麻疹病毒作為溶瘤病毒的研究進(jìn)展

黨昱東，張欣 綜述，馬雷鈞 審校

上海生物制品研究所有限責(zé)任公司，上海 200051

惡性腫瘤以異常且不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲為主要特征，且能夠逃避凋亡機(jī)制［1］，是造成人類(lèi)死亡的重要原因之一。目前的治療手段如手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療等均存在一定局限性，迫切需要尋找新的治療方法。

溶瘤病毒是一類(lèi)具有復(fù)制能力的腫瘤殺傷型病毒，是腫瘤的新型療法之一，其抗腫瘤作用包括直接的腫瘤選擇性溶瘤作用以及激活宿主先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，有良好的應(yīng)用前景。最早被研究并使用的溶瘤病毒是人腺病毒，其他病毒如麻疹病毒（measles virus，MV）、單純皰疹病毒、M1 病毒、腺病毒、牛痘病毒和新城疫病毒等也被視為潛在的候選［2］。迄今為止，已有3 種可用于治療癌癥的溶瘤病毒獲得批準(zhǔn)上市，分別為在拉脫維亞、喬治亞州和亞美尼亞批準(zhǔn)的Rigvir（源自腸道病毒ECHO-7），在中國(guó)批準(zhǔn)的腺病毒Oncorine H101（由腺病毒經(jīng)基因修飾獲得），在美國(guó)批準(zhǔn)的T-VEC（由單純皰疹病毒經(jīng)基因改造獲得）［3］。理想的溶瘤病毒應(yīng)具有復(fù)制速度快、細(xì)胞病變效應(yīng)高等特性，同時(shí)選擇性破壞癌組織而不對(duì)正常組織造成過(guò)度損害［4］。MV 作為具有溶瘤活性的病毒之一，近年來(lái)獲得了研究人員的極大關(guān)注，臨床前研究和臨床試驗(yàn)證實(shí)了MV 對(duì)于多種腫瘤均具有良好的治療作用。

本文闡述了MV 作為溶瘤病毒的抗腫瘤機(jī)制及活性，重點(diǎn)介紹了基因工程改造對(duì)MV 溶瘤活性的影響，并對(duì)麻疹溶瘤病毒的研究進(jìn)展作一展望。

1 MV 概述

MV 屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，多呈球形，核酸組成為不分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA，基因組由6 個(gè)基因組成，見(jiàn)圖1，分別編碼6 種結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、M、F、H、L）以及2 種非結(jié)構(gòu)蛋白（C、V）。其中，病毒表面突出的F 和H 蛋白負(fù)責(zé)病毒的黏附和入侵。H 蛋白與病毒受體的結(jié)合導(dǎo)致H 和F 構(gòu)象發(fā)生變化，F(xiàn) 蛋白則介導(dǎo)膜融合［5］。目前認(rèn)為與H 蛋白作用的MV 受體有3 種：信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子（SLAM ／ CD150）、CD46 和nectin-4（也稱(chēng)為PVRL4）。其中，CD46 迄今為止在所測(cè)試癌細(xì)胞表面基本均高表達(dá)，如間皮瘤細(xì)胞［6］、惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤細(xì)胞［7］等，給麻疹溶瘤病毒的靶向性識(shí)別和入侵創(chuàng)造了條件。

圖1 MV 基因組（A）及結(jié)構(gòu)蛋白（B）Fig.1 Genome and structural protein of MV

MV 的抗腫瘤活性可追溯至1949 年發(fā)表的第1例關(guān)于野生型MV 感染后霍奇金淋巴瘤消退的病例報(bào)告［8］。近年來(lái)，越來(lái)越多的臨床前研究表明，MV通過(guò)形成合胞體發(fā)揮溶瘤活性，可優(yōu)先感染、破壞多種癌癥組織［9］，并驗(yàn)證了其安全性［10］。LAL 等［11］評(píng)估了注射麻疹疫苗和MV 易感轉(zhuǎn)基因小鼠腦脊液中MV-人類(lèi)碘化鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sodium iodide symporter，NIS）的安全性，未在任何接受治療的動(dòng)物中觀察到任何與麻疹相關(guān)的毒性作用或行為異常，且所有的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)和血液化學(xué)分析結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。

2 MV 的抗腫瘤機(jī)制

MV 可在細(xì)胞水平和全身水平介導(dǎo)抗腫瘤作用。MV 的抗腫瘤機(jī)制包括直接感染并通過(guò)自噬或凋亡途徑裂解腫瘤細(xì)胞，裂解的腫瘤細(xì)胞作為抗原激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，見(jiàn)圖2。在細(xì)胞層面，MV 通過(guò)感染腫瘤細(xì)胞形成合胞體，使細(xì)胞膜的完整性受到破壞，繼而引發(fā)細(xì)胞死亡［12］。但MV 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡類(lèi)型尚不清楚。早期的研究表明，MV 感染后細(xì)胞發(fā)生凋亡，但有研究提示，自噬也是細(xì)胞死亡的一種重要形式［13-14］。在全身水平上，MV 介導(dǎo)的溶瘤是免疫原性的，麻疹溶瘤病毒的感染可引發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，包括免疫原性細(xì)胞死亡、抗原呈遞細(xì)胞激活、T 細(xì)胞激活和轉(zhuǎn)運(yùn)、效應(yīng)階段幾個(gè)過(guò)程。裂解的腫瘤細(xì)胞釋放出的病毒和腫瘤抗原可再次刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答，使麻疹溶瘤病毒的時(shí)效性得以延長(zhǎng)。MV 與免疫系統(tǒng)的相互作用不局限于DC 和T 細(xì)胞，還包括其他細(xì)胞群，如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。

圖2 MV 的抗腫瘤機(jī)制Fig.2 Anti-tumor mechanism of MV

機(jī)體的抗病毒反應(yīng)會(huì)在一定程度上限制MV 的溶瘤活性，但在某些情況下，機(jī)體的適應(yīng)性抗病毒反應(yīng)可能有利于溶瘤病毒療法［15］。總體來(lái)說(shuō)，抗腫瘤和抗病毒免疫之間存在復(fù)雜的平衡，二者共同協(xié)調(diào)溶瘤病毒療法的有效性和安全性。

3 MV 的抗腫瘤活性

溶瘤性MV 感染細(xì)胞后形成合胞體，表現(xiàn)出明顯的殺傷力，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抵抗腫瘤生長(zhǎng)、引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮溶瘤效應(yīng)。作為麻疹疫苗用毒株之一的MV-Edm 株在MV 的溶瘤活性研究中應(yīng)用較為廣泛［6］。

溶瘤病毒治療腫瘤的關(guān)鍵是病毒在腫瘤組織中的感染和傳播效率。然而大多數(shù)患者對(duì)MV 具有免疫力，降低了溶瘤性MV 的治療活性。旨在增強(qiáng)溶瘤性MV 療效的方法包括使用細(xì)胞載體作為運(yùn)載工具、將MV 療法與其他治療方式相結(jié)合、操縱免疫系統(tǒng)以保護(hù)病毒免受先天和特異性免疫并刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)［16］、通過(guò)基因操作產(chǎn)生具有理想治療特性的重組MV 等［17］。

3.1傳統(tǒng)MV 的抗腫瘤活性 MV 對(duì)多種腫瘤均有溶瘤效應(yīng)，如非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［14］、伊拉克乳腺癌［18］、多發(fā)性骨髓瘤［19］、間皮瘤［6］、惡性胸膜間皮瘤［20-21］、彌散性髓母細(xì)胞瘤［22］、非典型類(lèi)畸胎瘤樣橫紋肌瘤［23］等。溶瘤性MV 可抑制伊拉克乳腺癌細(xì)胞（尤其是AMJ13 細(xì)胞）的增殖［18］、增加多發(fā)性骨髓瘤患者對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞反應(yīng)［19］、縮小彌散性髓母細(xì)胞瘤小鼠模型的腫瘤體積并延長(zhǎng)其生存期［22］、延長(zhǎng)顱內(nèi)和轉(zhuǎn)移性非典型類(lèi)畸胎瘤樣橫紋肌瘤（AT ／ RT）動(dòng)物的存活期［23］。XIA 等［14］研究表明，麻疹溶瘤病毒可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體持續(xù)性自噬、減少細(xì)胞色素C 釋放，使病毒不斷復(fù)制，最終由于ATP 耗盡而導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞壞死；JACOBSON 等［6］發(fā)現(xiàn)，麻疹溶瘤病毒通過(guò)表面高表達(dá)的CD46 進(jìn)入間皮瘤細(xì)胞，降低細(xì)胞活力、抑制增殖并引起細(xì)胞凋亡；ACHARD 等［20］及DELAUNAY 等［21］的研究共同提示，MV 利用Ⅰ型干擾素（IFNⅠ）反應(yīng)缺陷［最常見(jiàn)的為IFNⅠ基因的純合缺失（homozygous deletion，HD）］治療惡性胸膜間皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）；FONTENEAU 等［24］及ACHARD 等［25］研究表明，MV 通過(guò)人髓樣和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）介導(dǎo)細(xì)胞毒性，刺激樹(shù)突細(xì)胞以引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

了解腫瘤、溶瘤病毒、局部微環(huán)境和免疫反應(yīng)之間的動(dòng)態(tài)相互作用，進(jìn)而探究MV 在腫瘤內(nèi)擴(kuò)散的動(dòng)力學(xué)具有重要意義。KEMLER 等［26］通過(guò)背側(cè)皮膚折疊腔的活體成像系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞以單細(xì)胞分辨率進(jìn)行連續(xù)的非侵入性成像，發(fā)現(xiàn)雖然融合型和低融合型MV 均形成合胞體，但其復(fù)制動(dòng)力學(xué)和表型差異很大，且細(xì)胞間的空間關(guān)系對(duì)溶瘤效果有較大影響。

另外，針對(duì)H 蛋白的抗麻疹中和抗體是MV 溶瘤效果的主要障礙。針對(duì)這一問(wèn)題，可采用特定類(lèi)型的細(xì)胞作為病毒載體，需要注意的是，加載持續(xù)時(shí)間是載體細(xì)胞中H 蛋白表達(dá)的主要決定因素［27］；XU等［28］發(fā)現(xiàn)，不可復(fù)制的MV 也可充當(dāng)中和抗MV 抗體的誘餌，使溶瘤性MV 保持抗腫瘤活性；MV 也可觸發(fā)SQSTM1 ／ p62 介導(dǎo)的線粒體自噬，從而導(dǎo)致線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（mitochondrial antiviral signaling，MAVS）減少，削弱DDX58 ／ RIG-I 樣受體信號(hào)傳導(dǎo)而增強(qiáng)MV 復(fù)制，進(jìn)而削弱先天免疫應(yīng)答［13］。

3.2基因工程改造MV 的抗腫瘤能力

腫瘤特異性和溶瘤效力是治療效應(yīng)的關(guān)鍵決定因素［29］，基因修飾和改造可改善溶瘤病毒的腫瘤選擇性和遞送能力，提高治療效果，見(jiàn)表1。

表1 基因工程改造的重組MV 及靶向的腫瘤Tab.1 Gene engineering-modified recombinant MV and its target tumors

3.2.1監(jiān)測(cè)MV 的體內(nèi)定位 基因工程改造可使MV-Edm 表達(dá)可追蹤的蛋白質(zhì)，從而監(jiān)測(cè)MV 在體內(nèi)的定位及擴(kuò)散。如表達(dá)人類(lèi)癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的MV-CEA，病毒中循環(huán)CEA水平的測(cè)定可提供患者在接受治療時(shí)基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵數(shù)據(jù)，該技術(shù)已在臨床試驗(yàn)中展開(kāi)應(yīng)用（NCT00390299）。MV-NIS 通過(guò)表達(dá)NIS，使MV 在體內(nèi)的生物分布可視化，從而對(duì)腫瘤內(nèi)的病毒進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)定［30］，解決了體內(nèi)數(shù)據(jù)的缺乏使研究模型難以參數(shù)化的問(wèn)題。SCHEUBECK 等［31］將綠色熒光蛋白（GFP）插入MV 基因組，使MV 表達(dá)GFP 并根據(jù)熒光強(qiáng)度探究了饑餓處理對(duì)MV 溶瘤效力的影響。

3.2.2調(diào)控MV 的腫瘤細(xì)胞靶向性 利用microRNA及其靶序列的互補(bǔ)性及利用受體與配體的特異性結(jié)合對(duì)MV 進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)計(jì)和改造等方式調(diào)控MV 的腫瘤細(xì)胞靶向性，可保證MV 感染的特異性［32-33］。

神經(jīng)元特異性microRNA 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中下調(diào)，而在正常腦組織中高表達(dá)。LEBER 等［34］發(fā)現(xiàn)，microRNA 敏感的病毒能完全抵抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的異種移植物，且microRNA 介導(dǎo)的抑制作用避免了易受MV 感染的遺傳修飾小鼠受到潛在的致命性腦內(nèi)攻擊。表明插入microRNA 靶序列可控制并重塑病毒的細(xì)胞向性，且不會(huì)損害溶瘤功效；但基于microRNA 的載體控制機(jī)制比較復(fù)雜，不僅僅依賴(lài)于microRNA 與microRNA 靶位點(diǎn)（microRNA target site，miRTS）之間的互補(bǔ)性，尚有待進(jìn)一步研究［29，35］。

水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的受體擴(kuò)展或嵌合靶向CD133 的MV（MV-CD133）［36］、以腫瘤標(biāo)志物人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）／ neu 或癌癥干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）標(biāo)志物上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）作為靶受體［37］的研究，均證實(shí)了利用受體與配體的特異結(jié)合原理改造MV，從而提高其靶向能力的可行性。另外，MV-CKPint 通過(guò)引入可指導(dǎo)MV 活動(dòng)的胱氨酸結(jié)蛋白（cystine knot protein，CKP），對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、彌漫性橋腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤和黑色素瘤等多種腫瘤均有抵抗效力［38］。

為研究基質(zhì)靶向?qū)τ贛V 在腫瘤模型中溶瘤效果的影響，JING 等［39］開(kāi)發(fā)了一種能同時(shí)感染小鼠基質(zhì)（通過(guò)小鼠uPAR）和人癌（通過(guò)CD46）細(xì)胞的雙靶向溶瘤MV（MV-CD46-muPA）。MV-CD46-muPA能感染、復(fù)制并誘導(dǎo)小鼠和人癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并且比載體或CD46 靶向的MV 療效更高。MSAOUEL等［5］研究表明，在MVN基因的上游攜帶人λ 輕免疫球蛋白鏈轉(zhuǎn)錄單位，可生成腫瘤特異性感染的獨(dú)特標(biāo)記。

3.2.3增強(qiáng)MV 的溶瘤活性 通過(guò)基因重組技術(shù)，MV 可獲得外源治療性基因，隨著病毒的復(fù)制而得以表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮特有的功效。

NIS 既可被追蹤也可作為治療性轉(zhuǎn)基因，當(dāng)與治療性同位素131I 組合使用時(shí)能增強(qiáng)病毒的抗腫瘤功效［8］。MV-NIS 可觸發(fā)針對(duì)腫瘤的細(xì)胞免疫且具有良好的耐受性，對(duì)紫杉醇和鉑耐藥的卵巢癌［40］以及惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）衍生的腫瘤［7］具有良好的臨床治療效果。另外，帶有野生型MV 毒株IC-B 的P基因的重組MV［9］、帶有BNiP3（人類(lèi)的促凋亡基因）的重組MV［41］、可表達(dá)內(nèi)皮抑素和血管抑素的融合蛋白的重組MV［42］、用反向遺傳學(xué)生成無(wú)法選擇性利用SLAM 而依賴(lài)于nectin-4（PVRL4）的表達(dá)感染的重組MV（rMV-SLAMblind）［43-44］、用新型生物靶標(biāo)［尿激酶受體（urokinase type plasminogen activator receptor，uPAR）］的重組MV（MV-uPA）［45］，均能明顯減弱細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移，表現(xiàn)出增強(qiáng)的減弱裂解腫瘤細(xì)胞的作用、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的能力以及提高的擴(kuò)散效率。LV 等［46］發(fā)現(xiàn)，另一種MV 毒株rMV-Hu191通過(guò)誘導(dǎo)caspase 依賴(lài)性凋亡，誘導(dǎo)胃癌（gastric carcinoma，GC）中細(xì)胞病變及抑制腫瘤增殖，在病毒的成功感染以及隨后的細(xì)胞凋亡過(guò)程中脂質(zhì)筏的完整性十分重要。

3.2.4規(guī)避宿主的抗病毒免疫反應(yīng) 病毒療法的有效性受到宿主免疫反應(yīng)的限制，調(diào)節(jié)或規(guī)避抗麻疹免疫有3 種主要策略：使用細(xì)胞作為溶瘤性MV 的載體；與免疫抑制藥物聯(lián)合作用；使用野生型MV 基因武裝MV-Edm 株來(lái)抑制對(duì)病毒感染的先天免疫應(yīng)答。

NOSAKI 等［47］研究表明，具有野生型MV 株的N、P和L基因的MV-NPL 與離子聚合物逐層沉積的多層病毒涂層方法結(jié)合使用后，無(wú)論是在體內(nèi)還是體外，溶瘤活性均有所提高。表達(dá)中性粒細(xì)胞激活蛋白（neutrophil-activating protein，NAP）的重組MV［48］、表達(dá)細(xì)胞因子粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony factor，GM-CSF）的MV［49］、編碼免疫調(diào)節(jié)劑的麻疹Schwarz／Moraten 疫苗株［50］、編碼白介素-12 的MV（MeVac FmIL-12）［51］均可增強(qiáng)抗癌免疫反應(yīng)，具體表現(xiàn)為刺激促炎細(xì)胞因子釋放、支持腫瘤免疫應(yīng)答不同階段、增強(qiáng)腫瘤靶標(biāo)的嗜中性粒細(xì)胞反應(yīng)、導(dǎo)致TRAIL 直接釋放等。LECH等［52］將單鏈抗體（single chain antibody fragment，scFv）或天然存在的配體與病毒表面的H 糖蛋白連接，也可使MV 重新靶向特定腫瘤細(xì)胞，但MV 仍會(huì)被人血清中和，可能是因?yàn)槎鄠€(gè)中和表位需要同時(shí)受到保護(hù)。值得注意的是，基因重組的MV 誘發(fā)的抗腫瘤T 細(xì)胞反應(yīng)會(huì)受到免疫檢查點(diǎn)尤其是programmed death ligand 1（PD-L1）的抑制。因此，免疫檢查點(diǎn)抑制劑與麻疹溶瘤病毒結(jié)合可提高溶瘤效果。

4 總結(jié)與展望

MV 可通過(guò)不同機(jī)制對(duì)多種腫瘤發(fā)揮溶瘤效應(yīng)。但MV 作為溶瘤病毒療法也存在一定的局限性，如人體內(nèi)廣泛存在的MV 中和抗體可直接與病毒結(jié)合，繼而將病毒移除；麻疹溶瘤病毒的腫瘤組織靶向性以及腫瘤殺傷能力還有待提高；MV 在體內(nèi)溶瘤時(shí)需要較高的滴度，而高滴度的病毒不易獲得等。

在MV 作為溶瘤病毒療法的研究過(guò)程中，需要更深入地了解MV 疫苗的減毒機(jī)制、復(fù)制位點(diǎn)和免疫原性，同時(shí)要特別注意回復(fù)突變等安全性問(wèn)題。另外，監(jiān)測(cè)病毒在體內(nèi)的復(fù)制和傳播可對(duì)治療方案提供指導(dǎo)；針對(duì)MV 溶瘤效力的測(cè)試系統(tǒng)以及生物學(xué)的數(shù)學(xué)模型的建立可為MV 治療策略提供新思路。

溶瘤病毒作為單一療法的功效有一定的限制，與其他治療方法聯(lián)合可增強(qiáng)其抗腫瘤活性，如與化學(xué)治療劑喜樹(shù)堿（camptothecin，Cpt）共同治療可加快乳腺癌細(xì)胞凋亡［54］，與紫杉醇和H2 復(fù)合物聯(lián)合使用會(huì)降低癌細(xì)胞的整體生存能力［42］，與吉西他濱聯(lián)合使用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老［55］，與前藥5-氟胞嘧啶（5-flucytosine，5-FC）聯(lián)合使用增強(qiáng)靶向治療惡性黑色素瘤的效用［56］，也可與CAR-T 技術(shù)結(jié)合使用等，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

除了實(shí)驗(yàn)室的研究工作，臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表2）還將進(jìn)一步增加對(duì)MV 溶瘤活性的了解，并對(duì)病毒療法的臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。作為一種治療腫瘤的新型手段，溶瘤性MV 技術(shù)的研究和成熟必將推動(dòng)人類(lèi)健康事業(yè)的發(fā)展。

表2 麻疹溶瘤病毒的臨床應(yīng)用Tab.2 Clinical application of measles virus as oncolytic virus