自噬對(duì)糖皮質(zhì)激素作用下MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響*

陳俊名 劉又文 張虹 何沛霖 曹國(guó)瑞 毛驍 童培建 岳辰，4**

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350122；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院髖部損傷科，河南洛陽 471002；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨傷科，杭州 310006；4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053）

激素性股骨頭壞死（glucocorticoid-induced osteonecrosis of femoral head,GONFH）是骨科常見疾病，超劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids,GCs）是其病因[1,2]。針對(duì)GONFH，目前尚缺乏有效的治療方法，明確其發(fā)病機(jī)制和早期預(yù)防一直是研究重點(diǎn)。目前有研究表明，GONFH的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞自噬密切相關(guān)[3,4]。

自噬是細(xì)胞吞噬自身受損蛋白或細(xì)胞器并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解并重新再利用的過程[5]在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、抑制凋亡、促進(jìn)細(xì)胞發(fā)揮正常功能方面具有重要作用[5-7]。自噬是細(xì)胞自我保護(hù)行為，但研究發(fā)現(xiàn)過度激活自噬可能抑制細(xì)胞生物學(xué)功能，加速細(xì)胞死亡[8,9]。一方面，過度激活的自噬是促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡的原因之一，抑制自噬可減輕GCs引起的細(xì)胞損傷[3]；另一方面，有研究認(rèn)為自噬對(duì)GCs作用下的成骨細(xì)胞起保護(hù)作用，提高自噬水平能夠有效減少GCs 作用下的成骨細(xì)胞凋亡、提高成骨活性[4]。GCs作用下成骨細(xì)胞自噬與其生物活性間的關(guān)系目前尚存爭(zhēng)議。本研究以MC3T3-E1 小鼠成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，探討GCs對(duì)成骨細(xì)胞自噬以及GCs作用下自噬對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力的影響，為從細(xì)胞自噬角度闡述GONFH的發(fā)病機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

0.25%胰蛋白酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），1%青鏈霉素，10%胎牛血清（HyClone，美國(guó)），地塞米松（dexamethasone,DXMS）（索萊寶，中國(guó)），雷帕霉素（Selleck，美國(guó)），CCK-8 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（東仁，日本），酶標(biāo)儀（Thermo，美國(guó)），PAGE 凝膠快速制備試劑盒（雅酶，中國(guó)），LC-3B 兔單克隆抗體（CST，美國(guó)）、Beclin-1 兔單克隆抗體（CST，美國(guó)）、β-Actin 兔單克隆抗體（CST，美國(guó)），F(xiàn)ITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG、羅丹明標(biāo)記山羊抗兔IgG（中杉金橋，中國(guó)），812 環(huán)氧樹脂包埋套裝、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染液（中鏡科儀，中國(guó)）、正置熒光顯微鏡（Olympus，日本），透射電鏡（JEOL，日本），RIPA 裂解液（索萊寶，中國(guó)）、DAPI 染色劑（Boster，中國(guó)）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）染色劑（碧云天，中國(guó)）、Alexa Fluor 350染色劑（碧云天，中國(guó)）。

1.2 MC3T3-E1成骨細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠MC3T3-E1 成骨細(xì)胞由浙江中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所提供，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞分組、處理及檢測(cè)：以不同濃度（0、10-8M、10-6M、10-4M）DXMS 分別作用于MC3T3-E1 成骨細(xì)胞，CCK-8檢測(cè)不同時(shí)間（12 h、24 h、48 h）的細(xì)胞增殖能力；在上述基礎(chǔ)上，以Western Blot、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)Beclin-1和LC-3的表達(dá)水平，透射電鏡檢測(cè)自噬小體數(shù)目，明確不同濃度DXMS作用下成骨細(xì)胞自噬變化特點(diǎn)。在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將細(xì)胞分為對(duì)照組、10-6M DXMS組、3 μM RAP組、3 μM RAP+10-6M DXMS 組，以上述同樣的技術(shù)檢測(cè)自噬的變化及細(xì)胞增殖能力的變化，并據(jù)此明確自噬對(duì)GCs作用下MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖能力的影響。

1.3.2 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖：MC3T3-E1 成骨細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度至70%～80%時(shí)，用胰蛋白酶消化，1000 rpm 離心5 min，收集細(xì)胞，加入10 μl不同濃度的DXMS，再加入10 μl CCK-8溶液，然后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.3.3 Western Blot 檢測(cè)Beclin-1 和LC-3B 的表達(dá)：在培養(yǎng)皿中用PBS 洗滌細(xì)胞，加入含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，收集到EP 管中，吹打細(xì)胞后冰凍30 min，低溫12000 rpm 離心15 min，收集上清液，加入緩沖液，煮沸10 min，電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用TBS/T 洗滌20 min×3 次，一抗在4℃孵育過夜，TBS/T 清洗后加入適當(dāng)稀釋度的二抗，室溫孵育1 h后用TBS/T洗滌20 min×3次，檢測(cè)蛋白。

1.3.4 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)Beclin-1 和LC-3B 染色：MC3T3-E1 細(xì)胞用DXMS 處理，冷甲醇固定10 min，PBS 沖洗兩次。在PBS 中孵育10 min 后用PBS 洗滌5 min×3 次。與山羊血清封閉孵育30 min 后在4℃的濕箱中孵育過夜，一抗為Beclin-1和LC-3B。棄液后用PBS沖洗細(xì)胞5 min×3次，用熒光二抗室溫孵育1 h，PBS沖洗細(xì)胞5 min×3次、避光，后用DAPI重新染色，在陽性熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 透射電鏡檢測(cè)自噬小體：細(xì)胞離心10 min 去掉上清液，加入0.5%戊二醛固定液，在4℃靜置10 min、離心15 min、去掉上清液，加入3%戊二醛固定液。再將樣品用3%戊二醛和1%四氧化鋨再固定，丙酮分步脫水。樣品依次用脫水劑和環(huán)氧樹脂滲透液處理，包埋切片，室溫染色，透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同處理組的差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MC3T3-E1成骨細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

待細(xì)胞匯合度至70%～80%時(shí)，用胰蛋白酶消化，1000 rpm 離心5 min，收集細(xì)胞示MC3T3-E1 細(xì)胞生長(zhǎng)48 h，融合度達(dá)80%以上（圖1）。

圖1 MC3T3-E1細(xì)胞呈波浪形生長(zhǎng)并鋪滿瓶底（100×）

2.2 不同濃度DXMS對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8測(cè)定不同時(shí)間（12 h、24 h、36 h）不同濃度（0、10-8M、10-6M、10-4M）DXMS 對(duì)MC3T3-E1 成骨細(xì)胞增殖能力的影響。與對(duì)照組相比，10-8M DXMS 組對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響（P＞0.05），10-6M DXMS 組對(duì)細(xì)胞增殖能力影響較明顯（P＜0.05），10-4M DXMS 組對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響最明顯（P＜0.05）。可見GCs濃度越高，對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖能力的影響越明顯（圖2）。

2.3 不同濃度DXMS 對(duì)MC3T3-E1 成骨細(xì)胞自噬水平的影響

將MC3T3-E1 成骨細(xì)胞分別用0、10-8M、10-6M、10-4M DXMS處理24 h，使用Western Blot、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)各組Beclin-1、LC-3B的表達(dá)水平，使用透射電鏡檢測(cè)自噬小體數(shù)量。Western Blot結(jié)果示，與對(duì)照組相比，不同濃度DXMS組的Beclin-1和LC-3B Ⅱ/Ⅰ表達(dá)上升，且DXMS 濃度越高，Beclin-1 和LC-3B Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)水平提高越顯著（圖3）。細(xì)胞免疫熒光染色顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度DXMS 組的Beclin-1和LC-3B 表達(dá)量增加，且DXMS 濃度越高，Beclin-1和LC-3B 表達(dá)水平提高越顯著（圖4）。透射電鏡可見，不同濃度DXMS組均可在成骨細(xì)胞內(nèi)形成自噬小體，且DXMS濃度越高，自噬小體數(shù)量越多（圖5）。

2.4 提高自噬水平對(duì)DXMS 作用下成骨細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8 檢測(cè)結(jié)果示，加入3 μM RAP 后，成骨細(xì)胞增殖能力顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6）。Western Blot 結(jié)果及細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果示，在10-6M DXMS 中加入自噬激動(dòng)劑RAP 后，成骨細(xì)胞Beclin-1 和LC-3B Ⅱ/Ⅰ蛋白水平均明顯提高，自噬小體進(jìn)一步增多（圖7～9）；可見提高自噬水平有助于減輕GCs對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力的抑制。

圖2 CCK-8測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度DXMS作用下的MC3T3-E1細(xì)胞增殖率

圖3 Western Blot檢測(cè)不同濃度DXMS組Beclin-1和LC-3B Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平

3 討論

3.1 GONFH與細(xì)胞自噬

GCs作用下股骨頭內(nèi)成骨細(xì)胞死亡，成骨活性下降，骨修復(fù)能力不足，繼而導(dǎo)致骨小梁力學(xué)強(qiáng)度降低是誘發(fā)GONFH 發(fā)生、發(fā)展，進(jìn)而出現(xiàn)股骨頭塌陷的重要因素之一[10-12]。GCs作用下成骨細(xì)胞活性受抑的原因尚不完全明確，最新觀點(diǎn)表明其與GCs作用下的細(xì)胞自噬密切相關(guān)[13-15]。

自噬指細(xì)胞吞噬衰老、失能的結(jié)構(gòu)并回收再利用的過程，為細(xì)胞生存提供能量前體物質(zhì)，是真核生物面對(duì)刺激的一種自我保護(hù)行為。正常情況下自噬維持于低水平，當(dāng)缺氧、激素等刺激細(xì)胞時(shí)，自噬被激活，形成自噬小體吞噬衰老、失能的細(xì)胞結(jié)構(gòu)并分解為可利用的小分子物質(zhì)，重新參與能量代謝[5-7]。Beclin-1 是細(xì)胞自噬的特異性基因，其表達(dá)水平能夠直接反映細(xì)胞自噬的活性[5,6]。而LC-3B 是另一種常見的自噬標(biāo)志物，自噬形成時(shí)胞漿型LC3I 會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型LC-3B Ⅱ，因此LC-3B Ⅱ/Ⅰ比值可評(píng)估自噬水平的高低[7,9]。細(xì)胞面對(duì)異常環(huán)境時(shí)激活自噬產(chǎn)生自我保護(hù)，但只有適度的自噬活性才能發(fā)揮自我保護(hù)功能。若自噬活性不足，則無法有效清除受損、失能的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時(shí)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)循環(huán)再利用受阻，細(xì)胞自我保護(hù)不足，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷；而若自噬水平過高，自噬性溶酶體不僅吞噬衰老、失能的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，更會(huì)無差別吞噬正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞因自我保護(hù)過當(dāng)而受損[16-18]。

圖4 Beclin-1及LC-3B細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

圖5 透射電鏡（15000×）下可見DXMS處理細(xì)胞后胞內(nèi)形成雙側(cè)膜或多層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體（箭頭所示），隨著DXMS濃度增高，自噬小體數(shù)量進(jìn)一步增加

圖6 CCK-8測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)各組MC3T3-E1細(xì)胞增殖率

圖7 Western Blot檢測(cè)各組Beclin-1和LC-3B Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平

在骨壞死研究領(lǐng)域，盡管目前的研究結(jié)果明確GONFH 的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞自噬密切相關(guān)，但研究結(jié)果和結(jié)論存在爭(zhēng)議。Li 等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，自噬的過度激活是促進(jìn)GONFH 發(fā)生、發(fā)展的原因，抑制自噬可減輕GCs 引起的細(xì)胞損傷。而Zhang 等[4]的研究表明，在生理低劑量DXMS 作用下，成骨細(xì)胞的自噬被激活而產(chǎn)生自我保護(hù)，此時(shí)細(xì)胞凋亡水平極低。加入自噬抑制劑后，成骨細(xì)胞凋亡水平則明顯提高，Han 等[14]的研究也得到相似結(jié)果，認(rèn)為GCs 作用下成骨細(xì)胞自噬水平不足，提高自噬水平能夠有效減少GCs作用下的成骨細(xì)胞死亡。

3.2 自噬對(duì)GCs作用下成骨細(xì)胞的作用

本研究中，首先明確隨著GCs 濃度增高，其對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力的抑制越強(qiáng)，而Western Blot、細(xì)胞免疫熒光及透射電鏡等多種檢測(cè)手段的結(jié)果示隨著DXMS 濃度的增加，Beclin-1 和LC-3B Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)水平均明顯提高，自噬小體數(shù)量明顯增加，說明自噬水平隨GCs 濃度的增高而增強(qiáng)。隨之，在10-6M DXMS 培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中加入自噬激活劑RAP后，Beclin-1和LC-3B的表達(dá)水平及自噬小體數(shù)量進(jìn)一步提高，而成骨細(xì)胞增殖能力變強(qiáng)，說明提高自噬水平有助于減少GCs對(duì)成骨細(xì)胞增殖的抑制作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，自噬對(duì)GCs作用下成骨細(xì)胞增殖起保護(hù)作用，隨著GCs濃度的增高自噬水平明顯增加，但仍表現(xiàn)為相對(duì)不足，不足以抵抗高濃度GCs對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，提高自噬水平有助于促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。

3.3 本研究的不足之處

①由于自噬能夠?qū)Π▔乃繹19]、凋亡[20]、焦亡[21]在內(nèi)的多種細(xì)胞死亡方式產(chǎn)生明顯影響，因此本研究?jī)H分析了自噬對(duì)GCs 作用下成骨細(xì)胞增殖的影響，而未深入研究具體參與調(diào)控了哪類細(xì)胞死亡方式；②GCs誘發(fā)成骨細(xì)胞自噬的具體機(jī)制極為復(fù)雜，可能涉及多條信號(hào)通路、microRNA、LncRNA 等[22,23]，而本研究未進(jìn)行相關(guān)的機(jī)制探討。這些是本研究的不足，也是后續(xù)研究的重點(diǎn)和方向。

圖8 Beclin-1及LC-3B細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

圖9 透射電鏡（15000×）下可見DXMS或RAP處理細(xì)胞后胞內(nèi)形成雙側(cè)膜或多層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體（箭頭所示），在DXMS中加入RAP后，自噬小體數(shù)量進(jìn)一步增加