茶樹(shù)Ⅲ類(lèi)過(guò)氧化物酶基因家族的鑒定及表達(dá)模式分析

史曉霞，張寶會(huì)，姚新轉(zhuǎn)，呂立堂，

1. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物工程研究院山地植物資源與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025

過(guò)氧化物酶廣泛存在于生物體內(nèi)，可催化作為電子受體的過(guò)氧化氫和多種電子供體之間的氧化還原反應(yīng)［1-2］。根據(jù)蛋白序列和結(jié)構(gòu)特征，過(guò)氧化物酶分為血紅素過(guò)氧化物酶和非血紅素過(guò)氧化物酶，前者主要分為動(dòng)物類(lèi)和非動(dòng)物類(lèi)血紅素過(guò)氧化物酶［3］，非動(dòng)物類(lèi)血紅素過(guò)氧化物酶又可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)［4］。Ⅲ類(lèi)過(guò)氧化物酶（class Ⅲperoxidases，POD）是植物中一種特殊的氧化還原酶，是一種分泌型過(guò)氧化物酶，參與植物體內(nèi)多種不同的生理過(guò)程，如植物防御、細(xì)胞壁合成、組織愈傷、植物體內(nèi)毒性過(guò)氧化物的清除等［2-7］。研究表明，POD（也稱POX、Prx、Px 或PER）家族成員參與多種植物的生物學(xué)過(guò)程，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtPrx64 基因過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)鋁脅迫的耐受性［8］，AtPRX3 基因?qū)χ参锟购岛涂果}脅迫具有正向的調(diào)節(jié)作用［6］，AtPrx72基因?qū)θ~片木質(zhì)化有重要影響［9］，且POD 基因（At-Prx22，AtPrx39 和AtPrx69）過(guò)表達(dá)會(huì)提高擬南芥的耐寒性［10］；蘿卜（Raphanus sativus）中，抑制過(guò)氧化物酶基因rspral 的表達(dá)可發(fā)揮抗鹽、抗氧化和抗高溫功能［11］；棉花（Gossypium hirsutum）中GhPOX1 基因具有較高活性氧水平［12］，表明GhPOX1 可能通過(guò)介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程。

目前，對(duì)POD 基因家族在茶樹(shù)逆境生長(zhǎng)中作用的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，因此，本研究在擬南芥全基因組水平上，通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒別茶樹(shù)POD 基因家族成員，并對(duì)其理化特性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、染色體定位、共線性、基序組成和基因結(jié)構(gòu)及在逆境下的表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)分析，探討植物中POD 蛋白序列的進(jìn)化聯(lián)系，以期為POD 基因家族的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 茶樹(shù)POD 基因家族的篩選及相應(yīng)蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測(cè) 根據(jù)已報(bào)道的擬南芥POD 基因家族信息，從擬南芥信息庫(kù)（https: ／ ／ www.arabidopsis.org ／）中下載其氨基酸序列，應(yīng)用Tbtools 軟件（https:／／github.com ／ CJ-Chen ／ TBtools ／ releases）將下載的序列與茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP 比對(duì)（e ＜1e-5），初步獲得假設(shè)的茶樹(shù)POD 基因，構(gòu)建關(guān)于茶樹(shù)POD 基因的隱馬爾可夫模型，進(jìn)行第二次搜索鑒定，再次獲得假設(shè)的茶樹(shù)POD 基因。將第二次搜索獲得的茶樹(shù)POD 基因蛋白序列提交至NCBI-CDD（https:／／www.ncbi.nlm.nih.gov ／ Structure ／ cdd ／ wrpsb.cgi）、SMART（http:／／smart.embl-heidelberg.de／）及Pfam（http:／／pfam.xfam.org ／）系統(tǒng)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域鑒定，剔除冗余序列，最終獲得茶樹(shù)POD 基因序列用于后續(xù)分析。利用在線軟件ExPASy-ProParam（https: ／／ web.expasy.org ／compute_pi ／）分析茶樹(shù)POD 基因家族成員蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。

1. 2 茶樹(shù)POD 基因家族染色體定位分析 根據(jù)Phytozome 12. 0 茶樹(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLASTN 結(jié)果，將茶樹(shù)POD 基因定位至不同的染色體上。

1. 3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序分析采用MEGA X 軟件中近鄰連接法（Boostrap 為1 000）構(gòu)建茶樹(shù)POD 蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。將茶樹(shù)POD基因組DNA 序列和CDS 序列提交至GSDS 2. 0（http: ／ ／ gsds.cbi.pku.edu.cn ／）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，通過(guò)MEME（http: ／ ／ meme-suite.org ／）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，motif 數(shù)目設(shè)置為15 個(gè)，其他均為默認(rèn)，并利用軟件Tbtools 進(jìn)行作圖。

1. 4 擬南芥、葡萄和茶樹(shù)POD 基因家族的進(jìn)化分析應(yīng)用ClustalW 對(duì)下載的擬南芥、葡萄和茶樹(shù)的POD基因蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA10. 0 的臨近法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，Boostrap 參數(shù)設(shè)為1 000。

1. 5 茶樹(shù)POD 基因家族種內(nèi)及種間共線性分析利用MCScanX 程序?qū)M南芥、葡萄和茶樹(shù)基因組信息進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)TBtools 軟件分析共線性及基因復(fù)制區(qū)塊。應(yīng)用DnaSP 5. 0 軟件計(jì)算非同義替換（Ka）和同義替換（Ks）值［13］，剔除同義替換率（Ks）＞2. 0 的數(shù)值，以避免替代飽和風(fēng)險(xiǎn)。

1. 6 表達(dá)模式分析 根據(jù)鑒定出的茶樹(shù)POD 基因的編號(hào)，在TPIA（http: ／ ／ tpia.teaplant.org）數(shù)據(jù)庫(kù)上下載其在茶樹(shù)不同組織（包括頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花、果實(shí)、莖、根）中及經(jīng)鹽脅迫（0、24、48、72 h）、PEG 誘導(dǎo)的干旱脅迫（0、24、48、72 h）與冷脅迫［非馴化（平均溫度10 ℃以下）→完全馴化（平均溫度達(dá)10 ℃以上）→去馴化］后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（TPM 值），對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并采用TBtools 軟件制作熱圖。

2 結(jié) 果

2. 1 茶樹(shù)POD 基因家族成員鑒定及其相應(yīng)蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 經(jīng)BLASTP 比對(duì)共獲得122 個(gè)茶樹(shù)POD 基因。最長(zhǎng)的POD 蛋白（CSSPOD90）含有398個(gè)氨基酸殘基，最短的（CSSPOD111）含有142 個(gè)氨基酸殘基；相對(duì)分子質(zhì)量最大為43 700（CSSPOD90），最小為15 300（CSSPOD111）；理論等電點(diǎn)（pI）介于4.62（CSSPOD22）～9. 74（CSSPOD67）之間。pI ＜7 的POD 蛋白達(dá)48%（59 個(gè)），表明茶樹(shù)POD 蛋白家族一半富含酸性氨基酸，一半富含堿性氨基酸。

2. 2 茶樹(shù)POD 基因家族染色體定位分析 獲得122 個(gè)茶樹(shù)POD 基因中，CSSPOD11、CSSPOD95、CSSPOD68、CSSPOD24、CSSPOD86、CSSPOD28、CSSPOD108、CSSPOD111、CSSPOD102、CSSPOD62、CSSPOD72、CSSPOD75、CSSPOD93、CSSPOD43、CSSPOD85、CSSPOD94、CSSPOD110、CSSPOD70、CSSPOD67、CSSPOD107、CSSPOD112、CSSPOD2、CSSPOD77、CSSPOD38 共24 個(gè)基因不能定位至染色體上，其他98 個(gè)基因不均等定位至不同染色體上，其中4 和13 號(hào)染色體包含基因個(gè)數(shù)最多，有12 個(gè)茶樹(shù)POD 基因；14 號(hào)染色體不含茶樹(shù)POD 基因，極有可能發(fā)生了高度變異。另外，茶樹(shù)POD 基因家族存在較多的串聯(lián)重復(fù)基因序列，其中在Chr1、Chr4、Chr7、Chr12、Chr13 染色體上均有2 個(gè)，表明這些基因在茶樹(shù)POD 基因家族的擴(kuò)張和進(jìn)化中扮演著重要角色。見(jiàn)圖1。

圖1 茶樹(shù)POD 基因家族成員的染色體定位Fig. 1 Chromosome location of members of POD gene family in C. sinensis（L.）

2. 3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序分析 共鑒定出10 個(gè)茶樹(shù)POD 基因家族成員的保守基序，依次命名為基序1 ～10。親緣關(guān)系越近的成員其基序結(jié)構(gòu)相似度越高；保守基序8 在所有茶樹(shù)POD 基因家族成員中均有出現(xiàn)，且各亞組所包含的保守基序基本一致，因此該家族蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。茶樹(shù)POD 基因家族有113 個(gè)基因含有2 個(gè)外顯子（最少），推測(cè)其功能具有高度保守性，另外9 個(gè)基因含有3 ～4 個(gè)外顯子，其結(jié)構(gòu)可能更為復(fù)雜。見(jiàn)圖2。

圖2 茶樹(shù)POD 基因的系統(tǒng)進(jìn)化圖（A）、保守基序的示意圖（B）及基本基因結(jié)構(gòu)圖（C）Fig. 2 Phylogenetic relationships（A）, schematic diagram of conserved POD protein motif（B）and basic structure（C）of POD genes in C.sinensis（L.）

2. 4 擬南芥、葡萄與茶樹(shù)POD 基因家族的進(jìn)化分析擬南芥、葡萄和茶樹(shù)POD 基因家族分為5 個(gè)簇，其中，簇4 的POD 基因最多，包含49 個(gè)茶樹(shù)POD 基因、27個(gè)擬南芥POD 基因和21 個(gè)葡萄POD 基因；簇1 的POD 基因最少，包含18 個(gè)茶樹(shù)POD 基因、4 個(gè)擬南芥POD 基因和2 個(gè)葡萄POD 基因。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)還表明，茶樹(shù)POD 家族基因與擬南芥、葡萄POD 家族基因有相對(duì)親緣關(guān)系。

2. 5 茶樹(shù)POD 基因家族種內(nèi)及種間共線性分析122 個(gè)茶樹(shù)POD 基因家族成員中，存在23 對(duì)共線性關(guān)系，Chr1、Chr2、Chr3、Chr4、Chr6 上的茶樹(shù)POD 基因家族成員共線性較多，Chr7、Chr9、Chr10、Chr11、Chr15 上的茶樹(shù)POD 基因家族成員共線性較少。擬南芥和茶樹(shù)POD 基因間有10 對(duì)共線性關(guān)系，葡萄和茶樹(shù)POD 基因間有32 對(duì)共線性關(guān)系，表明這些POD基因?qū)赡軄?lái)自共同的祖先，具有相同的功能。另外，葡萄和茶樹(shù)POD 基因家族具有高度的保守性，在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2. 6 Ka／Ks 分析 在122 個(gè)茶樹(shù)POD 基因家族成員中篩選出23 對(duì)基因進(jìn)行Ka ／ Ks 分析，23 個(gè)基因?qū)Φ腒a ／Ks 值均＜1，見(jiàn)表1。表明這些基因經(jīng)過(guò)較強(qiáng)的純化選擇，復(fù)制方式均為全基因組復(fù)制或片段復(fù)制，在進(jìn)化中較為保守，結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，功能具有一致性。

表1 茶樹(shù)POD 基因家族的Ka ／ Ks 分析Tab. 1 Ka ／ Ks analysis of POD family genes in C. sinensis（L.）

2. 7 茶樹(shù)POD 基因家族成員在茶樹(shù)不同組織中的表達(dá)分析 CSSPOD94、CSSPOD43、CSSPOD46、CSSPOD50、CSSPOD48、CSSPOD51、CSSPOD115、CSSPOD120、CSSPOD121、CSSPOD67、CSSPOD70、CSSPOD-93、CSSPOD97、CSSPOD68、CSSPOD63 共15 個(gè)基因在茶樹(shù)所有組織中表達(dá)量較高，表明這些基因?qū)Σ枭L(zhǎng)發(fā)育具有重要作用；CSSPOD66、CSSPOD73、CSSPOD116、CSSPOD118、CSSPOD119、CSSPOD61、CSSPOD78、CSSPOD57、CSSPOD59 在所有組織中均呈微弱表達(dá)；相對(duì)其他組織比較，CSSPOD120、CSSPOD121 在果實(shí)中的表達(dá)水平總體較高，CSSPO-D43、CSSPOD48、CSSPOD50、CSSPOD51、CSSPOD36、CSSPOD88、CSSPOD90 在花中的表達(dá)水平總體較高；CSSPOD116、CSSPOD118、CSSPOD119 的表達(dá)量隨著葉片成熟度的增加逐漸上調(diào)，CSSPOD94、CSSPOD46、CSSPOD50、CSSPOD51、CSSPOD93、CSSPOD97 的表達(dá)量隨著葉片成熟度的增加逐漸下調(diào)，而CSSPOD43、CSSPOD48、CSSPOD155、CSSPOD120、CSSPOD121、CSSPOD67、CSSPOD70 的表達(dá)量隨著葉片成熟度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。上述結(jié)果表明，不同茶樹(shù)POD 基因可能參與茶樹(shù)的不同生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

2. 8 茶樹(shù)POD 基因家族成員在干旱脅迫、鹽脅迫、冷脅迫條件下的表達(dá)模式 在干旱脅迫下，與其他基因的表達(dá)水平比較，CSSPOD116、CSSPOD120、CSSPOD121、CSSPOD43、CSSPOD48、CSSPOD115、CSSPOD-50、CSSPOD51 的表達(dá)量較高；CSSPOD46、CSSPOD67、CSSPOD70、CSSPOD73、CSSPOD93、CSSPOD97、CSSPOD94 的表達(dá)量受到抑制，其中CSSPOD46、CSSPOD67、CSSPOD70、CSSPOD73 的表達(dá)水平在48 h 時(shí)上調(diào)；CSSPOD44、CSSPOD78、CSSPOD57、CSSPOD59、CSSPOD69、CSSPOD118、CSSPOD119、CSSPOD36、CSSPOD-52 的表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢(shì)；CSSPOD10、CSSPOD11、CSSPOD65、CSSPOD88 等基因不受干旱脅迫處理的調(diào)控。在鹽脅迫處理下，CSSPOD94、CSSPOD115、CSSPOD116、CSSPOD46、CSSPOD67、CSSPOD70、CSSPOD93、CSSPOD97 的表達(dá)受到抑制，CSSPOD40、CSSPOD36、CSSPOD44、CSSPOD78、CSSPOD57、CSSPOD59、CSSPOD69、CSSPOD118、CSSPOD119、CSSPOD52 的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，CSSPOD10、CSSPOD11、CSSPOD28、CSSPOD29 等基因不受鹽脅迫的調(diào)控。在冷處理下，CSSPOD120、CSSPOD121、CSSPOD50、CSSPOD51、CSSPOD67、CSSPOD60 基因的表達(dá)量在CA1 明顯上調(diào)，CSSPOD43、CSSPOD48、CSSPOD93、CSSPOD97 的表達(dá)量在CA3 明顯上調(diào)，但大部分基因不受冷脅迫的影響。上述結(jié)果表明，鹽脅迫增加了茶樹(shù)大多數(shù)POD 表達(dá)，干旱脅迫則降低了其表達(dá)，茶樹(shù)在對(duì)抗非生物脅迫時(shí)POD 基因家族起著重要作用。

3 討 論

已在多個(gè)物種中鑒定出POD 基因家族成員，其中包括擬南芥［14］、水稻［15］、葡萄［20］、毛果楊［16］等，目前，尚無(wú)對(duì)茶樹(shù)中的POD 基因家族生物信息學(xué)分析的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在全基因組水平一共鑒定出122 個(gè)茶樹(shù)POD 基因，全面分析了茶樹(shù)POD 基因家族的基本理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基序組成和基因結(jié)構(gòu)、共線性關(guān)系、組織特異性及非生物脅迫響應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果表明，89%（109 ／ 122）的茶樹(shù)POD 的相對(duì)分子質(zhì)量在30 000 ～45 000 范圍內(nèi)，該結(jié)果與相關(guān)的研究結(jié)果相符［2，17］；pI 介于4. 62 ～9. 74之間，茶樹(shù)POD 蛋白家族一半富含酸性氨基酸，一半富含堿性氨基酸。茶樹(shù)中的大多數(shù)POD 基因（113 ／122）均帶有1 個(gè)以上的外顯子，這與梨PbPRX（90 ／94）和玉米ZmPRX（89 ／ 91）中POD 基因中外顯子的比例相似［18-19］。通過(guò)比較分析，確定了擬南芥、葡萄和茶樹(shù)POD 基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分成5 個(gè)簇，簇4 的POD 基因最多，簇1 的POD 基因最少?；蚪Y(jié)構(gòu)和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，所有茶樹(shù)POD蛋白均具有典型的過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)域，保守基序8在所有茶樹(shù)POD 中均有呈現(xiàn)，推測(cè)其在植物防御過(guò)程中起作用［20］，除1 個(gè)亞組外，其他各亞組所包含的保守基序基本一致，因此該家族蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。另外，茶樹(shù)POD 基因在不同亞基因組中數(shù)量不同，表明POD 基因在茶樹(shù)進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了基因保留和丟失。共線性分析結(jié)果表明，擬南芥、葡萄和茶樹(shù)POD 基因在進(jìn)化上具有近緣關(guān)系。在進(jìn)化過(guò)程中，基因通常會(huì)受到各種選擇壓力，如純化選擇（Ka ／ Ks ＜1），陽(yáng)性選擇（Ka ／ Ks ＞1）和中性選擇（Ka ／ Ks = 1）［21］，茶樹(shù)POD 基因組中23 個(gè)基因?qū)Φ腒a ／ Ks 值均＜1，表明這些基因經(jīng)過(guò)較強(qiáng)的純化選擇，在進(jìn)化中較為保守。

植物體內(nèi)POD 含量增加可抑制過(guò)氧化氫的產(chǎn)生和活性氧的形成，通過(guò)這種抑制作用增強(qiáng)植物對(duì)脅迫的抗性，如擬南芥AtPRX3 基因?qū)χ参锟购岛涂果}脅迫具有正向的調(diào)節(jié)作用［6］，蘿卜中過(guò)氧化物酶基因rspral 在抑制表達(dá)條件下具有抗鹽、抗氧化和抗高溫功能［11］，煙草中過(guò)表達(dá)長(zhǎng)春花過(guò)氧化物酶基因CrPrx 和CrPrx1 分別增強(qiáng)了耐寒性和發(fā)芽率［22］。本研究表達(dá)模式分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)POD 基因具有組織特異性，CSSPOD94、CSSPOD43、CSSPOD46、CSSPOD50、CSSPOD48、CSSPOD51、CSSPOD115、CSSPOD120、CSSPOD121、CSSPOD67、CSSPOD70、CSSPOD93、CSSPOD97、CSSPOD68、CSSPOD63 等15 個(gè)基因在茶樹(shù)所有組織中均有表達(dá)，且具有較高的表達(dá)量，表明這些基因在功能上具有多樣化，在抵抗脅迫方面具有積極作用。

研究表明，POD 涉及廣泛的生理過(guò)程，如植物防御過(guò)程、細(xì)胞壁合成、組織愈傷、植物體內(nèi)活性氧清除等。本研究結(jié)果表明，茶樹(shù)POD 基因家族在脅迫響應(yīng)與生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能參與重要的調(diào)控作用，為進(jìn)一步分析茶樹(shù)POD 基因家族在生物或非生物脅迫及其生長(zhǎng)發(fā)育中的功能和作用奠定了基礎(chǔ)。志謝感謝貴州大學(xué)茶學(xué)院呂立堂老師對(duì)本論文的指導(dǎo)及貴州大學(xué)茶學(xué)院和生命科學(xué)學(xué)院的授課老師及同學(xué)對(duì)本文的幫助