由外傷性因素引起。Nixon 等[38]利用蛋白酶建立了8 只指淺肌腱炎的馬模型，通過自體SVF 治療，發(fā)現(xiàn)SVF 可以減輕局部的炎癥反應(yīng)，顯著改善纖維結(jié)構(gòu)與密度，同時減少肌腱組織中Ⅲ型膠原蛋白的形成。而Lu 等[39]的研究發(fā)現(xiàn)SVF 治療組的Ⅲ型膠原含量高于空白對照組，可能與SVF 的注射濃度或注射時間有關(guān)，SVF中的多種細胞因子具有濃度依賴性，微環(huán)境中SVF的生物靶標可能在肌腱損傷數(shù)小時后就已經(jīng)消失或發(fā)生表型轉(zhuǎn)變。Behfar等[40]將SVF與安慰劑分別注入指深屈肌腱斷裂的兔模型中，于術(shù)后8周處死動物后解剖發(fā)現(xiàn)，SVF 治療組較對照組的纖維排列緊密且規(guī)則，Ⅰ型膠原表達明顯增加。在肌腱細胞外基質(zhì)中，Ⅰ型膠原約占95%，同時還有少量Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ、Ⅻ型膠原，Ⅰ型膠原的高表達和纖維規(guī)則排列對于肌腱的抗拉強度和損傷的早期愈合至關(guān)重要。但也有研究者認為，生物力學測試才是是評估肌腱治療效果的“金標準”。Behfar 等[41]在后續(xù)實驗中通過力學測試觀察到在第3周和第8周時，SVF治療組的極限載荷、屈服載荷、應(yīng)力和能量吸收均顯著高于安慰劑對照組。Behfar 等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，SVF 和骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）均可增加損傷肌腱的生物力學性能，且在第8 周時，SVF 的能量吸收、應(yīng)變和剛度相較BMSCs顯著增加。

4.2 SVF在肩袖損傷中的應(yīng)用

由于肌腱-骨愈合能力低、愈合時間長，導致肩袖修補術(shù)后再撕裂率為11.0%～57.3%[43]。Lu 等[44]觀察了36 只岡上肌肌腱斷裂的兔模型，采用SVF-纖維蛋白膠（SVF-fibrin glue,SVF-FG）與FG 進行隨機對照試驗，得出SVF-FG 組的最大載荷、最大強度、剛度等生物力學指標均明顯高于FG對照組。Lu等[44]在原有實驗基礎(chǔ)上加以改進，觀察到SVF-FG 組的肌腱-骨愈合成熟度評分顯著高于對照組，Ⅰ型膠原表達水平與Ⅲ型膠原表達水平始終高于對照組，Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原面積比也明顯高于對照組，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 表達也有所增加。肩袖撕裂患者的肌肉狀態(tài)和功能較差，影響術(shù)后康復(fù)。Gumucio 等[45]通過治療免疫缺陷大鼠的慢性岡上肌撕裂，指出接受注射人SVF 的大鼠肌肉纖維化程度比溶劑對照組降低了40%，肌肉質(zhì)量得到改善。SVF 可能是直接或間接通過調(diào)節(jié)巨噬細胞來抑制膠原合成和減少成纖維細胞的增殖[46]。

4.3 SVF在跟腱病中的應(yīng)用

跟腱是人體最粗大的肌腱之一，同時也是最容易受傷的肌腱之一。富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）已被證實能夠有效促進斷裂跟腱的再生[47]。Albano 等[48]開展了一項SVF和PRP對比治療43例非插入性跟腱病患者的隨機對照研究，在隨訪6個月后發(fā)現(xiàn)兩組的VAS 評分均明顯降低，且MRI、超聲和能量多普勒測量的肌腱厚度均明顯增加。Usuelli 等[49]前瞻性比較PRP 和SVF 注射治療跟腱炎的療效，接受SVF治療的患者在治療15 d后疼痛緩解和功能恢復(fù)方面取得顯著的臨床改善，而15 d和30 d隨訪結(jié)果也明顯優(yōu)于PRP 組患者，可能是由于SVF釋放的抗炎和免疫調(diào)節(jié)分子比PRP 中包含的分子具有更高和更持久的活性。

綜上，傳統(tǒng)治療方法在肌腱損傷修復(fù)中效果不理想，SVF 能促進肌腱損傷的修復(fù)，可能為肌腱損傷的治療提供一種療效更持久、受損組織可再生的新療法。SVF 還具備創(chuàng)傷小、安全性高、易于制備和獲取等優(yōu)勢，在肌腱損傷修復(fù)中的應(yīng)用前景得到逐步體現(xiàn)，但是目前尚有諸多問題需要解決，如SVF 最佳的制備方法、最適的細胞濃度、最佳的使用方式、適應(yīng)證和禁忌證等，以及其在臨床治療中的效果如何，需要進一步臨床試驗加以確定。隨著醫(yī)學研究的不斷深入，期待SVF在肌腱損傷修復(fù)的臨床治療上發(fā)揮其優(yōu)勢。