嚙齒類動(dòng)物模型在新型冠狀病毒肺炎治療中的應(yīng)用

孫凱麗，王如玉 綜述，李新國(guó) 審校

武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司新發(fā)傳染病研究室生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430207

新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）［1］引起的新型呼吸道感染疾病，主要病理變化為呼吸道和肺部出現(xiàn)炎癥，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸問題。冠狀病毒家族可影響的動(dòng)物種類廣泛，且病毒感染的范圍取決于被感染宿主的類型。SARS-CoV-2 通過與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結(jié)合侵染細(xì)胞［2-3］，感染上呼吸道，進(jìn)而擴(kuò)散至下呼吸道。在此階段，病毒持續(xù)復(fù)制，導(dǎo)致宿主細(xì)胞凋亡，Ⅰ、Ⅱ型肺細(xì)胞損傷，肺泡上皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），同時(shí)引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，激活其他免疫細(xì)胞參與宿主防御機(jī)制。

闡明COVID-19 的發(fā)病機(jī)制有助于對(duì)現(xiàn)有藥物治療效果進(jìn)行比較，篩選出優(yōu)良藥物，找到最有效的治療方法。易感動(dòng)物模型的建立對(duì)于闡明致病機(jī)制、確定新的治療目標(biāo)以及開發(fā)和測(cè)試有效治療方法具有十分重要的意義，其中嚙齒類動(dòng)物具有繁殖快、經(jīng)濟(jì)、易于飼養(yǎng)等特點(diǎn)，是理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

本文就SARS-CoV-2 易感嚙齒類動(dòng)物模型的感染情況和病理特征及其在COVID-19 治療中的應(yīng)用作一綜述，以期為選擇合適的易感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及開發(fā)COVID-19 候選疫苗和治療藥物提供參考。

1 小鼠模型

小鼠模型廣泛應(yīng)用于病毒研究，但由于病毒對(duì)其的易感程度不同，通常需對(duì)小鼠進(jìn)行基因修飾或病毒適應(yīng)性篩選。針對(duì)SARS-CoV-2 開發(fā)的各種小鼠模型大多通過基因修飾或病毒適應(yīng)性篩選獲得。

1.1基因修飾小鼠模型

幾種近親繁殖的小鼠包括BALB ／ c［4］、C57BL ／6［5］以及基因缺陷型（-／-）小鼠，如重組激活基因-1（recombination activating gene-1，Rag1）-／-和信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducerand activator of transcription 1，Stat1）-／-［6-8］被用來研究SARS-CoV的感染。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，在肺上皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子HFH4／FOXJ1 控制下，過表達(dá)人類ACE2（hACE2）的轉(zhuǎn)基因小鼠也易感染SARS-CoV-2［9-10］。ACE2 是SARS-CoV 的宿主受體這一發(fā)現(xiàn)使研究表現(xiàn)人類疾病的小鼠模型成為熱點(diǎn)［11］。由此，有科研者構(gòu)建了表達(dá)hACE2 的轉(zhuǎn)基因小鼠K18-hACE2，其可在回腸部位表達(dá)小鼠ACE2（mACE2）［12］。K18-hACE2 小鼠極易感染SARS-CoV，且肺部能檢測(cè)到很高的病毒載量，感染后第4 天，小鼠體重顯著降低并開始死亡［11］，死亡主要是由于病毒擴(kuò)散到大腦造成的［13］。另一項(xiàng)研究中，研究者構(gòu)建了mACE2 啟動(dòng)子控制下表達(dá)hACE2 的轉(zhuǎn)基因小鼠，也出現(xiàn)了類似的感染相關(guān)癥狀［14］。

1.1.1K18-hACE2 小鼠模型 隨著SARS-CoV-2 ／ACE2 相互作用的發(fā)現(xiàn)［1］，K18-hACE2 小鼠模型再次被應(yīng)用于研究COVID-19 的致病機(jī)理、篩選臨床藥物與疫苗研發(fā)中。第1 個(gè)成功構(gòu)建的SARS-CoV-2轉(zhuǎn)基因小鼠感染模型是在mACE2 啟動(dòng)子的控制下表達(dá)hACE2［14-15］。在14 d 的監(jiān)測(cè)期內(nèi)，感染SARSCoV-2 的小鼠體重顯著減輕，對(duì)感染后第1 天組織中的病毒核酸載量進(jìn)行檢測(cè)，除了肺臟中檢測(cè)到病毒，其他組織或器官中未檢測(cè)到病毒，表明感染幾乎完全發(fā)生在肺部。感染后1 ～5 d，肺部均檢測(cè)出很高的病毒載量，肺部病理結(jié)果顯示，感染后第3 天開始，出現(xiàn)中度間質(zhì)性肺炎、淋巴細(xì)胞滲入、黏液積累和支氣管細(xì)胞脫粒等［15］。

最近一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，K18-hACE2 小鼠感染SARS-CoV-2 后第5 天，體重降低10% ～15%，至第7 天，體重下降至感染前的75%［16］。感染后第2 天，肺部可檢測(cè)到高病毒載量，同時(shí)在心臟、大腦、腎臟和脾臟也檢測(cè)到一定的病毒載量。感染后第7 天，肺功能顯著下降，具體表現(xiàn)為吸氣能力減弱、組織阻力和彈性增加。感染后肺組織RNA 測(cè)序結(jié)果表明，其先天免疫功能上調(diào)，特別是核因子-kB（nuclear factor-kappa B，NF-kB）依賴性、Ⅰ型和Ⅱ型干擾素（interferon，IFN）信號(hào)通路及白細(xì)胞活化通路。同時(shí)許多研究表明［17-19］，K18-hACE2 小鼠感染SARSCoV-2 后的第5 天存在感染劑量依賴性致死，表明SARS-CoV-2 與SARS-CoV 一樣對(duì)這些轉(zhuǎn)基因小鼠有致死性。

1.1.2HFH4-hACE2 小鼠模型 研究表明，大多數(shù)感染的HFH4-hACE2 小鼠在感染后的7 d 內(nèi)體重出現(xiàn)減輕，從感染后第4 天開始體重明顯降低的小鼠越來越虛弱，感染后第6 天，外周血淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞大量增加，這與人類一些嚴(yán)重疾病的表現(xiàn)相似［20-21］。肺組織病理結(jié)果顯示，感染后第1 天，有巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞滲透，感染后第7 天，逐漸演變?yōu)閲?yán)重肺炎、阻塞末期支氣管炎、大面積的肺纖維化和肺泡壞死［15］。HFH4-hACE2 感染小鼠的肺部、眼睛、大腦和心臟中均可檢測(cè)到病毒，表明該病毒在肺部感染后可能擴(kuò)散到其他組織部位［15，22］。SARSCoV-2 再次感染康復(fù)后的HFH4-hACE2 小鼠，小鼠體重變化不明顯，且病毒載量降低、存活率提高，表明初次感染后，小鼠的相關(guān)免疫系統(tǒng)被激活。

1.2腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) 腺病毒載體（adenovirus vector，AdV）系統(tǒng)可將人類受體插入小鼠基因組，對(duì)于制備基因缺失或轉(zhuǎn)基因小鼠很有價(jià)值。復(fù)制缺失腺病毒載體已用于將人二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DDP4）插入野生型小鼠基因組中，使其易于感染中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）［23］。感染的小鼠表現(xiàn)出肺炎癥狀，在第6 天肺部出現(xiàn)免疫細(xì)胞滲透，且病毒被清除［20］。

同樣，BALB ／ c 小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)含有hACE2 的腺病毒（AdV-hACE2），轉(zhuǎn)導(dǎo)10 h 后，其肺部可穩(wěn)定表達(dá)hACE2［19］。AdV-hACE2 小鼠感染SARS-CoV-2后8 d 內(nèi)，體重減輕10%，肺部檢測(cè)到很高的病毒載量，心臟、大腦、肝臟和脾臟中也檢測(cè)到一定的病毒載量，血管周圍和肺泡部位出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞積聚，組織學(xué)檢查可見血管充血。相較于感染SARSCoV-2 的AdV-hACE2 小鼠，給予可暫時(shí)抑制Ⅰ型IFN 信號(hào)通路的單克隆抗體—抗IFNAR1 抗體，可導(dǎo)致小鼠體重下降20%以上，且伴隨更嚴(yán)重的肺部炎癥。給予中和抗SARS-CoV-2 刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S 蛋白）（1B07）抗體，可降低小鼠疾病的嚴(yán)重程度，在這類感染實(shí)驗(yàn)中，小鼠體重減輕程度較少。感染后第4 天，肺部、心臟和脾臟中病毒載量降低，感染后第6 天，促炎細(xì)胞因子、趨化因子［白細(xì)胞介素-6（interleukin -6，IL-6）、C-X-C 基序趨化因子配體10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）、C-X-C 基序趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、C-C 基序趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、C-C 基序趨化因子配體5（C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）］在肺部表達(dá)降低，免疫細(xì)胞在肺部浸潤(rùn)減少。

1.3CRISPR 系統(tǒng) 利用CRISPR ／ Cas9 開發(fā)了一種表達(dá)人源化hACE2 小鼠模型，通過嵌入與紅色熒光蛋白TdTomato 相關(guān)的hACE2 使mACE2 表達(dá)中斷［24］。在該系統(tǒng)中，hACE2 在mACE2 啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，主要表達(dá)部位為肺臟和腎臟，且與野生型小鼠類似。人源化hACE2 小鼠感染SARS-CoV-2后，在其大腦、氣管和肺部檢測(cè)出高的病毒載量，幼齡鼠與老齡鼠肺部檢測(cè)到的病毒載量基本一致。但與感染的幼齡鼠相比，感染的老齡鼠肺內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且存在肺泡增厚、血管損傷和出血等現(xiàn)象。胃內(nèi)感染試驗(yàn)可在氣管和肺部檢測(cè)出高病毒載量，表明口服攻毒途徑也可導(dǎo)致肺部感染。

1.4小鼠適應(yīng)性病毒株 病毒可通過連續(xù)傳代、靶向突變感染野生型小鼠。這種方式降低了研究人員的生物風(fēng)險(xiǎn)，且更類似于小鼠的自然宿主-病原體相互作用。但由于小鼠的適應(yīng)性導(dǎo)致這種感染方式不能完全展現(xiàn)人類疾病的相關(guān)癥狀，因此，這種感染方式產(chǎn)生的模型使用受限。

這種方法已用于研究SARA-CoV。SARA-CoV 通過連續(xù)在幼齡BALB ／ c 小鼠的呼吸道傳代，可產(chǎn)生小鼠適應(yīng)性病毒株SARS-CoV（MA15），小鼠感染該病毒株的第3 天開始陸續(xù)死亡［25］。感染后第1 天，在肺部檢測(cè)到高病毒載量，在大腦、肝臟和脾臟中也檢測(cè)到了一定的病毒載量，這可能是由于其通過病毒血癥進(jìn)入到肺以外的其他臟器，同時(shí)在氣道及肺泡中可觀察到淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及壞死細(xì)胞碎片。另一種小鼠適應(yīng)性病毒株SARS-CoV（v2163）是通過連續(xù)感染6 周齡的BALB ／ c 小鼠產(chǎn)生的［26］。這種病毒感染可導(dǎo)致比MA15 更嚴(yán)重的癥狀，產(chǎn)生更高的死亡率，出現(xiàn)更嚴(yán)重的免疫反應(yīng)和肺部病變。

有研究表明，小鼠適應(yīng)性SARS-CoV-2 在連續(xù)傳播感染后，S 蛋白的受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）發(fā)生了突變，可有效感染幼齡和老齡野生型BALB ／ c 小鼠［27］。感染后第7 天，小鼠肺部檢測(cè)到高的病毒載量，并表現(xiàn)出輕度肺炎，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺氣管損傷、出血和內(nèi)皮細(xì)胞變性。該模型用于評(píng)估RBD-Fc 疫苗的效果，產(chǎn)生了中和抗體，從而有效防止了感染。類似的研究也表明，修飾SARS-CoV-2 S 蛋白的RBD 有助于S 蛋白與mACE2有效結(jié)合，更利于病毒入侵宿主細(xì)胞［28］。感染這種病毒后，與幼齡鼠相比，老齡鼠的體重減輕和肺功能下降較明顯，與人類患病表型具有相似性。

不同SARS-CoV-2 易感轉(zhuǎn)基因小鼠模型見表1。

表1 SARS-CoV-2 易感轉(zhuǎn)基因小鼠模型的比較Tab.1 Comparison of SARS-CoV-2 susceptible transgenic mouse models

2 敘利亞倉(cāng)鼠（Syrian hamster）模型

幾十年來，敘利亞倉(cāng)鼠一直應(yīng)用于由呼吸道病毒（如SARS、腺病毒和流感病毒）引起的感染研究。與SARS-CoV-2 S 蛋白受體結(jié)合域相互作用的hACE2序列與敘利亞倉(cāng)鼠的ACE2 序列通過生物信息學(xué)軟件比對(duì)顯示，在結(jié)合界面上僅有3 ~ 4 個(gè)突變，具有較高的相似度［28］。此外，前期的動(dòng)物研究表明，同樣使用ACE2 受體進(jìn)入細(xì)胞的SARS-CoV 也可在敘利亞倉(cāng)鼠中穩(wěn)定復(fù)制［28］。表明敘利亞倉(cāng)鼠也可作為研究SARS-CoV-2 感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

敘利亞倉(cāng)鼠通過滴鼻感染病毒后，表現(xiàn)出輕度至中度疾病癥狀，體重在感染后1 ～2 d 開始逐漸減輕。感染不同SARS-CoV-2 毒株的敘利亞倉(cāng)鼠均顯示出呼吸困難的癥狀［29-30］，部分還表現(xiàn)出了一些其他癥狀，如嗜睡、毛皮豎起和弓背姿勢(shì)［31］，感染2 周后，敘利亞倉(cāng)鼠通常會(huì)恢復(fù)健康。敘利亞倉(cāng)鼠與人類感染SARS-CoV-2 后臨床表現(xiàn)相似，其中老齡鼠和雄性鼠比年輕和雌性鼠更易出現(xiàn)嚴(yán)重的疾病癥狀［30］。感染SARS-CoV-2 后，可在敘利亞倉(cāng)鼠呼吸道和其他組織（如小腸）中檢測(cè)到病毒RNA，這有助于評(píng)估治療藥物和疫苗對(duì)疾病的防治效果。同時(shí)，研究人員還觀察到病毒向同籠敘利亞倉(cāng)鼠的傳播［31］，表明敘利亞倉(cāng)鼠也可用于研究疾病的傳播。通過病理組織檢測(cè)，感染SARS-CoV-2 后第2 天開始可在敘利亞倉(cāng)鼠的上、下呼吸道中檢測(cè)到大量病毒抗原和細(xì)胞凋亡的炎癥浸潤(rùn)，感染后第4 天最嚴(yán)重，炎癥在感染后第14 天消退。在非呼吸道組織中，只有腸道檢測(cè)出病毒抗原表達(dá)，疾病導(dǎo)致了嚴(yán)重的上皮細(xì)胞壞死、腸絨毛受損和變形。

BOUDEWIJNS 等［32］發(fā)現(xiàn)，在敘利亞倉(cāng)鼠中觀察到的SARS-CoV-2 誘導(dǎo)的肺部病變似乎是由宿主免疫反應(yīng)引起的。多項(xiàng)研究表明，先天免疫系統(tǒng)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致感染SARS-CoV-2 后出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，先天免疫系統(tǒng)過度活躍導(dǎo)致的細(xì)胞因子風(fēng)暴，被認(rèn)為是感染SARS-CoV-2 后出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀的病理驅(qū)動(dòng)因素。此外，由于適應(yīng)性免疫功能障礙導(dǎo)致的T 細(xì)胞免疫抑制可能會(huì)增加SARS-CoV-2 全身傳播的可能性［31］。對(duì)倉(cāng)鼠的免疫學(xué)研究表明，Ⅰ型IFN 反應(yīng)，尤其是STAT 2 信號(hào)通路是SARS-CoV-2 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。一項(xiàng)針對(duì)Stat1-／-敘利亞倉(cāng)鼠的研究表明，STAT2 信號(hào)促進(jìn)了SARS-CoV-2 引起的肺部嚴(yán)重?fù)p傷，但抑制了病毒的全身傳播［29］。一項(xiàng)針對(duì)Rag1-／-敘利亞倉(cāng)鼠的研究表明，在SARS-CoV-2 感染后的早期，功能性B 和／ 或T 細(xì)胞的缺失會(huì)加劇發(fā)?。?7］。相關(guān)研究表明，感染SARS-CoV-2 的敘利亞倉(cāng)鼠可產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)，并在14 d 內(nèi)產(chǎn)生有效的中和抗體（neutralizing antibodies，NAbs），可保護(hù)其免受再次感染［31，34］。此外，注射恢復(fù)期敘利亞倉(cāng)鼠血清對(duì)未感染敘利亞倉(cāng)鼠起到了保護(hù)作用，并降低了感染SARS-CoV-2 敘利亞倉(cāng)鼠肺和鼻甲組織中的病毒載量［31］。

盡管在感染SARS-CoV-2 的敘利亞倉(cāng)鼠模型中觀察到與人類感染SARS-CoV-2 后相似的病理現(xiàn)象和免疫反應(yīng)，但敘利亞倉(cāng)鼠并不會(huì)死于SARS-CoV-2感染，這與人類臨床特征不符。最近研究人員發(fā)現(xiàn)，另一種倉(cāng)鼠模型——羅博羅夫斯基侏儒倉(cāng)鼠（Phodopus roborovskii）對(duì)SARS-CoV-2 高度敏感［35］。這種倉(cāng)鼠模型疾病發(fā)作更迅速，臨床癥狀更嚴(yán)重，與人類感染SARS-CoV-2 過程中觀察到的嚴(yán)重臨床和病理癥狀更加相似。但除了需人道安樂死（體重減少15%以上）的倉(cāng)鼠外，在roborovskii 侏儒倉(cāng)鼠中也未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

3 應(yīng)用及面臨的挑戰(zhàn)

通過轉(zhuǎn)基因、腺病毒、CRISPR 等系統(tǒng)進(jìn)行修飾的小鼠或感染了小鼠適應(yīng)病毒的野生型小鼠是研究中應(yīng)用最為廣泛的，因?yàn)樵炷：?jiǎn)單、成本低，同時(shí)還具有類似人類肺部炎癥、組織病理學(xué)病變等典型特征。與小鼠相比，可用于敘利亞倉(cāng)鼠的研究試劑有限，如缺少用于檢查宿主免疫反應(yīng)的免疫試劑，特別是缺少用于蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫試劑。盡管存在這些限制，敘利亞倉(cāng)鼠仍憑借其具有與人類相同的病毒發(fā)病機(jī)制和免疫反應(yīng)，及能夠傳播病毒的特點(diǎn)，成為目前研究中一種重要的SARS-CoV-2 動(dòng)物模型。

感染動(dòng)物模型的預(yù)防與治療措施在臨床試驗(yàn)中的可行性取決于其物種特征。有研究表明，抑制病毒RNA 依賴性RNA 聚合酶的藥物-Remdesivir（GS-5734）在SARS-CoV 和MERS-CoV 感染小鼠模型中具有療效［36］；一種重組人源單克隆抗體在感染SARSCoV-2 的hACE2 小鼠模型中顯示出較好的治療與預(yù)防效果［37］；而另一種中和抗體在感染SARS-CoV-2 的金黃地鼠模型中具有較好的效果［38］。同時(shí)，這些動(dòng)物模型在藥代與藥物劑量方面提供了相關(guān)數(shù)據(jù)，使相關(guān)藥物轉(zhuǎn)換至人體研究成為可行［36］。

SARS-CoV-2 感染動(dòng)物模型對(duì)研發(fā)具有保護(hù)性作用的疫苗十分重要。感染動(dòng)物模型是篩選潛在藥物的一種快速方法。在小鼠模型中，已驗(yàn)證不同的蛋白、RNA 和病毒性疫苗可產(chǎn)生抗SARS-CoV-2 抗體，同時(shí)，這些抗體在體外也可防止人源細(xì)胞感染SARS-CoV-2［39］。同樣的，S 蛋白相關(guān)的納米藥物可在小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體及激活CD4、CD8 T 細(xì)胞來抵抗SARS-CoV-2［40］。目前已有130 多種疫苗處于研發(fā)中，動(dòng)物模型對(duì)于在其中篩選適用于人體的疫苗十分重要。

目前的COVID-19 疫苗通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生靶向SARS-CoV-2 刺突蛋白的中和抗體，從而起到一定的保護(hù)作用。但由于新毒株的出現(xiàn)（如起源于英國(guó)的B.1.1.7、巴西的P.1、南非的B.1.351、印度株B.1.617.1）及其刺突蛋白的變異產(chǎn)生的變異株，現(xiàn)有疫苗的有效性可能會(huì)受到影響。動(dòng)物模型的發(fā)展至關(guān)重要，有助于深入了解其發(fā)病機(jī)制，以及加快候選疫苗和治療藥物的研發(fā)，對(duì)于阻止新的變異毒株流行蔓延起到關(guān)鍵作用。