CYP3A4、PXR和IL-10基因多態(tài)性對(duì)43名中國健康受試者空腹及餐后口服氨氯地平藥代動(dòng)力學(xué)特征的影響

劉林林 阿薩亞 劉建芳 陳 琳 劉 丹 謝宏波 劉名義 夏春華▲

1.南昌市洪都中醫(yī)院臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，江西南昌 330038；2.南昌大學(xué)臨床藥理研究所，江西南昌 330031；3.江西省皮膚病?？漆t(yī)院藥劑科，江西南昌 330000

氨氯地平選擇性抑制鈣離子跨膜進(jìn)入心肌細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞，有效降低血管收縮力，臨床廣泛用于治療高血壓和缺血性心臟病[1]。但氨氯地平的治療效果常具有明顯的個(gè)體差異[2]，藥物代謝酶的基因多態(tài)性常常被認(rèn)為是其重要影響因素之一。氨氯地平主要經(jīng)細(xì)胞色素P450 3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）酶進(jìn)行代謝[3]，它在不同個(gè)體中的表達(dá)水平以及酶活性也都顯示出明顯的種族異質(zhì)性和個(gè)體差異，極大地影響了治療結(jié)果[4-5]，常常導(dǎo)致治療失敗，甚至嚴(yán)重的藥物毒副作用。其本身的遺傳多態(tài)性是藥物代謝個(gè)體間差異的主要來源[6-8]。此外，孕烷X 受體（pregnane X receptor，PXR）的基因多態(tài)性也是導(dǎo)致CYP3A4 在不同人群中差異的重要因素之一[9-11]，而白介素-10（interleukin-10，IL-10）則有研究表明，在給予健康受試者IL-10 后，CYP3A4 的活性約降低12%[12]，表明CYP3A4 的基因多態(tài)性可直接影響或通過PXR 或IL-10 基因多態(tài)性改變CYP3A 酶系的活性，從而間接影響氨氯地平的藥代動(dòng)力學(xué)過程。本研究旨在探討CYP3A4、PXR 和IL-10 基因多態(tài)性對(duì)43 名中國健康受試者空腹及餐后單次口服氨氯地平藥代動(dòng)力學(xué)特征的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本臨床研究完成于2015年，并獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn){[2014]倫理審第（050）號(hào)}，所有受試者均在篩選前簽署知情同意書，共有43 名中國籍健康男性受試者入組此項(xiàng)研究，年齡18～40 歲，平均（23.1±1.6）歲；體重指數(shù)（body mass index，BMI）19～24 kg/m2，平均（21.4±1.7）kg/m2，所有受試者試驗(yàn)前經(jīng)一般體格檢查、詢問既往用藥史、實(shí)驗(yàn)室檢查（檢查項(xiàng)目包括血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能等）以及心電圖檢查，未發(fā)現(xiàn)異常，身體狀況良好，均無煙酒嗜好，在試驗(yàn)前2 周內(nèi)未服用過任何其他藥物。

1.2 方法

受試者按隨機(jī)數(shù)字表法分為空腹組和餐后組，分別在空腹?fàn)顟B(tài)和高脂高熱量飲食后30 min 單劑量交叉口服給予10 mg 苯磺酸氨氯地平片（北京天然藥物研究所平衡南洋制藥廠；生產(chǎn)批號(hào)：19-131104；規(guī)格：10 mg/片），分別于給藥前和給藥后2、4、5、6、7、8、10、12、24、48、72、96、120、144、168 h 共16 個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集4.0 ml 上肢靜脈血，分離取上層血漿樣品放置于-80℃冰箱冷凍避光保存，兩試驗(yàn)周期之間設(shè)兩周的清洗期。血樣中氨氯地平的濃度通過液相二級(jí)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）方法進(jìn)行測定。

1.3 基因分型

使用DNA 純化試劑盒（北京全式金）提取外周血基因組DNA，然后采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法對(duì)CYP3A4（13989A>G、15820C>G、17776Ainsertion）、PXR（24381A>C、3'UTR10719G>A、3'UTR11193T>C）和IL-10（1082G>A、819C>T、592C>A）進(jìn)行基因分型。PCR 反應(yīng)體系共25 μl，包含2×Easy Taq＠PCR SuperMix 12.5 μl，正向引物（10 μmol/L）0.5 μl，反向引物（10 μmol/L）0.5 μl，ddH2O 6.5 μl，基因組DNA 5 μl。PCR 反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，擴(kuò)增后的產(chǎn)物37℃消化2 h，PCR 最終產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳條帶分析。

1.4 血漿中氨氯地平的檢測

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Lunna-C18柱（50 mm×2.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：2 mmol/L 甲酸銨（PH3.0）:乙腈=65∶35（v/v）；流速：400 L/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子化方式：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI+）；監(jiān)測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；霧化器壓力（Gas1）：40 psi；離子化電壓：5500 V；檢測離子：m/z 409.1→238.0（氨氯地平）以及m/z 480.2→315.0（內(nèi)標(biāo)物尼卡地平）。

1.4.3 血漿樣品處理方法 有機(jī)溶劑液液萃取法。取200 μl 待測血漿，精密加入20 μl 內(nèi)標(biāo)（1.0 ng/ml）和20 μl 空白溶劑，再加入20 μl 氫氧化鈉溶液（1 mol/L），以及1000 μl 叔丁基甲醚，渦旋振蕩3 min，15 000 r/min離心5 min，離心半徑8.2 cm，分層，取上層清液850 μl置于濃縮揮干儀中45℃減壓干燥約20 min，殘?jiān)?00 μl 流動(dòng)相進(jìn)行復(fù)溶，渦旋振蕩3 min，20 000 r/min離心5 min，離心半徑8.2 cm，取上層清液100 μl 進(jìn)行分析測定。血漿中的氨氯地平在0.05～16.2 ng/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測方法無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，低、中、高濃度的提取回收率＞85%，批間、批內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度均符合要求[13]。

1.5 藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析

本研究中血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS 2.1 軟件以非房室模型對(duì)氨氯地平在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行估算分析，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)主要包括峰濃度（cmax），達(dá)峰時(shí)間（Tmax），半衰期（t1/2）和藥時(shí)曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 進(jìn)行χ2檢驗(yàn)判定各基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者的一般資料

空腹組最終完成試驗(yàn)的男性健康受試者22 名，年齡21～24 歲，平均（22.0±0.8）歲；身高162～178 cm，平均（169.9±4.4）cm；體重52.0～75.0 kg，平均（61.8±6.9）kg；體重指數(shù)19.0～23.9 kg/m2，平均（21.4±1.8）kg/m2。餐后組入組健康男性受試者22 名，最終完成試驗(yàn)者有21 名，年齡22～28 歲，平均（24.0±1.5）歲；身高168～180 cm，平均（171.6±4.1）cm；體重51.1～74.3 kg，平均（63.0±5.8）kg；體重指數(shù)19.2～24.0 kg/m2，平均（21.4±1.7）kg/m2。兩組受試者的年齡、身高、體重和BMI 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 43 名受試者的CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點(diǎn)基因分型結(jié)果

本研究通過PCR 方法對(duì)CYP3A4、PXR 和IL-10進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示CYP3A4 在17776 A insertion、15820C>G、13989A>G 位點(diǎn)的突變頻率分別為11.6%（5/43）、20.9%（9/43）、16.5%（7/43），PXR 在24381A>C、3'UTR11193T>C、3'UTR10719G>A 位點(diǎn)的突變頻率分別為27.9%（12/43）、25.5%（11/43）、18.6%（8/43），IL-10 在592C>A、819C>T、1082G>A 位點(diǎn)的突變頻率分別為18.6%（8/43）、23.2%（10/43）、11.6%（5/43）。對(duì)上述基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果均顯示P＞0.05，基因型符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，具有群體代表性。

2.3 43 名受試者CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)性分析

通過對(duì)CYP3A4、PXR、IL-10 三個(gè)基因突變的相互影響的關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果顯示IL-10 突變與PXR突變呈明顯相關(guān)性，其他基因之間關(guān)聯(lián)性不大（表1），IL-10 突變引起PXR 突變的概率為71.4%，不引起PXR 突變的概率為28.6%。

表1 43 名受試者CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)性分析[n（%）]

2.4 兩組藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較

CYP3A4、PXR 和IL-10 各基因突變位點(diǎn)對(duì)空腹及餐后口服氨氯地平的受試者體內(nèi)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（AUC0-∞、AUC0-t、t1/2或cmax）均無顯著影響（P＞0.05）（表2）?？崭菇M和餐后組的氨氯地平藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異結(jié)果顯示，餐后組的cmax、AUC0-t和AUC0-∞高于空腹組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表2 CYP3A4、PXR 和IL-10 各基因突變位點(diǎn)對(duì)口服氨氯地平的43名受試者體內(nèi)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（AUC0-∞、AUC0-t、t1/2 或cmax）影響的方差分析結(jié)果

表3 空腹組和餐后組口服給予10 mg 氨氯地平后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較（s）

表3 空腹組和餐后組口服給予10 mg 氨氯地平后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較（s）

與空腹組比較，aP＜0.05

空腹組餐后組43.40±9.32 42.75±7.57 4.18±0.73 5.17±1.83a 6.18±1.84 7.71±4.36 212.09±40.53 291.20±92.02a 228.57±52.37 313.21±103.47a組別 t1/2（h）cmax（ng/ml）Tmax（h）AUC0-t（ng·h/ml）AUC0-∞（ng·h/ml）

3 討論

氨氯地平是臨床上常用的降壓藥之一，在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟CYP3A4 酶系代謝，其療效在個(gè)體間存在顯著差異，可能與藥物代謝酶CYP3A4 的基因多態(tài)性有關(guān)。儲(chǔ)小曼等[14]發(fā)現(xiàn)CYP3A4*4、*5、*6 等位基因的存在可能降低藥物代謝酶CYP3A4 的活性，從而影響環(huán)孢素A 在體內(nèi)的代謝過程，CYP3A4*4、*5、*6 分別對(duì)應(yīng)13989A>G、15820C>G、17776 A insertion 三個(gè)突變位點(diǎn)。CYP3A4 受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中PXR 被認(rèn)為是最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，其基因多態(tài)性可能間接影響CYP3A4 的表達(dá)水平[11，15]。雖然在PXR 中發(fā)現(xiàn)了許多單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs），并且似乎影響PXR 功能，但是其對(duì)人類受試者中CYP3A4 表達(dá)的影響還未深入研究[10]。另一方面，IL-10 是一類抗炎細(xì)胞因子，影響基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，也能參與調(diào)節(jié)CYP3A4 的酶活性[16]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 存在的3 個(gè)SNPs，即1082G>A、819C>T和592C>A 可能與IL-10 表達(dá)降低相關(guān)[17]。因此，本研究探討CYP3A4-（Exon-917776A）、CYP3A4-（Exon7-15820C>G）、CYP3A4-（Exon5-13989A>G）；PXR-（Exon1-24381A>C）、PXR-（3'-UTR11193T>C）、PXR-（3'-UTR10719G>A）；IL-10-（592C>A），IL-10-（819C>T），IL-10-（1082G>A）9 個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)氨氯地平藥代動(dòng)力學(xué)特征的影響。

本研究結(jié)果顯示，三個(gè)CYP3A4 基因型、三個(gè)PXR 基因型和三個(gè)IL-10 基因型對(duì)氨氯地平在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無明顯影響（P＞0.05）。Guo 等[18]研究基因多態(tài)性因素對(duì)高血壓患者氨氯地平藥代動(dòng)力學(xué)過程的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)CYP3A4*1G 和CYP3A5*3 的基因多態(tài)性對(duì)氨氯地平血藥濃度無影響（P>0.05），與本研究在健康受試者中所獲得的結(jié)果相一致。在CYP3A4 所發(fā)現(xiàn)的39 個(gè)突變位點(diǎn)中，絕大多數(shù)位點(diǎn)的突變不會(huì)改變酶的活性，僅有少數(shù)位點(diǎn)上的突變能影響酶的活性[1]。本研究中未能觀察到CYP3A4、IL-10 和PXR 的基因突變體對(duì)氨氯地平藥代動(dòng)力學(xué)過程有明顯的作用，可能存在以下幾方面的原因：首先，本研究中選取突變位點(diǎn)對(duì)氨氯地平的藥代動(dòng)力學(xué)影響輕微，PXR 或IL-10 上可能存在著其他調(diào)控作用比較明顯的SNPs；其次，藥物代謝過程受到一些其他因素如年齡、身體生理狀況等的影響；最后，除了基因方面的影響，PXR對(duì)內(nèi)源性、外源性物質(zhì)的接觸也會(huì)影響CYP3A4 的表達(dá)。因此，需要進(jìn)一步探討更多的影響因子，為臨床指導(dǎo)CYP3A4 代謝底物合理應(yīng)用提供可靠的理論基礎(chǔ)。

另外，本研究對(duì)43 名受試者的CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點(diǎn)相關(guān)性進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，IL-10 和PXR 突變頻率呈明顯相關(guān)性，IL-10 的突變顯著增加PXR 突變的頻率，提示IL-10 可能通過作用于PXR 來調(diào)控CYP3A4 的表達(dá)。但是PXR 和CYP3A4 之間的突變無明顯的相關(guān)性，可能是因?yàn)樗x取PXR 和CYP3A4 的突變位點(diǎn)之間僅僅是弱相關(guān)，或者是本研究受試者數(shù)量不足導(dǎo)致的。

本研究還探討飲食因素對(duì)氨氯地平體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響，結(jié)果顯示，餐后組的cmax、AUC0-t和AUC0-∞高于空腹組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示高脂高熱量飲食可明顯增加口服途徑給予的氨氯地平的體內(nèi)血藥濃度及其暴露量。一般來說，食物容積、溫度以及食物中所含營養(yǎng)成分及其熱量均有可能改變胃腸道的內(nèi)環(huán)境，從而改變藥物在胃腸道停留的時(shí)間以及藥物在胃腸道液中的溶解度和滲透性，而高脂高熱量食物更能影響胃腸道的理化功能，從而更能改變藥物或制劑的生物利用度。飲食對(duì)氨氯地平血藥濃度的影響可能產(chǎn)生一些嚴(yán)重的后果，需要在臨床實(shí)踐使用過程中加以關(guān)注。

綜上所述，CYP3A4（17776 A insertion、15820C>G、13989A>G）、PXR（24381A>C、3'UTR11193T>C、3'UTR10719G>A）和IL-10（592C>A、819C>T、1082G>A）共9 個(gè)位點(diǎn)的突變體對(duì)43 名中國健康受試者體內(nèi)氨氯地平的藥代動(dòng)力學(xué)過程無顯著影響，但飲食因素可能會(huì)明顯提高氨氯地平在人體內(nèi)的吸收。