腫瘤干細胞與肺癌耐藥的相關性

唐 琴 劉 珊 沈紅梅

(云南省腫瘤醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 中西醫(yī)結合科， 云南 昆明 650118)

據統計肺癌發(fā)病率占腫瘤總發(fā)病率的11.6%，肺癌死亡人數占腫瘤總死亡人數的18.4%[1]。大多數患者發(fā)現時已處于中晚期，部分患者已失去手術機會，另一部分患者手術后仍需化療或靶向治療以延長生存期和提高生活質量。盡管放化療及靶向治療在中晚期肺癌治療中取得很大進展，但其5年生存率仍不理想(<15%)，腫瘤耐藥性已被認為是肺癌治療成功與否的關鍵因素[2]。越來越多強有力的證據支持肝癌、結腸癌、肺癌及多種腫瘤的腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)與治療耐藥性相關，有實驗表明CSCs與其他腫瘤細胞相比對化療的耐藥性更強[3]。CSCs主要通過延長端粒、經歷上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)及改變信號通路等方式促進肺癌耐藥。本文依據國內外對腫瘤干細胞在肺癌耐藥的最新研究進展，就肺癌干細胞耐藥相關標志物及其作用機制作一綜述。

1 CSCs概述

CSCs是存在于腫瘤中具有干細胞性質的一小部分細胞群體。干細胞具有高度自我更新能力、自我繁殖和多向分化潛能，其主要功能是控制和維持細胞再生。根據干細胞的發(fā)育階段，可以分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞具有發(fā)育全能型，可以分化為機體各種類型的細胞，成體干細胞具有自我更新能力，通常只能分化為機體特定類型的細胞。CSCs同樣具有干細胞特性，可自我更新并分化為異質性腫瘤細胞，CSCs的水平與肺癌患者死亡率增高具有相關性[4]。CSCs不僅具有逃避免疫監(jiān)視和抗凋亡的能力，在治療過程中還可獲得藥物耐受性。雖然化療及靶向治療可以殺滅大量腫瘤細胞，但CSCs可以在血液中存活，隨著CSCs在整個身體中傳播，可以遠離原發(fā)腫瘤而選擇合適的腫瘤微環(huán)境繼續(xù)生長[5]。CSCs是各種惡性腫瘤常規(guī)治療失敗的重要原因。因此，在治療過程中不僅要通過手術治療、化療以及放療等方式清除原發(fā)腫瘤組織及細胞，還需進一步干預CSCs介導的耐藥性。

2 腫瘤干細胞相關標記物

腫瘤干細胞參與腫瘤的復發(fā)、轉移及耐藥等多個過程。因此，準確的檢測出CSCs標志物對腫瘤后續(xù)治療和評估預后具有指導作用。迄今為止，已經鑒定出多個存在肺CSCs細胞表面或在細胞內表達的標記物，如醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)、CD133、CD44、CD166、CD90，其中最主要的標記物包括ALDH、 CD133、CD44[6]。

2.1 ALDH

ALDH是一組在腫瘤細胞中過表達且具有排毒作用的胞質同工酶，ALDH在多種實體腫瘤中被證實其表達增加與不良預后、腫瘤干性和耐藥性有關[7]。ALDH1是其家族成員之一，近年來ALDH1已被認為是多種實體腫瘤(包括肺癌、結腸癌、乳腺癌等)CSCs的重要標志物。目前臨床所用的多數化療藥物(包括順鉑、環(huán)磷酰胺等)是經由ALDH1代謝。有學者發(fā)現，將少量的ALDH1陽性肺癌細胞注射入裸鼠時，它們具有啟動腫瘤生長并產生異源性腫瘤的能力；然而，ALDH1陰性肺癌細胞沒有顯示出這種能力，這表明ALDH1陽性細胞可能具有自我更新能力，并分化出一個細胞群；此外，ALDH1陽性細胞對化療藥物具有高度耐藥性，而ALDH1陰性細胞對這些藥物不耐受[8]。既往研究從肺癌細胞系中分離出ALDH1陽性細胞，發(fā)現其具有體外自我更新、分化和多藥耐藥性等重要的CSCs特性；此外，比較了三個不同肺癌患者人群中ALDH1的表達，發(fā)現ALDH1的高表達與患者的生存率呈負相關[9]。同時，在肺癌術后患者中，ALDH1陽性患者較陰性患者5年生存率明顯降低[10]。這表明ALDH不僅可以作為CSCs標志物，也可以作為預測患者預后的重要指標。

2.2 CD133

CD133抗原也被稱為prominin 1，是一種120 kDa的5次跨膜蛋白，由prom1基因編碼，CD133基因啟動子區(qū)域的DNA異常甲基化與腫瘤中CD133的異常表達有關[11]。目前CD133被認為是乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌等多種實體腫瘤CSCs亞群的標記物[12]。靈芝小孢子蛋白(ganoderma microsporum, GMI)在抑制CD133的同時可以降低肺癌干性相關轉錄因子的表達并抑制肺癌細胞活力和球體形成能力[13]。CD133陽性細胞通過高表達ATP結合盒轉運體G5(ATP-binding cassette transporter G5，ABCG5)和FADD樣抑制蛋白(FADD-like inhibitor protein，FLIP)來增強對化療和凋亡的抵抗[14]。Bertolini等[15]發(fā)現，與正常肺組織相比，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NCSLC)中的CD133陽性細胞群增加，并且在重癥聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency mice, SCID)小鼠中具有更高的致瘤潛力，并且干性基因表達、粘附性、運動性和藥物外排率比CD133陰性細胞更高。使用含鉑方案治療NCSLC患者時發(fā)現，CD133的高表達與無進展生存期較短相關[15], 表明CD133可作為NSCLC患者的預后指標。

2.3 CD44

CD44是細胞的一種跨膜糖蛋白，參與細胞生長、存活、分化和運動過程，同時，CD44和P-糖蛋白共同介導細胞多重耐藥。CD44作為CSCs標記物，在調節(jié)腫瘤發(fā)生、自我更新、轉移和治療抵抗方面發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現，高表達CD44亞群的肺癌細胞與CD44低表達組相比，具有更高的致瘤能力、腫瘤球形成能力和遷移特性[16]。用特定方法將腺癌模型中的A549細胞分為三陽性(EpCAM+/CD166+/CD44+)和三陰性(EpCAM-/CD166-/CD44-)亞群，發(fā)現三陽性亞群顯示出更高的增殖活性、更好的克隆形成性，并且具有更強的球體形成能力，這表明其具有更好的自我更新能力；同時還可觀察到在三陽性亞群中具有較高的5-氟尿嘧啶和順鉑耐藥性[17]。Leung等[18]將NSCLC患者腫瘤細胞種植在裸鼠體內發(fā)現，無論是原始CD44陽性細胞還是剛分化出來的CD44陽性細胞，與CD44陰性細胞相比，都可表達OCT4/POU5F1、NANOG、SOX2等多能干基因；此外，剛篩選出來的CD44陽性細胞比CD44陰性細胞對順鉑的耐受性更強，凋亡水平更低。因此，CD44可以作為篩選CSCs的可靠標志物。

3 CSCs的耐藥機制

3.1 CSCs端粒酶活性增高

端粒由重復的富G序列和大量相關蛋白組成，這些蛋白形成保護染色體末端的有效帽。端粒的長短和穩(wěn)定性決定了細胞壽命，并與細胞衰老和癌變密切相關。端粒酶也稱為端粒末端轉移酶，是一種核糖核蛋白復合物，可延長端粒DNA重復序列以延長端粒。它通過延長端粒末端從而賦予細胞無限增殖的能力，在大多數腫瘤中很容易檢測到端粒酶活性，但在體細胞組織中卻不能，由此可見端粒酶活性對于干細胞的完整性和壽命至關重要[19]。已有多項研究表明，端粒長度的增加可賦予CSCs對多種抗腫瘤療法的抵抗力。相反，端粒長度的縮短與藥物敏感性有關[20]。肺癌干細胞顯示出比非CSCs具有更長的端粒。無論是在體外還是體內，使用特定的端粒酶催化活性的小分子抑制劑2-[(E)-3-nataltalen-2-yl-but-2-enoylamino]-苯甲酸(BIBR1532)處理腫瘤干細胞，發(fā)現端粒漸進縮短，增殖能力降低以及對化學敏感性增加，對BIBR1532不敏感的細胞或從端粒酶抑制作用釋放的細胞未顯示出生長能力或藥物敏感性的變化[21]。同樣，使用端粒酶抑制劑對肺癌患者具有良好抗腫瘤效應，另外端粒酶抑制劑短期治療對腫瘤干細胞具有逆轉作用[22,23]。調節(jié)端粒酶活性是一個復雜而動態(tài)的過程，其與細胞周期調節(jié)緊密相關。因此，需進一步研究來幫助我們增進對該領域的了解。

3.2 CSCs經歷EMT過程

EMT使腫瘤細胞在獲得干性的同時失去極性，從而獲得運動能力。在腫瘤形成過程中，EMT賦予腫瘤細胞更強的腫瘤啟動、轉移潛能及藥物抵抗能力[24]。有研究顯示，EMT發(fā)生或EMT轉錄因子(transcription factors，TFs)的激活賦予癌細胞干樣特征[25]。Twist1是調控EMT過程的重要轉錄因子，增強Twist1的表達可以促進EMT、癌細胞遷移和腫瘤干細胞特征(包括多能性因子的表達，腫瘤球體形成的能力和干細胞表面標志物的表達增加)，這說明EMT和腫瘤細胞獲得干性是存在聯系的[26]。因此我們認為，部分CSCs可能經歷EMT過程，并獲得侵襲、轉移及耐藥的能力，這可能是引起治療療效不佳的主要因素。然而，Chen等[27]和Tiran等[28]在肺癌中發(fā)現，上皮表型CSCs比間質表型CSCs具有更高的腫瘤形成能力和化學抗性。這一觀點的提出，對間質型CSCs引起腫瘤啟動和藥物治療抵抗模型來說是一個巨大挑戰(zhàn)，還需要進一步的研究來證實這一觀點。

3.3 CSCs信號通路轉導異常激活

3.3.1 Wnt/β-Catenin信號通路

Wnt主要包含3條信號通路，其中最具代表性的Wnt/β-Catenin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。Wnt/β-catenin是一種進化保守的信號轉導途徑，它主要參與細胞的增殖、存活、運動、分化和凋亡等過程。氯化白屈菜堿是一種苯并菲啶生物堿，可以通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路從而抑制肺癌干細胞侵襲、轉移及球體形成能力[29]。伊曲康唑在體外通過抑制Wnt信號傳導，改變肺癌干性特征，但不影響細胞生存力，這表明伊曲康唑可能成為抑制肺CSCs的一個靶向藥物[30]。在體外激活肺癌細胞Wnt/β-Catenin途徑，再用不同濃度順鉑處理A549細胞，發(fā)現細胞的耐藥性均有不同程度的增強，并且CSCs相關標志物表達上調[31]。有研究發(fā)現，在高表達Oct4和Nanog且對吉非替尼耐藥的兩個肺癌細胞系中，β-catenin染色明顯，且Wnt信號通路相關mRNA及蛋白過表達，細胞經歷EMT過程，這說明激活Wnt/β-Catenin通路可使肺CSCs獲得耐藥性，并促進腫瘤細胞發(fā)生EMT[32]。

3.3.2 Hedgehog信號通路

Hedgehog(Hh)信號通路在人類胚胎形成的早期，器官發(fā)育過程中被生理激活，而異常激活可導致各種腫瘤的發(fā)生[33]。最早在造血系統惡性腫瘤中發(fā)現Hh途徑對維持CSCs特性至關重要，隨后在各種實體瘤中也得到同樣結果。Hh通路被過度激活，肺成纖維細胞表達間充質干細胞標志物，并獲得分化能力和免疫抑制潛能。ATP結合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉運蛋白，是一種膜轉運蛋白，由ATP水解供能將結構上不相關的小分子(例如環(huán)磷酰胺、順鉑等)向細胞外排出。正常干細胞和肺癌CSCs中ABC轉運蛋白表達升高，化療藥物從胞內排出，從而降低藥物療效[34,35]。

Hh途徑可通過上調ABC轉運蛋白以及發(fā)生EMT從而使腫瘤細胞對鉑類耐藥，然而抑制Hh途徑能夠增加細胞對鉑類藥物的敏感性，并降低CSCs表型的表達[36,37]。在體外肺癌細胞模型中，miR-182-5p可通過下調Hh途徑的轉錄蛋白，即神經膠質瘤相關癌基因同源蛋白(glioma-associated oncogene homolog，GLI)來增加細胞對順鉑的敏感性[38]。研究表明，SHH信號通路的成分在耐吉非替尼的具有干細胞特性的PC9GT細胞中高度表達，然而抑制SHH途徑可逆轉PC9GT對吉非替尼的耐藥性[39]。Sox2為胚胎干細胞轉錄因子，對維持肺腺癌CSCs的自我更新尤為重要。調節(jié)Hh通路抑制Sox2的表達，不僅可以減低肺癌CSCs的自我更新能力和細胞活力，還可以增加肺癌CSCs對順鉑和吉非替尼的敏感性[40]。

由此可見，Hh通路在肺癌干性及耐藥性的維持中發(fā)揮至關重要的作用，Hh可以作為肺癌的潛在干預靶點。

3.3.3 Notch信號通路

Notch是高度保守的信號傳導通路，介導細胞分化、增殖、存活和凋亡[41]。最近研究表明，miRNA在調控CSCs特性中起關鍵作用。Jiang等[42]發(fā)現，miR-1275可通過激活Notch信號，增強肺腺癌細胞的干性；拮抗miR-1275或抑制Notch通路可有效逆轉miR-1275誘導的通路共激活和干性特征。高Nocth活性的肺腺癌細胞亞群在血清中培養(yǎng)或連續(xù)異代種植發(fā)現，該細胞亞群不僅可形成腫瘤球，還能產生異質細胞群；而阻斷Notch信號通路則使該細胞亞群喪失上述能力；用化療藥物分別作用于高Nocth活性和低Nocth活性的肺腺癌細胞后，低Nocth活性的細胞活力降低，提示高Nocth活性的細胞具有更強的化學抗藥性[43]。上述結果表明，Notch信號的異常激活可以增強肺CSCs特性，增加耐藥性，導致預后不良。

4 總結及展望

化療及靶向治療，可與手術、放療等治療方式相互配合以延長肺癌患者的生命。如何增加肺癌細胞對藥物敏感性，以及尋找新的治療靶點已成為當前研究的熱點。近年來多項研究表明，肺CSCs通過延長端粒、上皮間質轉化、異常激活信號通路以及表達抗藥性蛋白等方式在藥物抵抗中發(fā)揮重要作用。目前臨床上針對肺CSCs的特異性藥物尚有待開發(fā)，相信隨著對CSCs標志物和耐藥機制不斷深入了解，研發(fā)針對CSCs的藥物有望成為治療肺癌和逆轉肺癌抗藥性的新方向。