UPLC-Q-TOF/MS結合鏡像對比分析竹節(jié)參炮制前后成分變化

張也，伍紅年，雷雅婷，劉隆基，王元清，劉樂平，嚴建業(yè)

〔摘要〕 目的 基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）結合鏡像技術對比分析竹節(jié)參炮制前后成分的變化。方法 采用ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱;流動相為0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫;質(zhì)譜采用電噴霧（ESI）離子源，在負離子模式下采集數(shù)據(jù)。結果 通過對照品指認、軟件預測分析，結合文獻報道，從竹節(jié)參炮制品中鑒定并推測出29個皂苷類化合物，與生品相比新增5種成分。結論 利用UPLC-Q-TOF/MS系統(tǒng)闡明竹節(jié)參生品與炮制品中化學成分，并初步歸納其質(zhì)譜裂解特點，結合鏡像對比分析，闡明不同炮制方法對竹節(jié)參皂苷類成分的影響，經(jīng)加熱炮制后竹節(jié)參中的成分數(shù)量與響應面積均發(fā)生變化，為竹節(jié)參的質(zhì)量控制和炮制應用研究提供了參考依據(jù)。

〔關鍵詞〕 竹節(jié)參;皂苷類;炮制;超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.008

Comparative Analysis of Composition Changes of Panacis Japonici Rhizoma Before and After Processing by UPLC-Q-TOF/MS Combined with Mirror Image

ZHANG Ye1， WU Hongnian1，2， LEI Yating1，3， LIU Longji1， WANG Yuanqing4， LIU Leping1， YAN Jianye1，3*

（1. Institute of Innovation and Applied Research in Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The People's Hospital of Liuyang， Liuyang， Hunan 410399， China; 3. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 4. The College of Life Science and Technology， Central South University of Forestry and Technology， Changsha， Hunan 410004， China）

〔Abstract〕 Objective To compare and analyze the changes of components of Panacis Japonici Rhizoma before and after processing based on ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/MS） and mirror image technique. Methods The ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） column was performed; the mobile phase consisted with 0.1% formic acid （A） and acetonitrile （B） for gradient elution; electrospray ion （ESI） source was applied for the analysis under the negative ion mode. Results 29 saponins were identified and inferred from Panacis Japonici Rhizoma processed products by reference substance identification， software prediction analysis and literature reports， and 5 new components were added compared with raw product. Conclusion The chemical constituents of Panacis Japonici Rhizoma raw product and processed products were elucidated by UPLC-Q-TOF/MS system， and the characteristics of mass spectrometry fragmentation were preliminarily summarized. The effects of different processing methods on the saponins of Panacis Japonici Rhizoma were clarified by mirror contrast technique. The number and response area of components in Panacis Japonici Rhizoma changed after heating processing， which provided a reference basis for the quality control and processing of Panacis Japonici Rhizoma.

〔Keywords〕 Panacis Japonici Rhizoma; saponins; processing; ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry

竹節(jié)參又名白三七、竹節(jié)三七、竹節(jié)人參等，為五加科植物竹節(jié)參Panax japonicus C. A. Mey.的干燥根莖[1]，收載于1977年及以后各版《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》），具有人參和三七的活血化瘀、滋補強壯之功效。現(xiàn)代研究表明，竹節(jié)參中主要含有皂苷類、糖類、氨基酸、揮發(fā)油、無機元素等成分[2]。皂苷類成分為竹節(jié)參中最主要的成分，竹節(jié)參總皂苷對免疫性炎癥及一般炎癥均具有較好療效[3]。

竹節(jié)參是我國西南民族地區(qū)民間常用中草藥，目前，國內(nèi)外對竹節(jié)參的研究主要集中于化學成分與藥理作用，對竹節(jié)參的炮制應用研究少見報道。2020年版《中國藥典》一部竹節(jié)參飲片項下對炮制只有簡單的描述“用時搗碎”，各省市的炮制規(guī)范中，對竹節(jié)參的炮制只有“取原藥材，除去雜質(zhì)”“洗凈，潤透，切厚片，干燥”等簡略描述。竹節(jié)參與人參、三七為同科同屬植物，在應用上又有類似人參的益氣補虛與三七的舒筋活血功效[4]，其中人參、三七均有相應的炮制研究，人參有生曬參、紅參、大力參、糖參、酒制參、醋制參、黃泥煨參等炮制品，三七有蒸制、砂炒、酒制、烘焙等炮制方法。中藥經(jīng)過加工炮制后，藥性和臨床療效都發(fā)生顯著的變化，說明中藥在炮制過程中，其物質(zhì)基礎發(fā)生了變化[5]。中醫(yī)藥理論認為，酒制能通行血脈，藥物酒制后能增強藥物活血、通絡、止痛之功效，從而增強祛風濕止痛的作用;醋制時能引藥入肝經(jīng)，入血分，增強散瘀止痛之功效[6-7]。根據(jù)酒制和醋制的功效與機理以及目前人參、三七的炮制應用，提示竹節(jié)參經(jīng)炮制后有望能增強其臨床療效。

為了明確竹節(jié)參炮制前后活性成分變化規(guī)律并評價其質(zhì)量，對化學成分進行研究十分必要。近年來超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）分析技術，集UPLC快速有效的色譜分離能力和高分辨質(zhì)譜靈敏度高、定性能力強于一體，已成為中藥活性成分的快速分離和鑒定的有力手段之一[8]。本研究以民間藥物“草藥之王”竹節(jié)參為研究對象，采用UPLC-Q-TOF/MS技術結合鏡像對比分析其炮制前后化學成分變化規(guī)律，為竹節(jié)參的質(zhì)量評價研究與臨床合理應用提供理論依據(jù)，為其他的民族類藥材開發(fā)利用提供有益借鑒。

1 儀器與材料

1.1? 主要儀器

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）、Xevo G2-XS Q-TOF/MS四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（美國Waters公司）;YX-18LDJ型手提式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設備有限公司）;LE204E/02型電子天平（梅特勒-托利多有限公司）;Option R7 utra AN超純水系統(tǒng)（英國ELGA

LabWaters公司）。

1.2? 主要試劑與試藥

竹節(jié)參藥材購自湖北恩施，11批竹節(jié)參生品與炮制品藥材信息見表1，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學龔力民副教授鑒定為五加科植物竹節(jié)參Panax japonicas C. A. Mey. 的干燥根莖;對照品人參皂苷Rg1（批號wkq15121303）、Re（批號wkq16081605）、Rb1（批號wkq16060402）均購于四川省維克奇生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均≥98%;竹節(jié)參皂苷V（批號HG027158198）、IV（批號HA305950198）、IVa（批號HC027157198）均購于寶雞市辰光生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均≥98%;乙腈、甲醇（質(zhì)譜純，德國默克股份有限公司），甲酸（質(zhì)譜純，德國CNW公司），實驗用水均為超純水。

2 方法

2.1? 藥材的炮制

2.1.1? 生品? 取竹節(jié)參藥材，放入合適的容器中，噴淋適量水，悶潤至透，切成5～10 mm段，干燥，篩取灰屑，即得。

2.1.2? 蒸法? 取竹節(jié)參飲片20 g，放入合適的容器中，加入適量水，悶潤2 h后放入蒸鍋內(nèi)，設置壓力0.1 MPa（121 ℃），分別蒸3 h，取出，70 ℃干燥[9]。

2.1.3? 醋蒸法? 取竹節(jié)參飲片20 g，放入瓷盆中，加20%米醋，悶潤2 h后，0.1 MPa（121 ℃）蒸制3 h，70 ℃烘，取出，放涼后即得[10]。

2.1.4? 酒蒸法? 取竹節(jié)參飲片20 g，放入合適的容器中，加20%黃酒（濃度為10%），悶潤2 h后，放入蒸鍋內(nèi)，設置壓力0.1 MPa（121 ℃），蒸制3 h，取出，70 ℃干燥[11]。

2.1.5? 烘法? 取竹節(jié)參飲片20 g，放入合適的容器中，加入超純水，悶潤2 h后130 ℃烘制3 h，取出，放涼后即得[12]。

2.1.6? 醋烘法? 取竹節(jié)參飲片20 g，放入瓷盆中，加20%米醋，悶潤2 h后130 ℃烘制3 h，取出，放涼后即得[13]。

2.1.7? 酒烘法? 取竹節(jié)參飲片20 g，放入合適的容器中，加20%黃酒（濃度為10%），悶潤2 h后，130 ℃烘制3 h，取出，70 ℃干燥[12]。

2.1.8? 炒法? 取竹節(jié)參飲片20 g，放入合適的容器中，加入超純水，悶潤2 h后，文火炒制6 min，盛出，放涼后即得[14]。

2.1.9? 醋炒法? 取竹節(jié)參飲片20 g，放入瓷盆中，加20%米醋，悶潤2 h后，文火炒制6 min，盛出，放涼后即得[15]。

2.1.10? 酒炒法? 取竹節(jié)參20 g，放入合適的容器中，加20%黃酒（濃度為10%），悶潤2 h，文火炒制6 min，盛出，放涼后即得[12]。

2.1.11? 醋煮法? 取竹節(jié)參飲片20 g，放入瓷盆中，加20%米醋，悶潤2 h后，放入鍋中，再加入米醋，文火加熱至液體輔料收干，盛出后于120 ℃烘箱中烘干，取出，放涼后即得[16]。

2.2? 對照品溶液的制備

稱取人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）、竹節(jié)參皂苷（V、IV、IVa）適量，置5 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，定容，搖勻，得到含人參皂苷Rg1（100 μg/mL）、Re（68.60 μg/mL）、Rb1（102 μg/mL）、竹節(jié)參皂苷V（1 500 μg/mL）、IV（700 μg/mL）、IVa（800 μg/mL）的混合對照品溶液。

2.3? 供試品溶液的制備

取竹節(jié)參生品與炮制品粉末（過40目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.4? 分析條件

2.4.1? 色譜條件? ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流動相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～2 min，92% A;2～3 min，92%～87% A;3～5 min，87%～79.5% A;5～11 min，79.5%～74% A;11～13 min，74%～73% A;13～15 min，73%～69% A;15～34 min，69%～58% A;34～40 min，58%～25% A;40～45 min，25%～8% A;45～47 min，8% A;47～52 min，8%～92% A;體積流量0.3 mL/min;柱溫35 ℃;進樣量1 μL。

2.4.2? 質(zhì)譜條件? ESI負離子模式，錐孔電壓30 V，毛細管電壓1 KV，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，脫溶劑氣體流速50 L/h，采集方式為MSE，采集時間52 min，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 500，碰撞能量40～60 V，碰撞氣體高純氬氣，亮氨酸腦啡肽進行實時校正。

2.5? 數(shù)據(jù)處理

采用UPLC-Q-TOF/MS模式采集數(shù)據(jù)，使用UNIFITM軟件進行竹節(jié)參提取液化學成分的自動識別。查閱文獻，建立竹節(jié)參數(shù)據(jù)庫，以補充原有的傳統(tǒng)中藥庫，將查找到的化合物化學結構保存為摩爾格式文件，將竹節(jié)參數(shù)據(jù)庫導入分析方法中;運用UNIFITM軟件自動對數(shù)據(jù)篩查、鑒定，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工提峰、計算分子式以及分析碎片斷裂情況;結合碎片離子理論精確質(zhì)量數(shù)、保留時間和分子式，使用對照品比對以及查閱相關文獻，對各主要化合物進行人工識別和鑒定。

3 結果與分析

3.1? 竹節(jié)參生品與炮制品化學成分的UPLC-Q-TOF/MS檢測結果與UNIFITM定性分析

本研究對竹節(jié)參生品與炮制品進行了液相色譜-質(zhì)譜分析，在負離子模式下，竹節(jié)參生品與醋烘品的基峰強度離子流圖（BPI）見圖1。

將采集的實驗數(shù)據(jù)進行定性分析，與建立好的數(shù)據(jù)庫進行比對，結合參考文獻[17-18]與對照品，最終共鑒定和推測化合物29個皂苷類成分，其29個化合物信息，包括各化合物的保留時間，分子質(zhì)量及質(zhì)譜裂解碎片離子如表2。

3.2? 竹節(jié)參中皂苷類成分的質(zhì)譜解析

竹節(jié)參及其炮制品的主要成分為人參皂苷類化合物，人參皂苷在ESI-模式下的一級質(zhì)譜圖中，準分子離子主要以[M-H]-和[M+HCOOH-H]-形式存在[17]。皂苷類成分苷元部分較為穩(wěn)定，一般較大壓力下也僅失去糖碎片，多數(shù)皂苷中呈現(xiàn)相似的單糖或寡糖碎片裂解規(guī)律。本實驗以化合物5、10、18為例，詳細分析化合物的裂解過程。

化合物5的一級質(zhì)譜在保留時間為11.84 min時，出現(xiàn)m/z 991.546 15[M+HCOO-H]-和m/z 945.541 464[M-H]-，計算其分子式為C48H82O18，在二級質(zhì)譜圖中，碎片m/z 799.483 38[M-H-Rha]-、碎片m/z 783.488 92[M-H-Glc]-、碎片m/z 637.320 0[M-H-Rha-Glc]-，結合參考文獻[19]與對照品質(zhì)譜將其確定為人參皂苷Re。

化合物10的一級質(zhì)譜在保留時間為20.86 min時，出現(xiàn)m/z 1153.598 55[M+HCOO-H]-和m/z 1107.593 96[M-H]-，計算其分子式為C54H92O23，在二級質(zhì)譜圖中，碎片m/z 945.541 63[M-H-Glc]-，碎片m/z 783.489 36[M-2Glc]-，結合參考文獻[19]與對照品質(zhì)譜將其確定為人參皂苷Rb1。

化合物18的一級質(zhì)譜在保留時間為27.78 min時，出現(xiàn)m/z 793.436 15[M-H]-，計算其分子式為C42H66O14，在二級質(zhì)譜圖中，碎片m/z 631.384 91 [M-H-Glc]-、碎片m/z 569.384 41[M-Glc-CO2-H2O]-，結合參考文獻[20]與對照品質(zhì)譜將其確定為竹節(jié)參皂苷IVa。

3.3? 竹節(jié)參生品與炮制品鏡像對比

在負離子模式下，觀察生品與加熱炮制品總離子圖，生品與加熱炮制品存在較多相似的成分，主要色譜峰保留時間一致，但是峰面積發(fā)生了較大的變化，生品與加熱炮制品的總離子流圖的鏡像對比如圖2所示。

觀察圖2A可知，生品與蒸制炮制品色譜峰保留時間與響應強度基本一致，但蒸制品化學成分明顯增多。

觀察圖2B可知，生品與烘制炮制品色譜峰保留時間與響應強度基本一致，但烘制品化學成分明顯增多。

觀察圖2C可知，生品與炒制炮制品色譜峰保留時間與化學成分基本一致，但炒制化合物響應強度較生品偏低。

觀察圖2D可知，生品與醋煮品色譜峰保留時間與化學成分基本一致，但醋煮品化合物響應強度較生品偏高。

3.4? 竹節(jié)參生品與各炮制品炮制過程中化學成分的變化

從表3可以看出，竹節(jié)參在不同炮制方法與不同輔料的條件下，化學成分發(fā)生巨大的變化。圖3與表3的竹節(jié)參皂苷類成分響應面積從整體來看，經(jīng)過不同的炮制，較多成分含量都相應減少，其中蒸制法對成分的分解影響大于其他炮制方法。竹節(jié)參經(jīng)加熱炮制后產(chǎn)生了新的成分：葉三七皂苷F（17號峰）、人參皂苷Rg3（24號峰）、Rg6（25號峰）、F4（26號峰）、Rk1（29號峰），依據(jù)竹節(jié)參同科同屬藥材（如人參、三七等）炮制對化學成分的影響，推測這些成分是在加熱過程中發(fā)生反應而得到的化合物。

4 討論

4.1? 分析方法的優(yōu)化

在優(yōu)化色譜條件時，分別考察了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水作為流動相梯度洗脫，結果表明，乙腈-0.1%甲酸水的分離效果更好，各成分峰形更佳，待測物離子化效率更高。此外，質(zhì)譜條件中比較了正、負離子檢測模式，發(fā)現(xiàn)負離子模式質(zhì)譜響應明顯優(yōu)于正離子模式，結合三萜皂苷類化合物的結構性質(zhì)，本實驗在負離子模式下進行檢測。

4.2? 竹節(jié)參炮制前后成分分析

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技術，根據(jù)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)快速識別竹節(jié)參及其炮制品中的主要化學成分，初步鑒定了竹節(jié)參中29種皂苷類成分，并結合鏡像對比分析，獲得不同炮制方法對竹節(jié)參皂苷類成分的影響。與竹節(jié)參生品相比，經(jīng)加熱炮制后竹節(jié)參中的化學成分發(fā)生了明顯變化。其中，蒸制品、烘制品化學成分數(shù)量較生品略有增多，炒制品與醋煮品化學成分數(shù)量較生品基本不變;各類炮制品色譜峰保留時間基本一致，但化合物響應強度各有不同;通過響應面積對比發(fā)現(xiàn)，蒸制法響應面積最低，其中不加輔料比加輔料更加明顯。竹節(jié)參經(jīng)炮制后新增5種成分，分別為葉三七皂苷F、人參皂苷Rg3、Rg6、F4、Rk1。竹節(jié)參經(jīng)過炮制后，與同科同屬的藥材經(jīng)過炮制后相關文獻報道[21]相同：人參皂苷類成分經(jīng)過水解反應生成了新的成分，猜測這可能與竹節(jié)參生品與加熱炮制品皂苷類成分抗氧化活性有關。

綜上所述，UPLC-Q-TOF/MS技術可高效、全面、系統(tǒng)地對竹節(jié)參炮制前后的化學成分進行快速定性研究，為進一步的研究民族藥物竹節(jié)參提供了新的實驗數(shù)據(jù)和方法，為其質(zhì)量控制水平的提升及其藥物資源的進一步開發(fā)及利用提供了科學依據(jù)。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2020年版.一部[S].2020：144-145.

[2] 周? 靜，付先蕓，蔡三金，等.竹節(jié)參的化學成分、藥理作用及質(zhì)量標志物（Q-marker）預測分析[J].中草藥，2021，52（9）：2819-2830.

[3] 王開元，詹志來，廖天月，等.竹節(jié)參的化學成分與藥理活性研究進展[J].中國野生植物資源，2021，40（5）：48-59.

[4] 魯?shù)劳?，朱國?土家族珍稀藥材神參（竹節(jié)參）的研究概況[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2008，14（5）：64-67.

[5] 張? 宏，谷偉玲.中藥炮制對其化學成分及臨床應用的作用探討[J].當代化工研究，2020（19）：167-168.

[6] 李華鵬，桑立紅，侯? 準，等.中藥酒制的研究概況[J].中藥材，2011，34（3）：478-481.

[7] 陳新梅，徐溢明.中藥醋制研究概況[J].化工時刊，2016，30（7）：32-34.

[8] 崔園園，周永峰，馬艷芹，等.基于UPLC-Q-TOF/MS法分析生、炙甘草中化學成分的差異性[J].中國藥房，2020，31（9）：1049-1053.

[9] 倪志濤，栗會靜，杜曉鳳，等.白術炮制歷史沿革研究[J].中國民族民間醫(yī)藥，2021，30（16）：23-28.

[10] 陳華師，楊克義，鄭芝鑾，等.醋蒸香附炮制工藝研究[J].中草藥，2013，44（19）：2693-2695.

[11] 吳建華，崔? 於.酒黃精飲片炮制工藝研究[J].陜西中醫(yī)，2011，32（11）：1542-1543.

[12] 王德珍，易? 駿，張? 翼，等.酒黃連、姜黃連、萸黃連最佳炮制工藝研究[J].中藥材，2013，36（1）：35-37.

[13] 於學良，顧瑤華，薛璟，等.丹參醋制工藝條件的研究[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2013，11（21）：107-109.

[14] 宋平順，楊樹聲，馬真金，等.酒制甘肅丹參的炮制工藝研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（5）：49-51.

[15] 盧君蓉，王世宇，傅超美，等.香附醋制工藝的優(yōu)化研究[J].成都中醫(yī)藥大學學報，2012，35（1）：60-62.

[16] 廖? 婉，傅? 舒，劉? 芳，等.星點設計-效應面法優(yōu)選蓬莪術醋制工藝[J].中藥與臨床，2011，2（6）：22-24.

[17] 陳佳麗，談夢霞，鄒立思，等.基于UFLC-triple TOF MS/MS技術分析竹節(jié)參中皂苷類成分[J].食品科學，2019，40（14）：249-258.

[18] WU W， LU Z Y， TENG Y R， et al. Structural characterization of ginsenosides from flower buds of Panax ginseng by RRLC-Q-TOF MS[J]. Journal of Chromatographic Science， 2016， 54（2）： 136-143.

[19] 黃仁嵩，王和宇，焦傳新，等.UHPLC-MS/MS法對人參和枸杞配伍中皂苷類成分定性和定量分析[J].中成藥，2021，43（9）：2412-2417.

[20] 傅? 俊.牛膝三萜皂苷類成分定性分析及其體內(nèi)外代謝初步研究[D].合肥：安徽中醫(yī)藥大學，2019.

[21] 呂重寧，路金才.人參皂苷在不同商品人參中的分布研究進展[J]. 中草藥，2021，52（17）：5329-5338.

（本文編輯? 蘇? 維）