超活化血小板裂解液對成骨細胞增殖的影響及凋亡修復(fù)作用

崔同，吳奇劍，劉春香，廉洪宇，趙雪，李子濤，張怡

1. 牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江牡丹江 157000；2. 杭州蕭山傅氏骨傷科醫(yī)院，浙江杭州 311254；3. 天晴干細胞股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150028

血小板裂解液（platelet lysate，PL）是先通過超濾離心從全血中分離富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP），再用凍融的方式將血小板裂解而制備的液態(tài)衍生物［1］，其去除了殘余固態(tài)細胞成分，同時降低了免疫原性，保留了其中多種生長因子，如胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、骨形成蛋白2，4，6 及白細胞介素-1 等［2-3］。有研究顯示，PL 能有效替代胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），在體外擴增培養(yǎng)成纖維細胞、內(nèi)皮細胞及間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）［4-6］。

WILTFANG 等［7］在對嚴重骨缺損的愈合影響研究中發(fā)現(xiàn)，PRP 對于骨再生有顯著影響。PL 作為PRP 的進一步裂解產(chǎn)物，也具有促進骨再生和修復(fù)的作用［8］，除了用于MSCs 擴增培養(yǎng)之外，還具有促進組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等作用［9-10］。

超活化血小板裂解液（super-activated platelet lysate，sPL）是通過用CaCl2結(jié)合肝素激活PRP 中的血小板，凍融裂解血小板的同時用溫度浮動控制方法去除纖維蛋白原獲得的［11］，制備過程中徹底去除了血小板膜、細胞碎片等溶液中的微小產(chǎn)物，比既往的PRP 及PL 中的血小板激活更徹底，保留了更高純度生物活性因子，使其不僅富含營養(yǎng)因子和生長因子，能夠改善局部微環(huán)境，刺激病灶區(qū)域功能性細胞的增殖潛能，還能激活損傷部位的干細胞，使其分化成損傷部位的成體細胞，促進骨骼及軟骨再生與修復(fù)。

本實驗旨在探討不同濃度sPL 對成骨細胞增殖的影響及凋亡修復(fù)作用，以明確其能否有效應(yīng)用于骨組織愈合。

1 材料與方法

1. 1 sPL 由天晴干細胞股份有限公司提供。

1. 2 細胞 SV40 轉(zhuǎn)染人成骨細胞（hFOB. 1. 19）購自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。

1. 3 主要試劑及儀器 Annexin V-PE ／ 7-AAD 凋亡檢測試劑盒為美國Southern biotech 公司產(chǎn)品；人TNF-α 因子為德國miltenyi 公司產(chǎn)品；G418 購自北京索萊寶科技有限公司；FBS 為美國Gibco 公司產(chǎn)品；DMEM ／ F12 為美國Hyclone 公司產(chǎn)品；流式細胞儀（Epics XL）為美國Beckman Coulter 公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡（Olympus IX53）和正置顯微鏡（Olympus CKX31）均為日本Olympus 公司產(chǎn)品；血細胞分析儀（KX-21）為日本SYSMEX 公司產(chǎn)品。

1. 4 不同濃度sPL 對hFOB. 1. 19 細胞增殖影響的檢測 37 ℃復(fù)蘇hFOB1. 19 細胞于含10% FBS 及0. 3 mg ／ mL G418 的DMEM ／ F12 培養(yǎng)基中，34 ℃，5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞長至80% ～90%后，用含不同濃度sPL（0%、5%、10%、20%）的培養(yǎng)基將細胞接種至24 孔板培養(yǎng)，5 000 個／ 孔，每個濃度3 孔，連續(xù)7 d 計數(shù)，并繪制生長曲線，比較不同組別的細胞生長速度。

1. 5 不同濃度sPL 對hFOB.1.19 細胞凋亡影響的檢測 用10% FBS + 90% DMEM ／ F12 + 0. 3 mg ／ mL G418 的培養(yǎng)基傳代hFOB1. 19 細胞，待細胞長至80% ～90%后，接種6 孔板，1 × 105個／ 孔，用含30 μg ／ L TNF-α 的2. 5% FBS + 97. 5% DMEM ／ F12培養(yǎng)基進行凋亡建模，對照組加含2.5%FBS+97.5%DMEM／F12 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，維持細胞基礎(chǔ)代謝。12 h后，將對照組和造模組細胞分別使用7AAD 和Annexin V-PE 染色，流式細胞儀檢測，確定建模是否成功。將建模成功的軟骨細胞分成4 組，分別給予含0%、5%、10%、20% sPL 的培養(yǎng)基進行凋亡修復(fù)，每組設(shè)3個平行孔，36 h 后經(jīng)流式細胞儀檢測，分析不同濃度sPL 對hFOB. 1. 19 細胞凋亡的影響。

1. 6 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 22. 0 軟件進行統(tǒng)計學分析，應(yīng)用GraphPad 繪圖，組間比較采用t 檢驗，以P ＜0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2. 1 不同濃度sPL 對hFOB.1.19 細胞增殖的影響 5%和10% sPL 對hFOB. 1. 19 細胞具有較高的促增殖作用，5% sPL 的促細胞增殖效果高于10%；20% sPL未見顯著促細胞增殖作用。見圖1。0%、5%、10%、20% sPL 組細胞的倍增時間分別為（44. 7 ± 9. 1）、（24. 2 ± 3. 5）、（29. 7 ± 3. 2）和（39. 7 ± 7. 8）h，5%和10% sPL 組細胞倍增時間明顯短于0%和20% sPL組（t0%vs5%= 3. 665，P0%vs5%= 0. 021；t0%vs10%= 2. 696，P0%vs10%= 0. 045；t5%vs20%=-3. 161，P5%vs20%= 0. 034；t10%vs20%= -2. 051，P10%vs20%= 0. 030），5%與10%組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t = -0. 241，P = 0. 111）。

圖1 不同濃度sPL 對hFOB. 1. 19 細胞增殖的影響Fig. 1 Effect of sPL at various concentrations on proliferation of hFOB. 1. 19 cells

2. 2 不同濃度sPL 對hFOB. 1. 19 細胞凋亡的影響流式細胞術(shù)分析顯示，模型組細胞凋亡率（18. 0%）顯著高于對照組（7. 1%），且差異有統(tǒng)計學意義（t =-11. 406，P = 0. 000 337），見圖2。表明凋亡建模成功。成模細胞分別經(jīng)0%、5%、10%、20%的sPL 修復(fù)后，細胞凋亡率分別為（19. 0 ± 2. 8）%、（10. 4 ±0. 7）%、（12. 6 ± 1. 3）%和（19. 5 ± 0. 7）%，與0% sPL組比較，5%和10% sPL 對凋亡細胞具有顯著修復(fù)作用（t 分別為7. 552 和4. 671，P 分別為0. 001 647和0. 009 514）；而20% sPL 未見顯著凋亡修復(fù)作用（t = -1. 078，P = 0. 341 541）。見圖3。

圖2 流式細胞術(shù)分析對照組（A）和模型組（B）細胞的凋亡率Fig. 2 Flow cytometry of apoptosis rates of cells in control（A）and model（B）groups

圖3 流式細胞術(shù)分析不同濃度sPL 組細胞的凋亡率Fig. 3 Flow cytometry of apoptosis rates of cells treated with sPL at varous concentrations

3 討 論

以往的研究發(fā)現(xiàn)，血小板內(nèi)含多種生物活性因子［12-13］，可通過凍融方法使血小板裂解，以制備PL［1，14］。但劉春香等［11］研究發(fā)現(xiàn)，凍融方法制備的PL并未能使血小板充分裂解以將因子有效釋放，因此，其通過物理化學結(jié)合方式制備出可高效釋放因子的sPL，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，sPL 技術(shù)激活和誘導(dǎo)血小板釋放后的TGF-β、PDGF、EGF、VEGF 等活性因子均高于傳統(tǒng)PL 方法。同時，sPL 可置于-80 ℃冷凍保存，隨時可取出融化過濾處理，解決了PRP 制備后需立即使用的時間限制問題，使采血、分離、制備及應(yīng)用時間更靈活。

目前國內(nèi)外研究主要是將PL 用于體外培養(yǎng)各種來源的MSCs［15-18］。此前在PL 對內(nèi)皮細胞、單核細胞及成纖維細胞影響的研究中，BARSOTTI 等［19］發(fā)現(xiàn)，PL 可促進細胞活性，加速各種細胞類型的體外傷口愈合，其中5% PL 對傷口閉合的影響最大，而1%和20%濃度均導(dǎo)致延遲效應(yīng)，說明其具有濃度依賴相關(guān)性。在骨組織工程中的大量實驗數(shù)據(jù)顯示，PL 在保持了骨髓基質(zhì)干細胞生長能力和表型的同時，還能促進人骨髓基質(zhì)干細胞增殖［20］。本實驗結(jié)果顯示，5% sPL 促成骨細胞增殖效應(yīng)最明顯；5%及10% sPL 對凋亡細胞具有顯著修復(fù)作用，20% sPL未見顯著的凋亡修復(fù)作用，說明在一定濃度下，sPL對成骨細胞凋亡具有修復(fù)作用，而高濃度的sPL 對成骨細胞無凋亡修復(fù)作用，該結(jié)果與BARSOTTI 等［19］的研究結(jié)果相對一致，5%的PL 及sPL 促細胞增殖及組織修復(fù)效果最佳，這可能與5%濃度大約對應(yīng)于裂解前血小板懸浮液中的生理血小板濃度有一定的關(guān)系，該濃度下所含因子量可有效刺激細胞增殖及損傷修復(fù)，而低濃度下（1%以下）因子含量不足以實現(xiàn)修復(fù)作用，高濃度（20%以上）時，因子含量過飽，使其并未能達到理想效果，甚至抑制受體的激活作用，但具體機制仍需進一步研究。

本研究結(jié)果顯示，sPL 具有促進成骨細胞增殖以及凋亡修復(fù)的效果，且濃度為5%時，效果更明顯，表明sPL 有望成為機體損傷修復(fù)的有效手段。其通過釋放高生物活性因子，刺激創(chuàng)面處內(nèi)源性干細胞分化，并對受損組織細胞進行修復(fù)，使其能夠高效增殖、抑制凋亡、增加膠原合成、激發(fā)血管再生，進而達到促進骨組織修復(fù)和再生的效果。本研究為動物體內(nèi)研究及臨床研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，sPL修復(fù)的具體機制及體內(nèi)應(yīng)用的最佳濃度仍需進一步研究。