人重組沙眼衣原體疫苗的研究進展

尹晨亮，張庶民 綜述，徐穎華，倪現(xiàn)樸 審校

1.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110000；2.北京成大天和生物科技有限公司，北京 102600；3.中國食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室，北京 102629

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，CT）是一種革蘭陰性、專性細胞內(nèi)寄生的原核細胞型微生物，是引起性傳播感染（sexually transmitted infection，STI）的重要病原體，可引發(fā)眼部、生殖道等多個系統(tǒng)疾病。2019 年，我國103 個性病監(jiān)測點統(tǒng)計結(jié)果表明，每10萬人中，有5.532 萬人感染CT［1］。截至2016 年，WHO 統(tǒng)計全球CT 感染者約1.272 億人［2］，嚴(yán)重影響人類生活健康。根據(jù)CT 表面外膜蛋白不同，分為19 種血清型，其中A ～C 血清型引起沙眼；D ～K 血清型主要引起泌尿生殖系統(tǒng)感染，包括男性的非淋菌性尿道炎和附睪炎及女性嚴(yán)重的并發(fā)癥（如不孕不育、異位妊娠和慢性盆腔疼痛）；L1 ～L3 血清型引起直腸感染［3］。CT 與人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染和傳播率的顯著增加有關(guān)［4］。一項來自印度的研究表明，在不孕癥患者中，大部分感染E 型CT，其次是變異體D 和F 型［5］。

目前，對抗CT 感染的主要方法是采用抗生素及對癥治療，但隨著抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)，以及抗生素治療可能會降低機體對CT 免疫反應(yīng)的持久性和產(chǎn)生抗體的能力，導(dǎo)致再感染率上升［6］，因此，安全、有效的CT 疫苗可能成為預(yù)防和控制CT 感染最有效、最經(jīng)濟的方法，實現(xiàn)對易感人群的長期保護，減少傳播并抑制繼發(fā)性感染。前期，由于CT 自身的免疫逃避機制及獨特的雙相發(fā)育周期使CT 疫苗的研發(fā)受到限制［7］。近年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展及對CT 免疫保護機制研究的深入，重組CT 疫苗取得了較大進展，重組CT 疫苗CTH522 已獲批進入Ⅰ期臨床試驗，結(jié)果表明具有良好的安全耐受性和免疫原性。本文就CT 誘導(dǎo)的細胞和體液免疫反應(yīng)、相關(guān)重組疫苗臨床前和臨床試驗研究進展及面臨的挑戰(zhàn)作一綜述，以期為我國CT 疫苗的開發(fā)提供參考。

1 CT 特異性免疫反應(yīng)

1.1細胞免疫 抗原呈遞細胞（antigen presenting cells，APC），如巨噬細胞（macrophages）和樹突狀細胞（dendritic cells，DC）等，在機體抗CT 感染免疫中發(fā)揮重要作用［8］。TLR2、STING 和NLR 等活性分子在DC 內(nèi)攝取CT 時被激活，并產(chǎn)生促炎細胞因子，如IL-1α、IL-6、IL-12、TNF-α、CCR7 和CXCL10，促使DC 抗原呈遞，抗原被攝取后DC 可通過優(yōu)先產(chǎn)生IL-12，誘導(dǎo)未成熟的CD4+T 淋巴細胞活化和分化為主要的Th1 亞群，刺激機體免疫保護機制，形成針對CT 感染的主要保護［9］。

CD4+和CD8+T 細胞在CT 感染期間聚集至感染部位，表達上調(diào)，該結(jié)論已在小鼠和非人類靈長類動物模型中證實，激活CD4+和CD8+T 細胞免疫反應(yīng)是抵抗CT 感染反應(yīng)所必需的［10］。INFγ 也是對抗CT感染的最關(guān)鍵細胞因子之一，能夠激活許多與清除細胞內(nèi)細菌相關(guān)的重要效應(yīng)途徑，如IFNγ 激活吲哚-2，3-雙加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO），下調(diào)細胞的色氨酸水平，抑制CT 的生長；IFNγ 還可誘導(dǎo)一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）上調(diào)，生成NO［11］。NO 是一種抗菌因子，可破壞CT 的DNA，具有細胞毒性［12］。另外，IFNγ 抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體分子在宿主細胞表面的表達，導(dǎo)致宿主細胞內(nèi)鐵濃度的下降，影響CT 的生長。

1.2體液免疫 CT 感染能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體，包括IgG、IgE 和SIgA 等，且能提供一定的保護作用。但研究發(fā)現(xiàn)，這些抗體單獨并不能阻止CT 感染及其病情的惡化，可能與再次感染B 細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與初次感染的CD4+T 細胞變化有關(guān)［13］。另外，MORRISON 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在動物模型體內(nèi)CD4+T細胞消耗完后，缺乏B 細胞的小鼠也并不能清除繼發(fā)感染；同樣在缺乏B 細胞條件下，機體刺激CD4+T 細胞的能力減弱。因此，在抗CT 感染免疫反應(yīng)中，B細胞對啟動T 細胞免疫反應(yīng)是必需的，其中抗體可阻斷CT 對黏膜上皮細胞的黏附，阻斷CT 的進一步感染；抗體介導(dǎo)的調(diào)理作用增強巨噬細胞殺傷CT 的活性［15］。

2 重組疫苗候選抗原臨床前研究

隨著多種組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了一些對CT 感染潛在免疫保護的候選抗原，如多態(tài)性膜蛋白（polymorphic membrane proteins，Pmps）、蛋白酶樣活性因子（chlamydial protease-like activity factor，CPAF）和主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）等，其中基于MOMP 為主要抗原組分的候選疫苗CTH522 已進入Ⅰ期臨床試驗，而其他候選抗原蛋白還主要集中在臨床前研究。

2.1Pmps Pmps 是一組暴露于CT 表面的膜蛋白，通過黏附，在CT 感染的初始階段發(fā)揮重要作用。共發(fā)現(xiàn)CT 有9 種Pmps 亞型（A ~ I）［16］，其中PmpG 亞型能夠結(jié)合其他的抗原蛋白，輔以有效的佐劑可誘導(dǎo)強有力的免疫反應(yīng)［17］。PmpD 亞型作為一種泛中和抗原，能與不同CT 血清型產(chǎn)生交叉保護［18］。另外，研究證實，Pmps 能通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，誘導(dǎo)受感染細胞免疫功能反應(yīng)，產(chǎn)生IL-8、IL-6 等活性分子［16］。

ROSHAN 等［19］用rVCG-PmpD ／ PorB 重組候選疫苗免疫小鼠，可誘導(dǎo)強烈細胞和體液免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的CT 特異性CD4+T 細胞，分泌IFNγ、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-17 及抗PmpD 特異性IgG2c 和IgA 抗體，并保護免疫動物抵抗CT 感染攻擊；同時也證實，免疫接種rVCG-PmpD ／ PorB 可誘導(dǎo)保護性免疫記憶反應(yīng)，即在再次CT 感染攻擊后更快地清除病原體感染。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，小鼠肌內(nèi)和鼻內(nèi)免疫rVCG-PmpD ／ PorB 后，兩種免疫途徑均可誘導(dǎo)CD4+T 細胞分泌相對較高水平的Th1 相關(guān)IFNγ 和較低水平的Th2 相關(guān)IL-4 細胞因子，誘導(dǎo)刺激CD4+T 細胞增殖［20］。rVCG-PmpD ／ PorB 在體內(nèi)與Fms 樣酪氨酸激酶受體Flt3 ／ Flk2 結(jié)合，刺激各種免疫細胞的增殖和分化，產(chǎn)生高滴度抗體。上述研究表明，PmpD 可被抗原呈遞細胞識別、降解、加工并呈遞給CD4+T 細胞，建議可作為CT 疫苗的候選抗原蛋白。

2.2CPAF CPAF 是CT 分泌的一種絲氨酸蛋白酶［21］，一旦進入宿主細胞胞質(zhì)，可作為毒力因子，通過降解宿主抗微生物相關(guān)多肽物質(zhì)，助力CT 侵襲感染宿主。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，CPAF 能夠降解宿主轉(zhuǎn)錄因子，如USF-1 和RFX-5，同時，促凋亡蛋白BH3也被CPAF 降解，阻斷了CT 凋亡［22］。

通過CT 感染患者陽性血清譜分析發(fā)現(xiàn)，CPAF具有潛在免疫原性，同時，在動物模型中也證實，CPAF誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)為依賴IFNγ 的細胞免疫，而非產(chǎn)生抗體的體液免疫［23］。MURTHY 等［24］用重組CPAF（rCPAF）經(jīng)小鼠鼻黏膜接種，可在體內(nèi)引起強烈的Th1 細胞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生INFγ；當(dāng)輔以IL-12 作為佐劑時，可顯著提高CPAF 誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生黏膜IgA 應(yīng)答；隨后該研究還構(gòu)建了一種新的CPAF 融合蛋白（rCPAFep），即由5 個CPAF 的T 細胞反應(yīng)性表位多肽（Cep1-5）融合表達而成，發(fā)現(xiàn)具有與全長的CPAF 相同的免疫原性和保護效果，表明這5 個多肽是CPAF 主要的抗原性保護表位，可作為潛在疫苗抗原成分，同時又可避免CPAF 中其他多肽可能引起不良反應(yīng)的風(fēng)險。

3 進入臨床的重組候選疫苗

MOMP 是一種相對分值質(zhì)量約40 000 的跨膜蛋白，約占CT 外膜的60%。作為一種優(yōu)勢膜蛋白抗原，MOMP 表面有眾多的B 和T 細胞表位，可刺激產(chǎn)生抗體和引發(fā)細胞免疫。GUIFENG 等［25］對天然MOMP（nMOMP）和重組MOMP（rMOMP）輔以佐劑CpG-1826 免疫小鼠后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rMOMP 在動物模型中僅誘導(dǎo)產(chǎn)生部分免疫保護，而nMOMP 的免疫保護效力更強，表明MOMP 免疫保護性可能高度依賴重組蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)。另外，OLSEN 等［26］基于MOMP上可變域VD4 多聚體研發(fā)了一種新rMOMP 候選疫苗，VD4 含有B 細胞表位，該候選疫苗能產(chǎn)生中和D、E、F 和G 型CT 的高滴度的抗體，并能誘導(dǎo)較強的T 細胞反應(yīng)，保護小鼠模型中由CT 感染引起的生殖道病變。

ABRAHAM 等［27］將rMOMP 中所有Cys 殘基用Ser 取代，并融合至4 個血清型D ～G 的可變域上，以此MOMP 為基礎(chǔ)的CTH522 疫苗進入Ⅰ期臨床試驗，該疫苗以CAF01 脂質(zhì)體或氫氧化鋁作為佐劑，受試者（19 ～45 歲的健康女性）分別于4 個月內(nèi)接種3 次結(jié)合佐劑的85 μg CTH522 疫苗，隨后1 個月內(nèi)分別接受2 次30 μg 未結(jié)合佐劑的疫苗，結(jié)果表明，受試者未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，88% ～93%受試者發(fā)生局部不良反應(yīng)（包括注射部位疼痛、壓痛和運動障礙）和全身不良反應(yīng)（包括頭痛、疲勞、不適和肌痛），與目前已批準(zhǔn)上市許可的其他重組亞單位疫苗（如乙肝疫苗）的安全性相當(dāng)［28］。免疫原性分析結(jié)果顯示，兩種結(jié)合不同佐劑疫苗在第1 次接種后均產(chǎn)生了免疫反應(yīng)，第3 次免疫后，CTH522 ∶CAF01 誘導(dǎo)的IgG 滴度比CTH522 ∶Al（OH）3顯著提高了5 ～6 倍（P= 0.009 1），且在整個研究周期中其誘導(dǎo)中和抗體和黏膜IgA 水平及介導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)要優(yōu)于CTH522 ∶Al（OH）3組［27］。表明候選疫苗具有良好的安全耐受性和免疫原性，具有較廣闊應(yīng)用前景。

4 重組CT 疫苗面臨的挑戰(zhàn)

4.1覆蓋CT 血清型廣的候選重組抗原選擇 重組蛋白疫苗的首要問題是選擇廣泛覆蓋、高度保守、具備強免疫原性的靶抗原成分。盡管目前已發(fā)現(xiàn)了許多對不同血清型CT 感染具有一定保護性作用的毒力蛋白，但尚未發(fā)現(xiàn)一種具有激發(fā)機體針對所有血清型CT 定殖、黏附和侵襲全過程免疫保護效能的蛋白。因此，將不同優(yōu)勢抗原組合，盡量覆蓋所有CT 致病性血清型，通過協(xié)同激發(fā)機體保護性免疫或許是重組CT 疫苗抗原組分最佳選擇。近年得到突破性進展、獲批上市重組疫苗包括B 群流腦疫苗、幽門螺旋桿菌疫苗等，均包含了多種重組抗原組分。

4.2適宜免疫佐劑的使用 單獨的重組疫苗抗原組分通常免疫原性較低，需輔以佐劑增強免疫原性。如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV），在相應(yīng)疫苗配方中加入多種佐劑能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)［29］。HONG 等［30］組合3 種不同佐劑（CpG-ODN1826、AbISco-100 或CAF01）配制了重組PmpG-1、PmpE／F-2和MOMP 疫苗，小鼠動物實驗證實，CAF01 作為佐劑可最有效保護BALB ／ c 小鼠免受CT 感染。CAF01是一種陽離子佐劑，由二甲基雙十八烷基胺（Dimethyldioctadecylammonium，DDA）和海藻糖二霉菌酸酯的合成類似物（trehaloseD-(+)-trehalose 6，6'-dibehenate，TDB）組成，DDA 具有增強抗原遞呈和攝取的能力，確?？乖某掷m(xù)釋放；TDB 作為一種免疫增強劑，保護Th1 和Th17 免疫。DDA 與TDB 的結(jié)合能刺激CD4+T 細胞共表達IFNγ 和TNF-α，引起較強的免疫反應(yīng)［31］。

另外，黏膜免疫能夠有效控制CT 的侵入，黏膜佐劑是在感染部位增強免疫的理想選擇。目前，最常用的實驗黏膜佐劑有基于毒素的佐劑，如LT 等。LT 是強效但有毒的黏膜佐劑，使用定點突變的新一代LT佐劑可減輕毒性。LTK63 是一種突變體，在無酶活性和毒性的情況下保持佐劑活性。ORETTA 等［32］使用LTK63 ／ CpG 佐劑與新發(fā)現(xiàn)的T 和B 細胞聯(lián)合給藥，以評估針對CT 疫苗效力，結(jié)果表明，LTK ／ CpG 疫苗佐劑產(chǎn)生較強的Th1 免疫反應(yīng)，其特征是誘導(dǎo)由TNF-α 或IL-2 共同表達的抗原特異性IFNγ。

4.3有效疫苗評價的動物模型 適宜的動物模型對CT 感染的研究及候選疫苗的開發(fā)和評估是必不可少的，目前常用的動物模型包括小鼠、豚鼠、非人靈長類動物等［33］。小鼠是研究生殖器CT 感染和評估候選疫苗最廣泛使用的動物，具有體積小、易于處理、豐富的免疫抗原等優(yōu)勢，目前已報道的有C.trachomatis和C.muridarum兩種小鼠模型。豚鼠模型在CT 感染后的病理、生殖激素對感染的影響及感染的性傳播途徑更接近于人類感染CT 病理變化。豚鼠對再感染的免疫力持續(xù)時間較短，與人類相似，適用于評估潛在的候選疫苗［34］。

由于人類和非人靈長類動物之間具有密切的進化關(guān)系，基因相似度高，因此，使用靈長類動物研究由CT 引起的生殖道疾病最具有可比性。其中研究最多的是獼猴，豬尾獼猴的雌性生殖道的解剖結(jié)構(gòu)和生理特性與人類相似，在自然界也易受人類CT變種的生殖道感染，不需進行預(yù)處理［35-36］。另外，VANROMPAY 等［37］將豬作為研究CT 生殖道感染的大型動物模型進行評估，發(fā)現(xiàn)雌性豬生殖組織中表達的大多數(shù)基因均在人類生殖器組織中普遍表達，且豬自然易感CT。豬動物模型也用于CT DNA 疫苗的評價研究，結(jié)果表明，接種該DNA 疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生對CT 攻擊的免疫保護［37］。但豬模型不適合需要大量動物的基礎(chǔ)研究，是否能作為有效動物模型還有待進一步研究。

5 小結(jié)與展望

CT 感染是全球公共衛(wèi)生問題之一，其獨特又復(fù)雜的雙相發(fā)育機制，使其在感染初始階段可通過黏膜中和抗體進行有效控制［38-39］，包括IgA 和IgG 抗體均可在初始階段阻斷CT 的細胞附著；CT 被內(nèi)化后，分泌Th1 的干擾素IFNγ 細胞在機體抗感染免疫反應(yīng)發(fā)揮重要作用［40］。因此候選疫苗需要能同時激發(fā)Th1 和Th2 免疫反應(yīng)，可能產(chǎn)生更好的保護效果。基于當(dāng)前的研究成果，單個CT 抗原蛋白的免疫作用偏弱，且CT 有多種血清型分類，需要多種保護性蛋白組分的共同作用，通過協(xié)同激發(fā)機體保護性免疫或許是重組CT 疫苗抗原組分的最佳選擇。

新型強有力的佐劑和遞送系統(tǒng)在重組疫苗研發(fā)中也是非常重要的，能夠克服重組蛋白質(zhì)折疊的問題［41］。雖然黏膜佐劑是CT 疫苗開發(fā)的一個新突破，但其制備復(fù)雜，其向人類生殖器黏膜的遞送存在問題，需要進一步的改進和完善。另外，應(yīng)需要選擇除小鼠以外的動物模型進行候選疫苗評價研究，如獼猴和豚鼠等動物模型評估有效的疫苗配方。通過在合適的動物模型中優(yōu)化疫苗配方、佐劑和遞送系統(tǒng)，并產(chǎn)生合適的候選CT 疫苗，用于后續(xù)臨床試驗。隨著疫苗研制技術(shù)的不斷進步，對感染宿主細胞機制的了解及候選抗原的篩選，有望研制出高效的重組CT 疫苗。