正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化油茶粕中糖萜素提取工藝

袁成華，楊瓊玲，鄧愛(ài)華 ，李菊元，何婉琳

（1.湖南省康多利油脂有限公司，湖南 常德 415700；2.湖南文理學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000）

我國(guó)油茶資源豐富，油茶籽炸油后剩余的油茶粕中富含有大量的糖萜素。糖萜素是一類(lèi)由茶皂素( ≥30% ) 、多糖( ≥30% ) 及蛋白等組成的天然活性物質(zhì)，主要用于飼料添加劑，替代抗生素在飼料中的應(yīng)用，其具有化學(xué)成分穩(wěn)定、無(wú)抗性干擾、無(wú)藥殘、無(wú)抗藥性及無(wú)任何配伍禁忌，可配制成預(yù)混合飼料[1-2]。在動(dòng)物飼料中添加糖萜素后，動(dòng)物機(jī)體的免疫力得到大大增強(qiáng)，抗生素的用量大大減少[3]。目前，糖萜素的主要提取方法有溶劑直接提取法、轉(zhuǎn)化合成法和生物酶法等。水提法較為經(jīng)濟(jì)，但水溶性雜質(zhì)較多，糖萜素收率較低；甲醇提取法比水提法收率提高了80%，但甲醇易揮發(fā)且有一定的毒性，對(duì)于操作工人身體有一定的損害[4-5]；轉(zhuǎn)化合成法需先將茶皂素和茶多糖分開(kāi)提取，再按照比例進(jìn)行合成轉(zhuǎn)化，制備的糖萜素純度較高，但工藝復(fù)雜，收率偏低[6]；微生物發(fā)酵法發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)酵設(shè)備投資大[7-8]。本實(shí)驗(yàn)擬先通過(guò)超臨界二氧化碳代替石油醚除脂，其脫脂效率高，能進(jìn)一步提高糖萜素的溶出率，所用乙醇溶劑安全且可以回收循環(huán)利用。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化糖萜素提取工藝參數(shù)，并對(duì)所制備的糖萜素中總皂苷、總糖含量、總蛋白等關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析，以期為油茶廢棄物中糖萜素的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶粕：湖南省康多利油脂有限公司；3,5-二硝基水楊酸（分析純）、茶皂素（分析純）、牛血清蛋白（分析純）、考馬斯亮藍(lán)（分析純）、高氯酸（分析純）、香草醛（分析純）、乙醇（分析純）：國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JB/T5374型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1600型分光光度計(jì)：翱藝儀器有限公司；ZWL-LS1-10型超純水機(jī)：湖南中沃水務(wù)環(huán)?？萍加邢薰荆籇ZF型真空干燥箱：邦西儀器科技有限公司；HH-6JS型磁力攪拌水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糖萜素制備工藝

油茶粕→粉碎→超臨界流體脫脂→乙醇浸提→過(guò)濾→真空濃縮→濃縮物正丁醇萃取→萃取相真空濃縮→濃縮物真空干燥→糖萜素成品

1.3.2 糖萜素含量及質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定方法

糖萜素含量及質(zhì)量測(cè)定方法參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[9-10]的方法。茶多糖測(cè)定：采用3,5-二硝基水楊酸法；總皂苷測(cè)定：高氯酸-香草醛法；蛋白質(zhì)測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)法；糖萜素提取率按式（1）計(jì)算。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份經(jīng)脫脂的油茶粕20 g，按照液固比20:1（mL/g）加入75%的乙醇水溶液，在80 ℃下浸提3 h，浸提1次，浸提液按照1.3.1所述步驟提取糖萜素，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算糖萜素的提取率。單因素實(shí)驗(yàn)分別考察乙醇濃度（55%、65%、75%、85%、95%），浸 提 溫 度（50、60、70、80、90 ℃），液固比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1（mL/g）），浸提時(shí)間（1、2、3、4、5 h）浸提次數(shù)（1、2、3、4、5）等對(duì)糖萜素提取率的影響規(guī)律；當(dāng)考察某一因素時(shí)，其他因素按上述條件不變。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定適宜的甲醇濃度、浸提液固比、浸提時(shí)間、浸提溫度和浸提次數(shù)等5個(gè)因素的水平，運(yùn)用 L16( 45) 正交表確定最佳工藝條件，實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表 1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.1.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

如圖1所示，以葡糖糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)擬合得到多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= 1.063 8X+ 0.027 7，R2= 0.991 8，說(shuō)明所選取的線性范圍好。

2.1.2 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

如圖2所示，以茶皂素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)擬合得到多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= 0.539 6X+ 0.099 9，R2= 0.999 1，說(shuō)明所選取的線性范圍好。

2.1.3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖3所示，以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)擬合得到多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= 0.049 5X+ 0.029 4，R2= 0.997 4，說(shuō)明所選取的線性范圍好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

如圖4所示，隨著乙醇濃度的增加，糖萜素收率逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到75%時(shí)，糖萜素收率達(dá)到最大26.5%；當(dāng)進(jìn)一步提高溶劑中乙醇濃度，糖萜素的收率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)?？赡苁翘岣咭掖紳舛?，溶劑的極性降低，物料中茶皂素或茶多糖等溶出度降低，導(dǎo)致糖萜素的整體比例下降，選擇合適的乙醇濃度在65%～85%。

2.2.2 溫度對(duì)提取率的影響

如圖5所示，當(dāng)溫度較低時(shí)，物料中糖萜素在浸提液中的溶解性較差，分子運(yùn)動(dòng)較慢，不利于物質(zhì)的傳質(zhì)。前期隨著溫度的上升，溶解度不斷增加，糖萜素提取率增加較快，在75 ℃左右提取率達(dá)到最大26.7%。此時(shí)物料中的糖萜素傳質(zhì)速率已經(jīng)達(dá)到最大，當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，影響不明顯；80 ℃以上，乙醇的揮發(fā)性增加，降低了提取液的量，高溫也會(huì)加速物料中的蛋白質(zhì)和果膠等雜質(zhì)變性沉淀。綜合能耗成本和設(shè)備成本，選擇提取溫度在65～85 ℃較為適宜。

2.2.3 液固比對(duì)提取率的影響

如圖6所示，隨著乙醇體積的增加，糖萜素提取率增加；當(dāng)比例達(dá)到20:1（mL/g）時(shí)，糖萜素提取率達(dá)到26.3%，后續(xù)增加溶劑的比例，對(duì)提取率影響不大，說(shuō)明糖萜素基本提取出來(lái)。溶劑用量太大，一方面增加溶劑的消耗量，另一方面增加后續(xù)濃縮成本；同時(shí)，提取的糖萜素中蛋白類(lèi)等其他雜質(zhì)含量偏高，增加純化成本和降低產(chǎn)品品質(zhì)。合適的提取液固比控制在15:1～25:1（mL/g）較為合適。

2.2.4 時(shí)間對(duì)提取率的影響

如圖7所示，隨提取時(shí)間的增加，糖萜素收率不斷增加，當(dāng)達(dá)到3.0 h后，繼續(xù)增加提取時(shí)間，糖萜素收率增長(zhǎng)幅度較小，表明物料中的糖萜素已基本溶出，糖萜素的傳質(zhì)過(guò)程基本達(dá)到平衡。從生產(chǎn)周期和設(shè)備能耗綜合考慮，適宜的提取時(shí)間為2.5～3.5 h。

2.2.5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

如圖8所示，糖萜素提取率與提取次數(shù)呈正相關(guān)，前2次提取率增加幅度較大，后續(xù)增長(zhǎng)幅度較小。提取次數(shù)越多，溶液中水溶性雜質(zhì)的比例會(huì)明顯增多，導(dǎo)致后續(xù)糖萜素的純度下降；同時(shí)，提取次數(shù)的增加也會(huì)導(dǎo)致濃縮成本和分離成本增加，選擇提取次數(shù)在2～3次較為適宜。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

通過(guò)擬水平補(bǔ)充法設(shè)計(jì)L16( 45) 正交實(shí)驗(yàn)如表2所示。由表2可知，各因素對(duì)糖萜素提取量的的影響大小依次為：E（提取次數(shù)）＞ A（乙醇濃度）＞ D（時(shí)間）＞ C（液固比）＞ B（溫度），在選取的因素考察范圍內(nèi)，提取次數(shù)的影響最顯著，其次是乙醇的濃度，提取的液固比和溫度影響比較小。根據(jù)優(yōu)化分析，較合適的提取工藝參數(shù)為E2A3D2C1B2，該工藝下提取工藝所需溶劑消耗量小和能耗低。

正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到油茶粕中糖萜素提取的最佳工藝參數(shù)為E2A3D2C1B2，即在乙醇濃度80%、溫度75 ℃、液固比15:1（mL/g）下提取3 h，提取2次，最佳組合不在本正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，按此條件組合提取糖萜素的收率為33.47%，與正交實(shí)驗(yàn)的最高得率33.21%接近。

2.4 糖萜素質(zhì)量分析

根據(jù)GB/T 25247—2010《飼料添加劑 糖萜素》的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)為總皂苷≥30%，配糖體≥30%，粗蛋白量≥7%，干燥失重≤7.0%。本實(shí)驗(yàn)提取的糖萜素呈淺棕黃色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算糖萜素中總皂苷含量為32.2%，總糖含量為34.7%，干燥失重率為5.7%，蛋白含量為12.3%，均滿足國(guó)標(biāo)中糖萜素的質(zhì)量指標(biāo)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)探討各因素對(duì)茶籽粕中糖萜素提取率的影響規(guī)律，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到最佳提取工藝參數(shù)乙醇濃度80%、溫度75 ℃、液固比15:1（mL/g）、時(shí)間3 h、提取2次，糖萜素的收率為33.47%；經(jīng)檢測(cè)分析所制備的糖萜素各項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。本實(shí)驗(yàn)可為我國(guó)茶油產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。