基于黃水酯化產(chǎn)酯酵母的篩選

陳雪玲 蘭小艷 廖誠 陳惠

摘要 為得到可用于黃水酯化的產(chǎn)酯酵母，以四大酯為評價指標(biāo)，將分離自濃香型白酒產(chǎn)區(qū)的17株酵母先通過改良酸醇酯化體系進行產(chǎn)酯能力初篩，再將初篩得到的7株酵母應(yīng)用于黃水酯化進行復(fù)篩。結(jié)果表明：在改良酸醇酯化體系中有16株酵母能促進己酸乙酯合成，有7株與對照差異顯著;7株酵母均能提高黃水己酸乙酯，其中H1Y-24與對照差異極顯著，并且能降低乳酸乙酯，使酯化液四大酯量比關(guān)系更加協(xié)調(diào)。

關(guān)鍵詞 黃水;酵母;產(chǎn)酯能力;己酸乙酯

中圖分類號 TS 261.9? 文獻標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）21-0174-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.044

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Screening of Ester-producing Yeast in Yellow Water Esterification

CHEN Xue-ling? LAN Xiao-yan? LIAO Cheng2 et al

（1.Yibin Vocational and Technical College， Yibin， Sichuan 644003; 2.Nanguang Primary School in Xuzhou District of Yibin City， Yibin， Sichuan 644000）

Abstract In order to obtain ester producing yeast for yellow water esterification，four esters were used as evaluation indexes， seventeen strains of yeast isolated from Luzhou flavor liquor producing areas were screened for ester production capacity through improved acid alcohol esterification system，then the seven yeast strains were used in yellow water esterification for rescreening. The results showed that in the improved acid alcohol esterification system， 16 strains of yeast could promote the synthesis of ethyl caproate， and 7 strains were significantly different from the control. The results showed that all the seven yeast strains could increase ethyl hexanoate in yellow water， and the difference between H1Y-24 and the control was significant， and could reduce ethyl lactate and higher alcohols， making the relationship between the four ester ratio of esterification liquid more harmonious.

Key words Yellow serofluid;Yeast;Ester production capacity;Ethyl hexanoate

基金項目 宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級一般項目（ZRKY21YB-1 ZRKY21YB-10）;宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級重點項目（ybzysc20-01）。

作者簡介 陳雪玲（1985—），女，四川安岳人，講師，碩士，從事微生物發(fā)酵研究。

收稿日期 2021-01-28;修回日期 2021-05-28

黃水是濃香型白酒釀造過程特有的副產(chǎn)物，其產(chǎn)量大，物質(zhì)豐富，直接排放將造成資源浪費及環(huán)境污染[1]。向黃水中添加產(chǎn)香微生物將其發(fā)酵為黃水酯化液用于白酒生產(chǎn)，是目前黃水資源再利用的主要手段[2]?，F(xiàn)有研究表明，白酒企業(yè)目前所用黃水酯化體系較為復(fù)雜，一般有大曲、酯化酶、窖泥、酒尾等物質(zhì)，導(dǎo)致酯化結(jié)果重現(xiàn)性差，且酯化時間較長，設(shè)備利用率低[3]。

該研究將分離篩選自宜賓白酒產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)香酵母制成麩曲粗酶制劑，以己酸乙酯生成量為主，其他風(fēng)味物質(zhì)為輔作檢測指標(biāo)，先通過改良的混酸醇酯化體系進行酯化力初篩，再將篩選所得的酵母應(yīng)用于黃水酯化力篩選，以期得到可應(yīng)用于黃水生香的潛在酵母，同時為濃香型白酒企業(yè)制備黃水酯化液提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麩皮，購自宜賓某面粉加工廠;黃水，采自宜賓某濃香型白酒企業(yè);供試酵母（表1），保存于固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室。

氣相色譜儀、頂空進樣器（美國安捷倫公司）;LZP-930毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm）（鄭州譜析公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種制備。

酵母菌懸液制備：斜面菌種經(jīng)YPD液體培養(yǎng)基活化、擴培后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酵母麩曲的制備。

麩皮與水1∶1拌勻，121 ℃滅菌30 min，按5%接種量接種菌懸液，置28 ℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束后于35 ℃干燥烘箱4 h，備用。

1.2.3 酵母麩曲在混酸體系中產(chǎn)酯能力評價。

5 g麩曲與100 mL（含四大酸各0.25 mL、無水乙醇10 mL）混合酸醇水溶液于150 mL三角瓶中，在35 ℃下酯化100 h后，取10 mL酯化液于20 mL頂空瓶，4 ℃保存待檢。以未加麩曲為空白對照。

1.2.4 生香麩曲應(yīng)用于黃水酯化能力評價。

25 g麩曲與500 mL黃水于500 mL三角瓶中，保鮮膜封口，置35 ℃酯化5 d后，取10 mL酯化液于20 mL頂空瓶，4 ℃保存待檢。以未加麩曲為黃水空白對照，以未加菌液的麩皮為麩皮對照。

1.2.5 酯化體系反應(yīng)產(chǎn)物檢測。

酯化液均以頂空進樣方式進行氣相色譜檢測。頂空條件：加熱箱90 ℃，定量環(huán)100 ℃，傳輸線120 ℃;GC循環(huán)34 min，樣品瓶平衡20 min，壓力平衡0.10 min，進樣時間0.50 min。酯化液色譜條件參考文獻[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 17株酵母催化混酸醇生成四大酯比較

（1）17株酵母對己酸乙酯合成能力。由表2可知，17株酵母有16株能合成己酸乙酯，與空白對照比值在1.2～4.7。經(jīng)方差分析，有9株酵母促進己酸乙酯生成量與空白對照差異顯著，提高率在100%以上，表明這9株酵母合成己酸乙酯能力較好。

（2）17株酵母對乙酸乙酯合成能力。

17株酵母合成的乙酸乙酯均高于空白對照，且與空白對照比值在1.2～1.9，說明供試酵母均能合成乙酸乙酯，這與前人報道的非釀酒酵母能夠合成以乙酸乙酯為主的酯類物質(zhì)的結(jié)論一致[5]。經(jīng)方差分析，有10株酵母合成乙酸乙酯生成量達顯著差異，表明這10株酵母對促進乙酸乙酯生成有更好的潛力。

（3）17株酵母對乳酸乙酯合成能力。

在糧醅堆積或者在窖內(nèi)發(fā)酵過程中，細菌等微生物代謝產(chǎn)生大量乳酸，由于其難以揮發(fā)，便與乙醇合成乳酸乙酯，最終影響產(chǎn)品質(zhì)量[6]。通常濃香型白酒企業(yè)在生產(chǎn)中都會采取一些“降乳”措施。從17株酵母對乳酸乙酯合成能力來看，有4株生成的乳酸乙酯低于空白對照，說明這4株有抑制或分解乳酸乙酯的能力，在濃香型白酒生產(chǎn)中具有一定的“降乳”潛能。另外，乳酸乙酯對其他香型白酒（如清香型）呈味有重要貢獻，其余13株能不同程度地促進乳酸乙酯合成，且有2株能顯著提高乳酸乙酯含量，表現(xiàn)出更好的催化能力。

（4）17株酵母對丁酸乙酯合成能力。

丁酸乙酯在濃香型白酒四大酯中含量最少，僅為己酸乙酯10%左右，然而其香氣強度值僅次于己酸乙酯[7]。由表2可知，與空白對照相比，所有試驗菌株對催化合成丁酸乙酯均有促進作用，且與空白對照比值為1.2～2.4。經(jīng)方差分析，有3株酵母催化合成的丁酸乙酯生成量達顯著差異，具有更好的合成能力。

根據(jù)濃香型白酒主體風(fēng)味特征選出生成己酸乙酯顯著，同時排除生成乳酸乙酯顯著的酵母，初步篩選出H1Y-24、S432Y-42、Z8Y-15、Z8Y-91、Z9Y-91、S432Y-32、S422Y-9這7株酵母應(yīng)用于下一輪黃水酯化試驗篩選。

2.2 7株酵母應(yīng)用于黃水酯化復(fù)篩

由表3可知，7株酵母對黃水中己酸乙酯合成能力，僅有2株與黃水對照呈極顯著差異，其中H1Y-24效果最好，H1Y-24在黃水中己酸乙酯合成量是黃水對照7.0倍，另外還有1株酵母（S422Y-9）甚至低于黃水對照，有3株酵母（Z9Y-91、S432Y-32、 S422Y-9）己酸乙酯合成量均低于麩皮對照，這與初篩結(jié)果不一致，說明在黃水反應(yīng)體系中，反應(yīng)更復(fù)雜，且酵母菌株對合成己酸乙酯能力的差異性更大。這可能由于酵母是通過菌體生長過程中代謝產(chǎn)生的酶發(fā)生作用，而通過在麩皮上的培養(yǎng)和烘干，菌體可能衰老甚至死亡，在黃水中起作用的活菌較少，導(dǎo)致酶活低[8]。

與黃水對照相比，7株酵母中僅有H1Y-24、Z8Y-15、Z8Y-91酵母促進乙酸乙酯能力優(yōu)于其他菌株，而且提高倍數(shù)也明顯低于混酸醇水溶液酯化體系，這與在混酸醇水溶液的試驗結(jié)果差異較大，可能由于黃水本身成分復(fù)雜，且其中酸性物質(zhì)多，影響了供試菌株的產(chǎn)酯能力，從側(cè)面反映出白酒釀造的復(fù)雜性。

黃水中乳酸乙酯含量極高，與黃水對照相比，有3株酵母（H1Y-24、Z9Y-91、S432Y-32）能降低黃水中的乳酸乙酯，但都不顯著。7株酵母中都能提高丁酸乙酯含量，且有1株（H1Y-24）達差異極顯著，說明此菌促進丁酸乙酯合成具有一定的應(yīng)用前景。

在濃香型白酒中，酯是主要的香味物質(zhì)，其中四大酯占總酯98%以上，它們含量及比例對白酒風(fēng)味起著決定性作用[9]。通常，五糧液四大酯量比關(guān)系為己酸乙酯∶乙酸乙酯∶乳酸乙酯∶丁酸乙酯=1∶0.4～0.5∶0.4～0.5∶0.13[10]。從黃水中四大酯的比例關(guān)系看出，黃水對照中乳酸乙酯非常高，為己酸乙酯49.6倍。通過酵母麩曲的處理，H1Y-24、S432Y-42酵母能顯著提高己酸乙酯含量，降低了乳酸乙酯含量，說明這些菌株通過增加己酸乙酯含量可改善黃水的四大酯比例，使其量比向協(xié)調(diào)方向發(fā)展，具有較好的應(yīng)用效果。

3 結(jié)論

該研究先通過改良酸醇酯化體系，評價了17株酵母的四大酯合成能力，再將篩選得到的7株酵母應(yīng)用于黃水酯化，得到如下結(jié)論：

（1）通過在2種酯化體系中比較發(fā)現(xiàn)，供試菌株合成四大酯的能力趨勢基本一致，表明采用改良的酸醇酯化體系對酵母麩曲進行酯化力測定具有可行性，且可同時考察四大酯合成能力，較以往以己酸乙酯合成量為指標(biāo)更全面、科學(xué)。

（2）7株酵母在改良酸醇酯化體系中能顯著提高己酸乙酯含量，但在黃水中僅有2株（H1Y-24、S432Y-42）能顯著提高，這是由于黃水自身物質(zhì)復(fù)雜，導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性差，也可能是酵母在麩皮上培養(yǎng)烘干，導(dǎo)致活菌體少，今后將對酵母的應(yīng)用方式等參數(shù)作進一步研究。

（3）H1Y-24能顯著提高黃水己酸乙酯含量，也能提高乙酸乙酯和丁酸乙酯含量，同時能降低黃水中乳酸乙酯含量，使黃水四大酯量比關(guān)系向協(xié)調(diào)方向發(fā)展，表明該酵母具有一定的應(yīng)用前景。

參考文獻

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