重組人腸道病毒71 型病毒樣顆粒等電點全柱成像毛細管等電聚焦電泳測定方法的建立及驗證

王文偉，何成，王蓓，樓覺人，

1. 上海至成生物科技有限公司，上海 200051；2. 上海生物制品研究所有限責任公司，上海 200051

等電點（isoelectric point，pI）是蛋白質(zhì)的一種物理化學(xué)屬性，在一定的pH 條件下，蛋白質(zhì)的氨基酸分子所帶的正、負電荷相等，即凈電荷為零，此時的pH 稱為該蛋白質(zhì)的pI［1］。pI 的測定能夠反映蛋白藥物的電荷異質(zhì)性，廣泛應(yīng)用于重組蛋白藥物的質(zhì)量評價，是重組蛋白藥物質(zhì)量控制的一個重要手段［2-4］。

等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）電泳是測定蛋白質(zhì)pI 的常用方法，包括凝膠等電聚焦（gelbased isoelectric focusing，gIEF）電泳、毛細管等電聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF）電泳和全柱成像毛細管等電聚焦（whole column imaging detectioncapillary isoelectric focusing，WCID-CIEF）電泳。IEF 的基本原理是：兩性電解質(zhì)在電場下形成一個pH 梯度，當待測樣品遷移至某一pH 位置時，其所帶的凈電荷為零，不再移動，則該處的pH 值即為樣品的pI［5-6］。gIEF 所能分離的分子量范圍較小，分辨率低，準確度差，無法滿足重組病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）等生物大分子pI 的測定。傳統(tǒng)的CIEF 在聚焦完成后，需將樣品區(qū)帶遷移至檢測窗口，在遷移過程中易導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集或沉淀，譜帶展寬，從而影響分離度和分辨率。WCID-CIEF 克服了傳統(tǒng)CIEF 的不足，聚焦完成后無需進行樣品遷移，聚焦和檢測能夠同步完成，廣泛應(yīng)用于重組蛋白藥物pI 的測定和電荷異質(zhì)性的分析［7-10］。

重組人腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）VLPs由病毒的衣殼蛋白VP0、VP1 和VP3 組裝而成，直徑約30 nm［11-12］，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大（約5 660 000），目前鮮有對重組EV71 VLPs pI 研究的報道。本研究旨在建立重組人EV71 VLPs pI WCID-CIEF 測定方法，并對方法進行驗證。

1 材料與方法

1. 1 樣品 重組人EV71 VLPs 采用巴斯德畢赤酵母表達，由上海至成生物科技有限公司制備。

1. 2 主要試劑及儀器 兩性電解質(zhì)Pharmalyte pH 3-10 購自美國GE 公司；尿素購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；0. 5%甲基纖維素、1%甲基纖維素、陰陽極電解液、pI marker（4.05、5.85、7.05 和8. 40）、Maurice CIEF 毛細管卡盒和Maurice 毛細管電泳儀均購自美國Protein simple 公司。

1. 3 樣品處理 重組人EV71 VLPs 經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，用雙蒸水稀釋5 倍。取兩性電解質(zhì)Pharmalyte pH3-10 4 μL，1%甲基纖維素35 μL，4. 05 和8. 40 的pI marker 各1 μL，雙蒸水39 μL，稀釋后的EV71 VLPs 20 μL，置渦旋混勻器中充分混合均勻，1 000 × g 離心5 min，吸取90 μL 轉(zhuǎn)移至96 孔樣品板中，蓋上蓋板，4 ℃，1 000 × g 離心5 min。

1. 4 WCID-CIEF 采用預(yù)制Maurice CIEF 毛細管卡盒，卡盒內(nèi)的毛細管內(nèi)壁為氟碳涂層，內(nèi)徑100 μm，有效長度5 cm。陽極液為含0. 1%甲基纖維素的80 mmol ／ L 磷酸，陰極液為含0. 1%甲基纖維素的100 mmol ／ L 氫氧化鈉，待測樣品采用真空進樣，進樣時間為55 s。毛細管等電聚焦過程參數(shù)設(shè)置為：1 500 V 預(yù)聚焦1 min，3 000 V 聚焦5 min，檢測波長280 nm。

1. 5 聚焦時間的優(yōu)化 按照1.4 項進行WCID-CIEF，聚焦過程中Maurice 電泳儀會進行實時監(jiān)測，每隔10 s 采集1 次數(shù)據(jù)，比較不同聚焦時間下重組人EV71 VLPs 的聚焦效果，選擇合適的聚焦時間。

1. 6 尿素濃度對重組人EV71 VLPs 分離效果影響的檢測 樣品混合液中添加8 mol ／ L 尿素，設(shè)置終濃度為0、1、2 mol ／ L 3 個尿素濃度梯度，按照1. 4 項分別進行WCID-CIEF，比較不同尿素濃度對重組人EV71 VLPs 分離效果的影響。

1. 7 方法的驗證

1. 7. 1 專屬性 將空白制劑組分（空白緩沖液）和重組人EV71 VLPs 分別作為待測樣品，按照1. 4 項分別進行WCID-CIEF。

1. 7. 2 準確度 將pI marker 5.85 和pI marker 7.05分別作為待測樣品，按照1.4 項分別進行WCID-CIEF，測定pI marker 的pI，每個pI marker 重復(fù)測定6 次，計算6 次結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）及6 次結(jié)果的平均值與理論值的相對偏差。

RSD（%）= 測定結(jié)果的標準偏差／ 測定結(jié)果的算術(shù)平均值× 100%；

平均值與理論值的相對偏差=|測定結(jié)果的算術(shù)平均值-理論值| ／ 理論值× 100%

1. 7. 3 重復(fù)性 將重組人EV71 VLPs 作為待測樣品，按照1. 4 項進行WCID-CIEF，測定EV71 VLPs的pI，重復(fù)測定6 次，計算6 次結(jié)果的RSD。

1. 7. 4 中間精密度 將重組人EV71 VLPs 作為待測樣品，在不同日期，由不同實驗人員按照1. 4 項進行WCID-CIEF，測定EV71 VLPs 的pI，分別重復(fù)測定6 次，計算12 次結(jié)果的RSD。

2 結(jié) 果

2. 1 聚焦時間的優(yōu)化 3 000 V 聚焦1 min，重組人EV71 VLPs、pI marker 4. 05 和pI marker 8. 40 均未完成聚焦；3 000 V 聚焦2 min，pI marker 4. 05 聚焦完成；3 000 V 聚焦3 min，pI marker 8. 40 聚焦完成；3 000 V 聚焦4 ～5 min，圖譜不再變化，表明重組人EV71 VLPs 聚焦完成。見圖1。選擇3 000 V聚焦5 min 作為后續(xù)試驗的聚焦條件。

圖1 聚焦時間對重組人EV71 VLPs 分離效果的影響Fig. 1 Effect of focusing time on separation of recombinant human EV71 VLPs

2. 2 尿素濃度對重組人EV71 VLPs 聚焦效果的影響 在0、1、2 mol ／ L 3 個尿素濃度條件下，重組人EV71 VLPs 的等電聚焦圖譜基本一致，表明尿素濃度對重組人EV71 VLPs 的分離效果影響不大，見圖2。因此選擇重組人EV71 VLPs 樣品處理時不添加尿素。

圖2 尿素濃度對重組人EV71 VLPs 分離效果的影響Fig. 2 Effect of urea concentration on separation of recombinant human EV71 VLPs

2. 3 方法的驗證

2. 3. 1 專屬性 空白制劑組分在pI marker 4. 05和pI marker 8. 40 之間無紫外吸收峰，而重組人EV71 VLPs 有特異紫外吸收峰，表明空白緩沖液對重組人EV71 VLPs pI 的測定無干擾，方法的專屬性良好。見圖3。

圖3 方法的專屬性驗證Fig. 3 Verification for specificity of WCID-CIEF electrophoresis

2. 3. 2 準確度 pI marker 5. 85 作為待測樣品，6次重復(fù)測定結(jié)果的平均值為5. 81，RSD 為0. 18%，6 次重復(fù)測定結(jié)果的平均值與理論值的相對偏差為0. 63%；pI marker 7. 05 作為待測樣品，6 次重復(fù)測定結(jié)果的平均值為7. 16，RSD 為0. 06%，6 次重復(fù)測定結(jié)果的平均值與理論值的相對偏差為1. 54%。表明方法的準確度良好。見表1。

表1 方法的準確度驗證結(jié)果（pI）Tab.1 Verification for accuracy of WCID-CIEF electrophoresis（pI）

2. 3. 3 重復(fù)性 重組人EV71 VLPs pI 6 次重復(fù)測定結(jié)果的平均值為6. 47，RSD 為0. 08%，表明方法的重復(fù)性良好，見表2。

表2 方法的重復(fù)性驗證結(jié)果Tab. 2 Verification for reproducibility of WCID-CIEF electrophoresis

2. 3. 4 中間精密度 不同實驗人員在不同日期對重組人EV71 VLPs pI 12 次重復(fù)測定的平均值為6. 46，RSD 為0. 14%，表明方法的中間精密度良好，見表3。

表3 方法的中間精密度驗證結(jié)果（pI）Tab. 3 Verification for intermediate precision of WCID-CIEF electrophoresis（pI）

3 討 論

WCID-CIEF 是20 世紀90 年代發(fā)展起來的一項檢測技術(shù)，其將成像技術(shù)和CIEF 結(jié)合在一起，通過基于電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）或互補金屬氧化物半導(dǎo)體（complementary metal-oxidesemiconductor，CMOS）的成像裝置對整個毛細管柱內(nèi)的分離過程進行動態(tài)跟蹤成像［13］，可實時觀察樣品的等電聚焦過程，整個過程中無需進行樣品遷移，一次檢測即可完成對樣品聚焦時間的優(yōu)化，大大節(jié)約了方法開發(fā)所需時間。由于省略了復(fù)雜的樣品遷移過程，WCID-CIEF 與傳統(tǒng)的CIEF 相比，具有分析時間短（通常＜10 min）、準確度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，可實現(xiàn)高通量檢測，尤其適合重組蛋白等復(fù)雜的生物大分子藥物pI 的精確測定。目前，WCID-CIEF已成功應(yīng)用于重組人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）、諾如病毒（Norovirus，NV）和乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）VLPs pI 的測定［14-16］。

本研究采用WCID-CIEF 技術(shù)測定重組人EV71 VLPs 的pI，考察了聚焦時間和尿素濃度對重組人EV71 VLPs pI 檢測的影響，結(jié)果表明，在3 000 V 電壓下，重組人EV71 VLPs 在4 ～5 min 即可完成聚焦，添加1 ～2 mol ／ L 尿素對重組人EV71 VLPs 的分離效果基本無影響。因此，EV71 VLPs pI 檢測方法確定為：4% Pharmalyte pH3-10，0. 35%甲基纖維素，1% pI marker（4. 05 和8. 40），1 500 V 預(yù)聚焦1 min，3 000 V 聚焦5 min。方法的驗證結(jié)果顯示，該方法專屬性、準確度、重復(fù)性和中間精密度良好。重組人EV71 VLPs 的實測pI 為6. 46（n = 12，RSD =0. 14%），與其理論pI（6. 08）相差0. 38 個pH 單位，實測值和理論值基本一致。

綜上所述，本研究建立了重組人EV71 VLPs pI的WCID-CIEF 測定方法，為EV71 VLPs 的質(zhì)量評價提夠了有效手段。