層析介質(zhì)Capto Core400 和Sephacryl S-1000純化乙型肝炎病毒核心蛋白病毒樣顆粒效果的比較

郎藝潔，王云龍，李玉林，王繼創(chuàng)，王旭東，王曉軍，周麗，錢鵬

1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450010；3.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451460；4.河南省職工醫(yī)院，河南 鄭州 450002

病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）是由一種或多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的顆粒，其形態(tài)與真病毒粒子相似，但不含病毒基因組結(jié)構(gòu)，又稱“偽病毒或假病毒”［1］?；谝倚透窝撞《竞诵牡鞍祝╤epatitis B virus core protein，HBc）基因序列的C-末端、N-末端及主要免疫原區(qū)（main immunogenic region，MIR）在插入外源基因后，仍可進(jìn)行正確折疊和組裝，因此，HBc VLPs 成為目前眾多領(lǐng)域中研究最為廣泛的納米載體［2］。

層析介質(zhì)Capto Core400 是基于核心微球的一種純化介質(zhì)，每個(gè)微球均含有1 個(gè)由辛胺配體激活的核心［3］，該核心被一層無配體的外層包圍，可阻止大顆粒物質(zhì)與配體結(jié)合，較小的雜質(zhì)可自由進(jìn)入，被微球捕獲。蛋白質(zhì)的截留相對(duì)分子質(zhì)量約為4 × 105，大于該值的目標(biāo)蛋白將隨著洗脫液流出層析柱。層析介質(zhì)Sephacryl S-1000 是葡聚糖交聯(lián)N，N-亞甲基二乙酰胺形成的一種純化介質(zhì)，所能分離蛋白質(zhì)的截留相對(duì)分子質(zhì)量為5×105～1×108，具有良好的機(jī)械性能。兩種介質(zhì)在生物制品純化中均有較廣闊的應(yīng)用價(jià)值［4］。本研究采用兩種層析介質(zhì)純化HBc VLPs蛋白粗提液，并對(duì)純化效果進(jìn)行比較，以期為HBc VLPs的純化選擇一種簡便可靠的純化工藝。

1 材料與方法

1.1載體及菌株 載體pET-43.1a（+）及感受態(tài)E.coliBL21（DE3）均由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.2主要試劑及儀器 核酸內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；IPTG 及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；氨芐西林購自北京夢怡美生物科技有限公司；Tris、NaCl 及NaOH 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；層析介質(zhì)Sephacryl S-1000、Capto Core400 及空層析柱Column XK50 ／ 100、Column XK26 ／ 30 均購自美國GE Healthcare 公司；Ultrahydrogel 2000 購自美國Waters 公司；馬爾文粒徑儀購自英國馬爾文儀器有限公司。

1.3HBc VLPs 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 根據(jù)NCBI 中登錄的HBc基因序列（944568），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成該基因序列。HBc基因序列經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，插入至經(jīng)同樣酶酶切的載體pET-43.1a（+）中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coilBL21（DE3），于26 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，加入含100 μg ／ mL 氨芐西林的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，210 r／min 搖床振蕩培養(yǎng)10 h；加入IPTG 至終濃度50 μg ／ mL，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h；2 000 ×g離心4 min，取沉淀，超聲破碎，用20%及40%硫酸銨沉淀，獲得HBc VLPs 蛋白粗提液。

1.4HBc VLPs 蛋白的純化

1.4.1Sephacryl S-1000 層析 將Sephacryl S-1000層析介質(zhì)裝入空層析柱Column XK50 ／ 100 中，用緩沖液1（含300 mmol ／ L NaCl 的20 mmol ／ L Tris）常溫平衡層析柱2 個(gè)柱體積，上樣HBc VLPs 蛋白粗提液，蠕動(dòng)泵上樣流速為：4 r ／ min，上樣量為：600 mg。用緩沖液1 洗脫層析柱，280 nm 處吸光度值升至20 ～30 mAU 時(shí)開始收集第1 峰，吸光度值達(dá)峰頂值后下降至70 ～80 mAU 時(shí)停止收集；用緩沖液1 洗脫層析柱，當(dāng)吸光度值上升至90 mAU 時(shí)開始收集第2 峰，下降至70 ～80 mAU 時(shí)停止收集；緩沖液1 沖洗半個(gè)柱體積，再用0.5 mol ／ L NaOH 洗滌，緩沖液1 平衡至流出液pH 為8。每管收集50 mL，共收集14 管，共上樣3 個(gè)批次的HBc VLPs。

1.4.2Capto Core400 層析 將Capto Core400 層析介質(zhì)裝入空層析柱Column XK26 ／ 30 中，用緩沖液1常溫平衡層析柱2 個(gè)柱體積，上樣HBc VLPs 蛋白粗提液，蠕動(dòng)泵上樣流速為：4 r／min，上樣量為：600 mg。上樣后用緩沖液1 洗脫層析柱，280 nm 處吸光度值升至20 ～30 mAU 時(shí)開始收集，吸光度值達(dá)峰頂值后下降至70 ～80 mAU 時(shí)停止收集；緩沖液1 沖洗半個(gè)柱體積，再用0.5 mol ／ L NaOH 洗滌，緩沖液1 平衡至流出液pH 為8。每管收集50 mL，共收集8 管，上樣批次同1.4.1 項(xiàng)。

1.5HBc VLPs 濃度檢測 BCA 法測定蛋白濃度，并按下式計(jì)算回收率。

1.6HBc VLPs 純度檢測 采用體積排阻色譜法。色譜柱為：Ultrahydrogel 2 000；紫外PDA 檢測器，檢測波長為：280 nm；流動(dòng)相為：20 mmol／L PBS，150 mmol／L NaC；上樣量為：20 μL；流速為：0.6 mL ／ min；檢測時(shí)間為：30 min；柱溫為：25 ℃。

1.7HBc VLPs 粒徑檢測 將兩種層析介質(zhì)純化的HBc VLPs 稀釋至相同濃度，通過馬爾文粒徑儀對(duì)HBc VLPs 進(jìn)行粒徑檢測。

1.8HBc VLPs 形態(tài)觀察 取適量相同濃度的兩種層析柱純化后的HBc VLPs 滴至銅網(wǎng)上，靜置2 min，用濾紙從銅網(wǎng)的一邊吸取液體，滴加1%磷鎢酸，靜置2 min；用濾紙從銅網(wǎng)的一邊吸取液體，放入玻璃平皿中，待銅網(wǎng)上的液體自然晾干；將制備好的銅網(wǎng)固定在樣品握持桿的樣品臺(tái)上，插入至樣品室內(nèi)，抽真空后，置透射電子顯微鏡觀察，并拍照。

2 結(jié) 果

2.1兩種層析介質(zhì)純化HBc VLPs 的洗脫曲線 Sephacryl S-1000 的洗脫曲線可見2 個(gè)流穿峰，第2 峰為主要目的蛋白；Capto Core400 的洗脫曲線可見1 個(gè)流穿峰，為目的蛋白。取其中1 批HBc VLPs 的純化結(jié)果繪制洗脫曲線，見圖1 和圖2。將Sephacryl S-1000 層析柱純化后的第5 ～12 管HBc VLPs 進(jìn)行合并作為目的蛋白，Capto Core400 層析柱純化后的第1 ～8 管全部合并作為目的蛋白，用于后續(xù)檢測。

圖1 層析介質(zhì)Sephacryl S-1000（A）及Capto Core400（B）純化HBc VLPs 的洗脫曲線Fig.1 Elution curves of HBc VLPs purified with Sephacryl S-1000（A）and Capto Core400（B）

2.2兩種層析介質(zhì)純化HBcVLPs 的蛋白回收率 層析介質(zhì)SephacrylS-1000 和CaptoCore400 純化HBcVLPs的蛋白回收率分別為75.5%和70.5%。

2.3兩種層析介質(zhì)純化HBc VLPs 的純度 層析介質(zhì)Sephacryl S-1000 和Capto Core400 純化HBc VLPs的蛋白純度分別為87%和99%，見圖2。

圖2 體積排阻色譜法檢測層析介質(zhì)Sephacryl S-1000（A）及Capto Core400（B）純化HBc VLPs 的純度Fig.2 Determination of purity of HBc VLPs purified with Sephacryl S-1000（A）and Capto Core400（B）by size-exclusion chromatography

2.4兩種層析介質(zhì)純化HBc VLPs 的粒徑 經(jīng)兩種層析介質(zhì)純化后，HBc VLPs 均出現(xiàn)單一粒徑峰，粒徑大小均為（30 ± 4）nm，均一性良好，顆粒分布均勻，見圖3。

圖3 層析介質(zhì)Sephacryl S-1000（A）及Capto Core400（B）純化HBc VLPs 的粒徑圖Fig.3 Sizes of HBc VLPs purified with Sephacryl S-1000（A）and Capto Core400（B）

2.5兩種層析介質(zhì)純化HBc VLPs 的形態(tài) 透射鏡下觀察可見，與Sephacryl S-1000 比較，經(jīng)Capto Core400純化的HBc VLPs 分布更均勻，見圖4。

圖4 層析介質(zhì)Sephacryl S-1000（A）及Capto Core400（B）純化HBc VLPs 形態(tài)的鏡下觀察（× 200 000）Fig.4 Electron microscopy of morphologies of HBc VLPs purified with Sephacryl S-1000（A）and Capto Core400（B）（×200 000）

3 討 論

目前，國內(nèi)廠家生產(chǎn)HBc VLPs 采用多種方法結(jié)合的形式進(jìn)行純化，如鹽析、分子篩層析及離子交換層析聯(lián)用［5］，凝膠過濾層析、離子交換與蔗糖密度梯度離心聯(lián)用［6-7］；另外，還可通過改變溫度的熱處理法進(jìn)行純化［8］。多種純化方法聯(lián)用的過程較復(fù)雜［9］，且可重復(fù)性較低，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

Capto Core 系列層析介質(zhì)具有雙層結(jié)構(gòu)，表層是帶有小孔的惰性層，可截留大分子，使之直接流穿，小分子通過小孔進(jìn)入填料內(nèi)部核心區(qū)域。核心區(qū)域-Core 帶有復(fù)合模式的辛氨基團(tuán)，可吸附結(jié)合雜質(zhì)分子，因此，Capto Core 填料具有分子篩與吸附層析（電荷+ 疏水性）的雙重特點(diǎn)，可用于純化多種物質(zhì)。Capto Core700 可以流動(dòng)模式提純較大的生物分子和生物制品［10］，如用于登革熱嵌合減毒活疫苗的大量純化［11］，還可用于多種病毒的純化［12-15］，其中對(duì)輪狀病毒的純化可有效去除宿主蛋白，病毒收率達(dá)80%以上［16-17］。目前，用Capto Core400 層析介質(zhì)進(jìn)行HBc VLPs 純化的研究鮮見報(bào)道。本研究用Sephacryl S-1000 和Capto Core400 兩種層析介質(zhì)純化3 批HBc VLPs 粗提液，并對(duì)純化效果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，層析介質(zhì)Sephacryl S-1000 和Capto Core400 純化HBc VLPs 的蛋白回收率分別為75.5%和70.5%，蛋白純度分別為87%和99%，粒徑大小均為（30 ± 4）nm，均一性良好；與Sephacryl S-1000 比較，經(jīng)Capto Core400 純化的HBc VLPs 分布更均勻。另外，Capto Core400 層析柱的柱床體積（133 mL）遠(yuǎn)小于Sephacryl S-1000 層析柱（1 570 mL），且Capto Core400 層析柱的線性流速（45 cm／h）也高于Sephacryl S-1000 層析柱（12 cm ／ h），節(jié)約了層析介質(zhì)及緩沖液用量，縮短了純化時(shí)間。因此，層析介質(zhì)Capto Core-4 00 更適用于HBc VLPs 的規(guī)模化生產(chǎn)，有望成為HBc VLPs 及其衍生物純化的新工藝。