基于聚合物分析系統(tǒng)流感疫苗裂解效果檢測方法的建立及驗證

郭晶晶，宋曉紅，劉華擎，陳秋蘭，張穎，王潔如

1.北京科興生物制品有限公司，北京 100085；2.島津企業(yè)管理（中國）有限公司，北京 100020

流感病毒裂解疫苗是用WHO 推薦并經(jīng)國家藥品管理部門批準(zhǔn)的流感病毒株接種雞胚，通過培養(yǎng)、收獲，滅活、純化、裂解等步驟制成的生物制品，廣泛應(yīng)用于預(yù)防流感病毒引起的流行性感冒。流感病毒屬正黏病毒科，單股負(fù)鏈RNA 病毒，由核衣殼和包膜組成［1-2］。包膜上嵌有血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA），可刺激機體產(chǎn)生中和抗體和抑制病毒在體內(nèi)擴散的保護性抗體［3-5］。病毒中的類脂和內(nèi)部蛋白等成分易引發(fā)不良反應(yīng)［6］。流感病毒裂解疫苗生產(chǎn)過程中，常使用去氧膽酸鈉、TritonX100、TritenN101、乙醚和聚山梨酯80 等裂解劑，病毒的裂解程度（已裂解病毒占病毒總量的百分?jǐn)?shù)）直接影響疫苗的免疫原性和安全性［6-9］。目前，通用的裂解效果評價方法是電鏡觀察法［10］，雖具有可直接觀察病毒顆粒微觀結(jié)構(gòu)和高分辨率的優(yōu)點，但也存在取樣量小和視野選擇受限等問題，導(dǎo)致裂解程度無法定量，結(jié)果不準(zhǔn)確。

聚合物分析系統(tǒng)（Aggregates Sizer）是一種高穩(wěn)定、高靈敏和自動化程度高的分析工具，該系統(tǒng)是以半導(dǎo)體激光為光源，依據(jù)光的散射與衍射現(xiàn)象建立數(shù)學(xué)模型，散射與衍射的光能角度只與顆粒粒徑有關(guān)［11］。當(dāng)檢測對象為顆粒群時，不同粒徑顆粒的數(shù)量決定了對應(yīng)各特定角獲得的光能量，各特定角光能量在總光能量中所占比例可反映各顆粒的分布豐度。Aggregates Sizer 可檢測7 nm ～800 μm 范圍粒子的粒徑，且可定量檢測40 nm ～20 μm 范圍內(nèi)生物制藥顆粒物的濃度，并可檢測顆粒物的形成過程及濃度變化［12］。通過建立病毒顆粒分布豐度-裂解程度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，評價流感病毒的裂解效果。因此，本研究旨在基于Aggre-gates Sizer 系統(tǒng)建立一種初步評價病毒裂解程度的新方法，從而提高流感疫苗病毒裂解程度數(shù)據(jù)的可靠性。

1 材料與方法

1.1標(biāo)準(zhǔn)品 流感病毒裂解疫苗原液A（由裂解液制得，病毒顆粒已裂解）和B（由裂解前純化液制得，病毒顆粒未裂解）均由北京科興生物制品有限公司提供。

1.2主要儀器 Aggregates Sizer 系統(tǒng)［含高濃度池測定裝置SALD-HC75S，樣品量0.125 mL，采集軟件WingSALD bio-7500 for English（US）V3.3］購自廠家島津企業(yè)管理（中國）有限公司北京分公司。

1.3裂解效果評價用樣本的制備 分別取流感病毒裂解疫苗原液A 0.6、0.7、0.8、0.9 和1.0 mL 于離心管中，依次加入0.4、0.3、0.2、0.1 及0 mL 的原液B，配制成裂解程度分別為60%、70%、80%、90%和100%的系列工作液。另取60%、80%和100%裂解程度的工作液作為質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本。

1.4分析方法 用Aggregates Sizer 系統(tǒng)檢測待測物顆粒粒徑、濃度和分布，光源發(fā)出的光照射到樣品上產(chǎn)生散射衍射光和散射光，WingSALD bio-7500 for English（US）V3.3 軟件采集散射衍射光光強數(shù)據(jù)，并根據(jù)光強數(shù)據(jù)換算得出顆粒粒徑大小和分布數(shù)據(jù)，根據(jù)WingSALD bio-7500 for English（US）V3.3 內(nèi)置曲線，計算出不同粒徑顆粒的分布豐度。

1.5病毒顆粒粒徑檢測 將原液B 稀釋4 倍，加入至Aggregates Sizer 系統(tǒng)的樣品池中，按1.4 項方法進行檢測，得到各粒徑的分布豐度。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 取裂解程度為60%、70%、80%、90%和100%的系列工作液，分別加入Aggregates Sizer 系統(tǒng)樣品池中，按1.4 項方法測定，以病毒顆粒累積分布豐度為縱坐標(biāo)，裂解程度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，建立回歸方程，計算相關(guān)系數(shù)（r2）。

1.7方法的驗證 取不同裂解程度的QC 樣本進行檢測分析，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算QC 樣本的裂解程度，重復(fù)3 次，準(zhǔn)確性以相對誤差（relative error，RE）表示，精密性以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

1.8數(shù)據(jù)分析 所有實驗數(shù)據(jù)均采用Excel 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1病毒顆粒粒徑 在0.04 ～20 μm 粒徑檢測范圍內(nèi)，原液B 中主要分布0.04 ～0.3 μm 粒徑的顆粒，且以約100 nm 粒徑的顆粒居多，見圖1。

圖1 不同粒徑粒子的分布豐度Fig.1 Distribution abundance of particles at different sizes

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 60%、70%、80%、90%和100%裂解程度工作液在0.04 ～20 μm 粒徑檢測范圍內(nèi)，不同粒徑顆粒的分布豐度和累積分布豐度逐漸降低，見圖2。不同裂解程度系列工作液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，工作液在60% ～100%裂解程度范圍內(nèi)與病毒顆粒累積分布豐度呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= -2 600x+ 2 610，r2為0.995。

圖2 不同裂解程度工作液檢測圖Fig.2 Determination images of working solutions at different lysis degrees

圖3 不同裂解程度系列工作液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve for working solutions at different lysis degrees

2.3方法的驗證 不同裂解程度QC 樣本經(jīng)3 次檢測的RE均＜2%，RSD均＜0.05%，見圖4 和表1。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密性。

表1 方法準(zhǔn)確性及精密性驗證結(jié)果Tab.1 Verification for accuracy and precision of developed method

圖4 QC 樣本檢測圖Fig.4 Determination images of QC samples

3 討 論

本研究采用Aggregates Sizer 系統(tǒng)建立了流感疫苗裂解效果的檢測方法，并初步對該方法進行了驗證。檢測結(jié)果表明，流感病毒顆粒主要分布在0.04 ～0.3 μm 范圍內(nèi)，且較集中分布于約100 nm；工作液在60% ～100%裂解程度范圍內(nèi)與病毒顆粒累積分布豐度呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-2 600x+2 610，r2為0.995；該方法準(zhǔn)確性驗證RE均＜2%，精密性驗證RSD均＜0.05%，表明準(zhǔn)確度和精密度較高，符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的要求［13］，可用于病毒裂解疫苗的裂解效果評價。

有文獻報道，流感病毒通常為球形顆粒，粒徑為80 ～120 nm，本文結(jié)果與報道相符［14］。研究發(fā)現(xiàn)，存在少量的絲狀結(jié)構(gòu)病毒顆粒，可能是由于在0.3 ～0.8 μm 間出現(xiàn)響應(yīng)值的原因，但總體所占比重較少。提示在后續(xù)的方法開發(fā)中應(yīng)主要對0.04 ～0.3 μm 粒徑顆粒進行統(tǒng)計分析，并從顆粒結(jié)構(gòu)和團聚等多個角度探究0.3 ～0.8 μm 間出現(xiàn)響應(yīng)值原因，以作出相應(yīng)改進措施。研究過程中，對50%及小于50%裂解程度工作液進行檢測，出現(xiàn)多重散射，信號偏移，造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線裂解程度的檢測下限為60%（未在正文表述）。

本研究建立了一種基于Aggregates Sizer 系統(tǒng)分析病毒裂解程度的方法，檢測方便快捷，受限少，并可監(jiān)測整個生產(chǎn)過程中病毒顆粒的粒徑分布及濃度改變，為疫苗行業(yè)中裂解疫苗的病毒裂解效果評價提供一個研究方向。該方法仍處于初步開發(fā)中，存在許多不足。如尚未對基質(zhì)效應(yīng)進行考察，即經(jīng)培養(yǎng)和純化工序得到的空白基質(zhì)液，是否會對病毒顆粒粒徑的檢測產(chǎn)生干擾尚未明確。根據(jù)《中國藥典》三部（2020 版）規(guī)定，采用柱色譜法或蔗糖密度梯度離心法及其他適宜方法進行純化得到的疫苗原液中總蛋白含量不高于血凝素含量的4.5 倍［15］，嚴(yán)格控制除有效成分血凝素外其他雜蛋白的含量，激光粒度儀檢測顆粒濃度的最低粒徑為0.04 μm，推測空白基質(zhì)可能不會對病毒粒徑檢測產(chǎn)生干擾。因此，后續(xù)仍需對該方法進行深入研究。