測序技術(shù)在葡萄與葡萄酒研究中的應(yīng)用

魏曉峰，李波廷，廖晨希，李賢哲，梁善杰，鞠延侖*，房玉林*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院/陜西省葡萄與葡萄酒工程研究中心，陜西 楊凌 712100）

DNA測序技術(shù)（DNA sequencing technology）是分子生物學(xué)發(fā)展歷程中一個重要轉(zhuǎn)折點，它能夠?qū)⒒蚪MDNA上的遺傳信息真實準(zhǔn)確地反映出來，讓我們了解到微生物、植物、動物及人類的全基因組序列，從而較全面地揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性。因此測序技術(shù)在當(dāng)今的科學(xué)研究中扮演著重要的角色，為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品安全等領(lǐng)域的科技進(jìn)步起到巨大的推動作用[1]。

DNA測序技術(shù)是指測定DNA序列的技術(shù)，即獲取DNA一級序列腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）四種堿基排列組合的方式。在分子生物學(xué)研究中，研究和改造目的基因的基礎(chǔ)是對DNA的序列分析。用于測序的技術(shù)主要有SANGER等發(fā)明的雙脫氧鏈終止法和MAXAM與GILBERT發(fā)明的化學(xué)降解法，目前“SANGER法”得到廣泛的應(yīng)用。同時DNA測序技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)由第一代測序技術(shù)發(fā)展為第二代測序技術(shù)，并逐步開始向第三代測序技術(shù)拓展[2]。

葡萄和葡萄酒與人們的生產(chǎn)生活密不可分，健康和誘人的口感及商業(yè)價值等實際需求促進(jìn)其發(fā)展。測序技術(shù)在葡萄與葡萄酒中的應(yīng)用和研究意義重大，目前已有的研究將測序技術(shù)與葡萄品種、葡萄種植環(huán)境、釀酒微生物及酒中芳香物質(zhì)[3-7]研究結(jié)合，取得顯著成果?，F(xiàn)就測序技術(shù)在葡萄與葡萄酒研究中的應(yīng)用情況進(jìn)行介紹，旨在促進(jìn)測序技術(shù)與食品科學(xué)研究的融會貫通及長遠(yuǎn)發(fā)展。

1 測序技術(shù)及其發(fā)展歷程

1.1 第一代DNA測序技術(shù)

第一代測序技術(shù)（SANGER法）是20世紀(jì)70年代中期由Fred Sanger及其同事首先發(fā)明。均一的單鏈DNA分子是一代DNA測序?qū)嶒灥钠鹗疾牧?，依次通過變性、退火、延伸三個階段，利用DNA聚合酶，通過堿基互補(bǔ)的原理得到DNA的堿基序列[1-5]。傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法以及由此衍生出的各種DNA測序技術(shù)均稱為第一代DNA測序技術(shù)，人類基因組計劃便是基于第一代測序技術(shù)而開展，目前的熒光自動測序儀的原理也基于此而誕生[6]。

1.2 第二代DNA測序技術(shù)

第二代測序技術(shù)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)克隆陣列[8]，進(jìn)行引物雜交和酶延伸反應(yīng)，每個延伸反應(yīng)所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測能同時進(jìn)行，從而獲得測序數(shù)據(jù)[9]。第二代測序技術(shù)的單次測序容量達(dá)到了幾十萬甚至幾百萬條，使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行[10]，因該技術(shù)具有良好的性價比，使其成為目前最常使用的高通量測序技術(shù)。

1.3 第三代DNA測序技術(shù)

第三代測序技術(shù)是指單分子測序技術(shù)，是以單分子測序為主要特征，實現(xiàn)對每一條DNA分子單獨測序。Pacific Bioscience的單分子實時測序（SMRT技術(shù)）、He-licos單分子測序儀和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔測序儀正朝著低成本、高通量、長讀取的方向發(fā)展[11]。第三代分子測序技術(shù)的顯著特點是不依賴二代測序中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，基于邊合成邊測序的思路，每次測序只加入一種脫氧核糖核苷酸，隨后將未參與合成的DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）洗脫，直接對Cy3成像并觀測熒光信號，然后化學(xué)裂解核苷酸上的燃料并釋放加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進(jìn)行下一輪反應(yīng)[12-13]。第三代測序技術(shù)對于堿基的測定準(zhǔn)確率較高，可達(dá)90%左右。因此，隨著生物信息算法的逐漸完善，第三代測序技術(shù)有望很快投入市場。

2 測序技術(shù)在葡萄與葡萄酒領(lǐng)域的應(yīng)用

葡萄是世界上最古老的果樹樹種之一，被譽(yù)為世界4大水果之一，可用于生食、制干及釀酒等。在葡萄種植到加工過程中經(jīng)過多道環(huán)節(jié)，每一環(huán)節(jié)不同機(jī)制均會影響葡萄及其加工產(chǎn)品品質(zhì)。如種植環(huán)境中土壤水分[14]相對含量高低；土壤微生物對葡萄品質(zhì)的影響[15-18]；葡萄生長過程中低溫對葡萄代謝功能的影響[19-20]；以及葡萄采摘后保鮮技術(shù)等。測序技術(shù)在葡萄與葡萄酒的研究中也有較為廣泛的運用。

2.1 測序技術(shù)在葡萄中的應(yīng)用

2.1.1 葡萄種植環(huán)境研究中的應(yīng)用

葡萄種植土壤的綜合性質(zhì)對葡萄品質(zhì)有很大影響，以土壤中微生物的多樣性和分布規(guī)律、土壤中相對含水量及耕作方式三個方面進(jìn)行探討，闡明測序技術(shù)在分析土壤微生物中的優(yōu)勢。

史芳芳等[15]為了解新疆兵團(tuán)十二師不同葡萄種植區(qū)根基土壤真菌群落多樣性，以新疆6個不同區(qū)域葡萄根基土壤樣品為試驗材料，對土壤真菌18s RNA V2區(qū)進(jìn)行高通量測序，結(jié)果表明同一產(chǎn)區(qū)不同區(qū)域之間土壤微生物含量大不相同，且具有多樣性。魏玉潔等[18]通過高通量測序技術(shù)證明無論是真菌還是細(xì)菌，在土壤中的種類最為復(fù)雜、數(shù)量最多，其次是葡萄葉片和釀酒葡萄。宋雪潔等[17]對不同土層細(xì)菌16s rDNA進(jìn)行高通量測序，表明從10～70 cm土層的微生物數(shù)量逐漸減少。王曉雯[16]通過Illumina Hiseq高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）為優(yōu)勢細(xì)菌類群，子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為優(yōu)勢真菌類群。這兩組實驗均說明不同土壤深度之間微生物仍具有多樣性和結(jié)構(gòu)差異，且微生物種群的分布同樣有規(guī)律可循。在土壤相對含水量對葡萄果實作用機(jī)制方面，李倩等[14]通過對轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)耐寥浪繒岣哚劸破咸选奔t’‘北玫’PAL及CHS等基因表達(dá)量。測序技術(shù)為土壤微生物的多樣性，分布等研究提供便利。

2.1.2 葡萄品種研究中的應(yīng)用

不僅土壤中富含微生物，葡萄果皮表面也富集微生物，因此測序技術(shù)在分析葡萄表皮微生物多樣性方面也有建樹。葡萄品種改良[21]、香氣物質(zhì)及其性狀分析及果實內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的合成機(jī)制都可以用測序技術(shù)為其研究提供幫助。

葡萄酒的釀造是多種微生物參與代謝的過程。作為葡萄酒原料，釀酒葡萄自身攜帶的微生物理所當(dāng)然成檢驗對象。張世偉等[22-23]應(yīng)用高通量測序技術(shù)，分析沙城地區(qū)不同品種釀酒葡萄表皮的微生物群落，發(fā)現(xiàn)‘雷司令’的真菌及細(xì)菌豐富度均為最大，由此推測釀酒葡萄上的微生物會對植株、果實及葡萄酒釀造產(chǎn)生諸多的影響。在葡萄香氣研究中，孫婷等[24]采用全基因組重測序技術(shù)構(gòu)建‘紅地球’與‘著色香’葡萄的高密度遺傳圖譜，對草莓香型葡萄特征香氣物質(zhì)進(jìn)行數(shù)量性狀位點（QTL）定位研究。程程等[25]結(jié)合基因重組測序進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了一些與葡萄果實揮發(fā)性香氣物質(zhì)相關(guān)的候選基因及單核苷酸多態(tài)性（SNP）定位。而劉翠霞等[26]則對玫瑰香香味進(jìn)行了研究，采用測序基因分型（GBS）簡化基因組測序技術(shù)，分別構(gòu)建‘北豐’和‘3-34’品種的高密度遺傳圖譜，對玫瑰香味性狀進(jìn)行QTL定位，結(jié)合RNA-seq技術(shù)，初步篩選出與玫瑰香香味物質(zhì)合成有關(guān)的候選基因。由此可見，測序技術(shù)可為選育具有特定風(fēng)味的葡萄品種研究提供有效途徑。

同時，外部環(huán)境對葡萄生理代謝的影響、破眠劑處理方式對果實發(fā)育的影響等方面也可應(yīng)用測序技術(shù)。梁國平等[19]通過研究抗寒性較強(qiáng)的山葡萄，對其在不同溫度環(huán)境下的5個時期做了轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)v-myb禽成髓細(xì)胞病病毒癌基因同源物（MYB）轉(zhuǎn)錄因子富集到的差異基因數(shù)量最多，其次是基本螺旋環(huán)螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子，而富集到最少的轉(zhuǎn)錄因子為維管植物單鋅指（VOZ）和LEAFY（LFY）。張博等[20]在低溫脅迫處理后不同時間點進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序后發(fā)現(xiàn)，同一品種在低溫脅迫下，時間越長與對照組差異基因越多。

在破眠劑處理方式對葡萄影響的研究中，劉芳等[27]以當(dāng)年生‘夏黑’葡萄枝條的單芽枝段為試材，取2.5%單氰胺處理15 d的休眠芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)差異基因主要集中于光合作用、淀粉與蔗糖代謝、脂肪酸代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙素生物合成等作用通路。此外，測序技術(shù)在其他方面也有廣泛應(yīng)用，如在遺傳及品種培育方面，李貝貝等[21]利用簡化基因組測序技術(shù)，開發(fā)出大量可用于群體遺傳分析的SNP標(biāo)記，為后期進(jìn)一步研究葡萄起源進(jìn)化提供參考。

2.1.3 葡萄常見病害及保鮮研究中的應(yīng)用

在葡萄生長發(fā)育過程中會遇到病害的侵?jǐn)_，分析病害并提前預(yù)防，發(fā)現(xiàn)病害及時救治變得緊急而重要。在病毒多樣性及其檢測[28]、病毒產(chǎn)生機(jī)制及其影響等方面，測序技術(shù)都做出重要貢獻(xiàn)，同時，基于測序技術(shù)研究的葡萄保鮮技術(shù)也愈加成熟。

中國報道的葡萄病毒病已有14種，葡萄病毒病的發(fā)生嚴(yán)重影響我國葡萄產(chǎn)業(yè)以及一系列延伸產(chǎn)業(yè)，所以對葡萄病毒病的認(rèn)識和防治顯得尤為重要。張向昆等[29]對秦皇島產(chǎn)區(qū)葡萄卷葉病毒3（GLRaV-3）和灰比諾病毒的分離物進(jìn)行基因序列分析，結(jié)果表明GLRaV3-QHD分離株與已報道分離株的HSP70基因核苷酸序列同源性在96.3%～99.3%；GPGV3-QHD分離株與已報道分離株的MP基因核苷酸序列同源性在93.3%～98.4%。于翠等[30]利用小RNA深度測序技術(shù)從新疆葡萄上檢測出8種病毒。李斯琪等[31]以葡萄花葉病毒為研究對象，利用siRNA測序和RNAseq高通量測序明確該病害病原物種及分子類型，并對其分子特性進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明葡萄花葉病害由6種病毒復(fù)合侵染導(dǎo)致。在病毒產(chǎn)生機(jī)制及其影響方面，彭軍波等[32]通過高通量測序技術(shù)，揭示葡萄潰瘍病菌引起對葡萄的侵染適應(yīng)性和葡萄-潰瘍病菌互作的組學(xué)基礎(chǔ)。

張眉等[33]對葡萄霜霉病進(jìn)行遺傳特性的研究發(fā)現(xiàn)，有些地方菌株親緣關(guān)系十分密切，而有些菌株卻未體現(xiàn)親緣性。在葡萄病害抑制方面，馮嬌等[34]發(fā)現(xiàn)赤霉素和氯吡脲顯著抑制苯丙烷及類黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而降低果銹生成路徑中相關(guān)酶的活性，從而抑制葡萄果銹的生成。殷向靜等[35]運用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對‘通化3號’和塘尾葡萄果實葡萄白藜蘆醇含量差異的分子機(jī)理研究，表明不同芪合成酶基因啟動子中含有的順式作用元件的種類和分布不同，對不同激素處理的響應(yīng)也有差別，進(jìn)而導(dǎo)致芪合成酶基因產(chǎn)生有差異的表達(dá)模式。

2.2 釀酒微生物及發(fā)酵過程研究中的應(yīng)用

葡萄酒發(fā)酵的過程是一個多種微生物共同作用的過程，并涉及多個環(huán)節(jié)，其產(chǎn)品具有極高的飲用和商業(yè)價值。測序技術(shù)的運用對于釀酒微生物、葡萄酒發(fā)酵過程以及成品口感等方面的研究具有重要意義[36-37]。

2.2.1 釀酒微生物測序及選育

釀酒微生物種類繁多，除了有益于葡萄酒釀造的微生物，也有如布氏菌（Brettanomyces bruxellensis）等易引起葡萄酒變質(zhì)的細(xì)菌。Megan等[38]對一批布氏菌感染的葡萄酒進(jìn)行基因組測序，鑒定大約3000個基因，其產(chǎn)物平均49%的氨基酸與釀酒酵母原生質(zhì)一致，由此可以推測病菌的生長來源。選擇優(yōu)良釀酒微生物對葡萄酒品質(zhì)的提升大有作為。魏玉潔[39]等對新疆3個產(chǎn)區(qū)的土壤、葡萄果實和葉片、葡萄汁及葡萄酒進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)葡萄園地理位置不同，微生物的多樣性也存在差異。由以上研究可見，測序技術(shù)在探明釀酒微生物多樣性、作用機(jī)制以及選育方面具有重要意義，為辨別有益無益菌株，優(yōu)質(zhì)釀酒微生物的篩選等工作提供極大地幫助。

2.2.2 釀酒微生物的影響因素研究

外界影響因素如低溫及施藥均會對釀酒微生物產(chǎn)生影響。葡萄低溫發(fā)酵作為現(xiàn)代葡萄酒創(chuàng)新工藝，其優(yōu)點在于能優(yōu)化葡萄酒品種，豐富葡萄酒香氣。但較低的溫度會影響葡萄酒的正常發(fā)酵，所以對釀酒酵母的低溫耐受性研究具有重要意義。馮莉等[40]以我國本土釀酒酵母為研究對象，利用全基因組測序技術(shù)與分離群體分組分析（BSA）相結(jié)合的QTL定位等方法，發(fā)現(xiàn)NAT1和YOR365C是影響釀酒酵母低溫耐受性的主要基因。其中NAT1基因與蛋白質(zhì)的乙酰化修飾過程有關(guān)，YOR365C參與細(xì)胞壁的合成。此外，化學(xué)農(nóng)藥的使用也會對自然發(fā)酵葡萄酒中的酵母菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的影響，許維娜等[41]采用分離培養(yǎng)、常規(guī)分子生物學(xué)鑒定和Illumina MiSeq宏基因組測序結(jié)合的方法研究發(fā)現(xiàn)，未使用內(nèi)吸收性化學(xué)農(nóng)藥的葡萄樣品自然發(fā)酵液中鑒定出的酵母菌高于使用常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥的葡萄樣品自然發(fā)酵液。

2.2.3 發(fā)酵方式及處理過程的研究及應(yīng)用

不同的發(fā)酵方式會對葡萄酒中微生物的多樣性、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其中的化學(xué)成分產(chǎn)生影響，同時不同階段的處理方式也會對葡萄酒的品質(zhì)產(chǎn)生影響，利用測序技術(shù)可以更好地分析控制其中的各個環(huán)節(jié)[7,42]。董畫等[43]以吉林長白山地區(qū)山葡萄為試材，利用高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵和控制發(fā)酵在主發(fā)酵階段差異微生物為酵母屬和孢漢遜酵母屬，后發(fā)酵階段還有擲孢酵母屬。

代晨曦等[44]以石河子張裕巴保男爵酒莊的‘赤霞珠’葡萄為原料，在蘋果酸-乳酸發(fā)酵開始后取不同時間點的樣品進(jìn)行高通量測序以分析發(fā)酵過程中乳酸菌的多樣性，結(jié)果共檢出594種不同屬微生物，并經(jīng)過α、β多樣性分析，結(jié)果表明，不同時間點、細(xì)菌群豐富度和多樣性不同，且與起始期相比差異較大。而在目前葡萄酒生產(chǎn)中啟動并主導(dǎo)完成蘋果酸-乳酸發(fā)酵的主要微生物是酒酒球菌，對其自身基因、基因轉(zhuǎn)化表達(dá)及多樣性的研究均具有極高的價值[45-46]。

3 總結(jié)及展望

隨著DNA檢測技術(shù)的不斷更新?lián)Q代，檢測技術(shù)由難到易，由繁雜到簡易，從低通量到高通量測序，從PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA片段到單分子邊合成邊測序。測序技術(shù)有了跨時代的改變，逐漸降低的成本費用使先進(jìn)技術(shù)更容易應(yīng)用推廣。

總結(jié)測序技術(shù)的發(fā)展及其在葡萄和葡萄酒領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，旨在為相關(guān)研究人員提供借鑒，加強(qiáng)對測序技術(shù)的認(rèn)識，并期望能對今后的研究有所啟發(fā)。未來應(yīng)該注重以下幾個方面的研究：（1）通過基因的核酸序列，鑒定新的基因，為相應(yīng)的蛋白序列及功能研究提供捷徑；（2）通過測序技術(shù)獲得更多的基因多態(tài)性等信息，繪制遺傳圖譜，使進(jìn)化關(guān)系的理解更為透徹，從而促進(jìn)了對生物多樣性的研究；（3）通過高通量測序技術(shù)提高實驗技術(shù)的準(zhǔn)確性。