C 群腦膜炎球菌多糖層析純化工藝條件的優(yōu)化

蘇曉葉，高磊，程亞君，李倩，田雨，劉剛

北京智飛綠竹生物制藥有限公司，北京 100176

現(xiàn)行多糖純化分離技術(shù)多采用傳統(tǒng)的乙醇沉淀與苯酚抽提工藝［3-6］，該工藝過程伴隨復(fù)雜的反復(fù)超濾離心及透析，時間周期長，且過程引入強毒性苯酚［7-8］，影響產(chǎn)品安全性及產(chǎn)品質(zhì)量。因此，近年來，采用現(xiàn)代化的生物技術(shù)純化制備細菌莢膜多糖已成為新的趨勢［9-15］，關(guān)于多糖層析純化的相關(guān)研究多采用Capto Adhere 與Capto DEAE 串聯(lián)的方法（命名為：流穿模式多糖層析）去除腦膜炎粗多糖樣品中的蛋白雜質(zhì)［16-20］。腦膜炎球菌多糖可流穿式快速通過層析柱，大量蛋白質(zhì)等雜質(zhì)則因強電負性而被吸附至層析介質(zhì)上，最終達到多糖純化的目的。本文對該技術(shù)應(yīng)用于C 群腦膜炎球菌多糖分離純化的工藝條件進行了優(yōu)化，在以往研究的基礎(chǔ)上進一步分析緩沖液中SDC 含量、粗多糖濃度以及上樣量對層析純化的影響，以期在保證分離效果的基礎(chǔ)上，盡可能增大單次純化處理量。

1 材料與方法

1. 1 多糖 C 群腦膜炎球菌粗多糖是C 群腦膜炎球菌經(jīng)十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）處理及乙醇分步沉淀的粗糖，由北京智飛綠竹生物制藥有限公司制備并提供。

1. 2 主要試劑及儀器 Tris 試劑及脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate，SDC）購自美國Sigma 公司，均為分析純；Capto Adhere 和CaptoDEAE 凝膠、AKTApliot 層析系統(tǒng)購自美國GE 公司。

1. 3 多糖樣品預(yù)處理 取C 群腦膜炎球菌粗多糖溶于100 mL 1. 0% Tris-HCl 溶液（pH 8. 0）中混勻，析出白色固體，過夜反應(yīng)；1 500 × g 離心10 min 后，經(jīng)0. 22 μm 一次性濾膜過濾，收集濾液。

1. 4 層析純化 將XK16／40 Capto Adhere 和XK 16／20 Capto DEAE 柱串聯(lián)，緩沖液平衡后，將預(yù)處理后的多糖樣品上樣。層析純化條件：流速為90 cm ／ h，粗多糖濃度為5 g ／ L，洗脫溶液為含0. 5% SDC 的Tris-HCl 溶液，上樣量為25% CV（柱體積）。分別以206、280、260 nm 吸收峰監(jiān)測唾液酸、蛋白、核酸分離情況，收集多糖流穿峰。

1. 5 多糖的脫鹽 將收集的純化樣品用50 kD 膜包超濾，進行脫鹽處理，凍干后得到多糖粉末。

1. 6 工藝條件的優(yōu)化

2.1 PITC實施前后總體情況 淮安市2013年推行PITC服務(wù)，2012年全市共檢測各類人群293 831人次，發(fā)現(xiàn)感染者85例，其中通過PITC途徑發(fā)現(xiàn)34例。2016年共檢測601 221人次，發(fā)現(xiàn)感染者131例，其中通過PITC途徑發(fā)現(xiàn)74例。與PITC實施前相比，全市的HIV抗體檢測量增長了104.61%，新發(fā)現(xiàn)感染者例數(shù)增長了54.12%。PITC途徑發(fā)現(xiàn)的感染者占當(dāng)年全市新發(fā)現(xiàn)感染者的比例由40.00%上升到56.49%。

1. 6. 1 緩沖液SDC 含量 將多糖濃度為2.5 和5.0 g／L的粗多糖分別上樣于層析系統(tǒng)，上樣量為25% CV，分別用含0. 50%、0. 75%和1. 00% SDC 的Tris-HCl緩沖液進行洗脫，洗脫流速為90 cm ／ h，考察緩沖液中SDC 含量對C 群腦膜炎球菌多糖層析純化分離效果的影響。分別以206、280、260 nm 吸收峰監(jiān)測唾液酸、蛋白、核酸分離情況，收集多糖流穿峰。

1. 6. 2 粗多糖濃度 將多糖含量為2.5、5.0 和7.5 g／L的粗多糖溶液分別上樣于層析系統(tǒng)，上樣量為25%CV，用含0. 50% SDC 的Tris-HCl 緩沖液進行洗脫，洗脫流速為90 cm ／ h，考察粗多糖濃度對C 群腦膜炎球菌多糖層析純化分離效果的影響。分別以206、280、260 nm 吸收峰監(jiān)測唾液酸、蛋白、核酸分離情況，收集多糖流穿峰。

1. 6. 3 上樣量 將5. 0 g ／ L 粗多糖溶液上樣于層析系統(tǒng)，上樣量分別為20%、25%和30% CV，用含0. 50% SDC 的Tris-HCl 緩沖液進行洗脫，洗脫流速為90 cm ／ h，考察上樣量對C 群腦膜炎球菌多糖層析純化分離效果的影響。分別以206、280、260 nm吸收峰監(jiān)測唾液酸、蛋白、核酸分離情況，收集多糖流穿峰。

1. 7 層析柱使用壽命的檢測 在最優(yōu)層析純化工藝條件下，連續(xù)進樣5 次，分別收集純化樣品并進行檢測，考察層析柱使用壽命。

1. 8 多糖脫鹽超濾條件的優(yōu)化 將收集的純化樣品濃縮至1 L，采用50 kD 膜包，用純化水進行等體積超濾脫鹽，超濾過程中監(jiān)測SDC 殘留量，考察脫鹽最佳超濾條件。

1. 9 可比性分析 將上述優(yōu)化得到的最佳層析純化條件進行放大化（采用XK50 ／ 50 Capto Adhere 和XK 50 ／ 30 Capto DEAE 串聯(lián)），同一批次同量粗糖分別用層析純化和傳統(tǒng)苯酚抽提法進行純化及凍干。分別以206、280、260 nm 吸收峰監(jiān)測唾液酸、蛋白、核酸分離情況，收集多糖流穿峰。

1. 10 樣品檢測 實驗過程中樣品多糖含量用檢測唾液酸含量的方法確定，按《中國藥典》三部（2015版）通則3102 進行檢測；蛋白含量按《中國藥典》三部（2015 版）通則0731 第二法lowry 法進行檢測；核酸含量按《中國藥典》三部（2015 版）通則0401 紫外分光光度法進行檢測。

1. 11 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Excel 電子表格與統(tǒng)計功能進行統(tǒng)計學(xué)分析，可比性分析中層析純化方法和傳統(tǒng)苯酚抽提法兩者的比較采用t 檢驗，以P ＜0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 工藝條件的優(yōu)化

2. 1. 1 緩沖液SDC 含量對層析效果的影響 當(dāng)粗多糖濃度為2. 5 或5. 0 g ／ L 時，洗脫溶液中SDC 濃度由1. 00%降至0. 75%、0. 50%時，均可實現(xiàn)多糖與蛋白的分離，見圖1。當(dāng)SDC 含量降至0. 50%時，層析純化后依然能獲得較高的多糖回收率，可實現(xiàn)多糖與蛋白的分離，見表1。

圖1 緩沖液中SDC 含量對層析效果影響的層析圖譜Fig. 1 Chromatogram of influence of SDC content in buffer on chromatographic effect

表1 緩沖液中不同SDC 含量的層析結(jié)果（%）Tab. 1 Effect of SDC content in buffer on chromatography（%）

2. 1. 2 粗多糖濃度對層析效果的影響 多糖濃度為5. 0 和2. 5 g ／ L 時，可實現(xiàn)多糖與蛋白的分離；當(dāng)多糖濃度升至7. 5 g ／ L 時，多糖吸收峰與蛋白吸收峰重疊，純化效果差，且試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，該高濃度樣品黏度高、雜質(zhì)較多，在層析柱上會明顯出現(xiàn)大量色素沉積，柱壓升高，不能高效分離多糖與蛋白。見圖2。粗多糖濃度升至5. 0 g ／ L 時，層析法仍能高回收率的分離純化C 群多糖，見表2。

圖2 粗多糖濃度對層析效果影響的層析圖譜Fig. 2 Chromatogram of influence of crude polysaccharide concentration on chromatographic effect

表2 粗多糖濃度對層析效果的影響（%）Tab. 2 Effect of crude polysaccharide concentration on chromatography（%）

2. 1. 3 上樣量對層析效果的影響 當(dāng)上樣量低于25% CV 時，可將多糖與蛋白較好的分離；當(dāng)上樣量為30%CV 時，多糖吸收峰與蛋白吸收峰出現(xiàn)部分重疊，未能實現(xiàn)多糖的分離純化。見圖3。提高上樣量后，蛋白／ 唾液酸比及多糖回收率基本相同，見表3。表明處理量提高至25% CV 仍可實現(xiàn)C 群多糖的分離純化。

圖3 上樣量對層析效果影響的層析圖譜Fig. 3 Chromatogram of influence of loading volume on chromatographic effect

表3 上樣量對層析效果的影響（%）Tab. 3 Effect of loading volume on chromatography（%）

2. 2 層析柱使用壽命 連續(xù)5 次進樣，多糖蛋白出峰時間、峰型及峰高基本一致，且5 次檢測結(jié)果數(shù)據(jù)較穩(wěn)定，見圖4 和表4。表明層析柱連續(xù)上樣5 次，仍可達到粗多糖分離純化效果。

圖4 連續(xù)5 次進樣的層析圖譜Fig. 4 Chromatogram of five consecutive injections

表4 連續(xù)5 次進樣后收集樣品的檢測結(jié)果（mg ／ g）Tab. 4 Test results of purified samples after five consecutive injections（mg ／ g）

2. 3 多糖脫鹽超濾條件的優(yōu)化 SDC 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。當(dāng)純化水用量約為20 倍多糖料液體積時，SDC 殘留量僅為3. 98 μg ／ mL，達到去除殘留SDC雜質(zhì)的目的，見圖6。2. 4 可比性分析 兩種方法制備的多糖樣品唾液酸、蛋白及核酸含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0. 05），兩種樣品的質(zhì)量具有可比性，見表5。表明層析純化法可在保證多糖樣品質(zhì)量的前提下，提高樣品處理速度及處理量。

圖5 SDC 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig. 5 Standard curve of SDC concentration

圖6 超濾過程SDC 殘余趨勢圖Fig. 6 SDC residual trend graph during ultrafiltration

表5 兩種方法制備的凍干樣品檢測結(jié)果（mg ／ g）Tab. 5 Test results of freeze-dried samples prepared by two methods（mg ／ g）

3 討 論

層析法純化分離能力除取決于層析介質(zhì)的自身性質(zhì)外，與被分離物的性質(zhì)及純化工藝條件也相關(guān)，本研究對影響C 群腦膜炎球菌多糖層析純化的條件（洗脫緩沖液中SDC 含量、粗糖濃度及上樣量）進行了優(yōu)化。

SDC 是一種離子型去污劑，可用于裂解細胞，也可溶解難溶于水的蛋白質(zhì)。在洗脫緩沖液中加入一定量的SDC，有利于多糖的分離純化。然而，大量的SDC 引入多糖溶液，不僅需要更長時間的脫鹽處理，而且容易造成部分多糖流失。本研究結(jié)果顯示，洗脫緩沖液中SDC 的含量降低至0. 50%，仍能較好地分離純化C 群多糖。

粗多糖濃度及上樣體積直接體現(xiàn)了層析柱的負荷量，工藝條件優(yōu)化結(jié)果顯示，當(dāng)粗糖濃度提高至5. 0 g ／ L、上樣體積最高為25% CV 時，仍可達到分離純化C 群多糖的目的。當(dāng)糖濃度和上樣體積繼續(xù)增加時，蛋白質(zhì)吸收峰與多糖吸收峰出現(xiàn)部分重疊，而無法實現(xiàn)多糖的分離純化。

流穿模式層析中大部分多糖、蛋白、核酸是流穿下來的，僅有小部分多糖、蛋白、核酸吸附于層析凝膠上，因此并不需要頻繁進行高鹽除雜蛋白，且減少堿清潔次數(shù)可延長層析介質(zhì)的使用壽命。本研究結(jié)果顯示，層析柱在連續(xù)使用5 次后，多糖、蛋白出峰時間、峰型峰高及純化樣檢測結(jié)果基本不變，且檢測結(jié)果符合《中國藥典》三部（2015 版）要求。生產(chǎn)過程中可在連續(xù)5 次進樣后進行1 次高鹽清潔及堿液清潔再生。

超濾脫鹽條件優(yōu)化結(jié)果顯示，僅20 倍多糖料液體積的純化水就可達到去除糖溶液中SDC 的目的。

綜上所述，在層析流速為90 cm ／ h 的條件下，粗多糖上樣濃度可提高至5. 0 g ／ L，流動相SDC 濃度可降至0. 50%，上樣量升高至25%，層析法可較好地分離純化C 群腦膜炎球菌多糖；超濾脫鹽后SDC 殘留量僅為3. 98 μg ／ mL；層析純化可連續(xù)進行5 次，且層析柱的純化分離效果基本不受影響。