黃晶果采后主要病原菌的分離與鑒定

徐丹丹，喬 方,*，劉 敏，林澤勉，禤文生

（1. 深圳職業(yè)技術學院應用化學與生物技術學院，深圳職業(yè)技術學院博士后創(chuàng)新實踐基地，廣東 深圳 518055；2. 深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，廣東 深圳 518005；3. 華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642；4. 廣東龍飛生物有限公司，廣東 江門 529200）

黃晶果（Pouteria caimito Radlk.）又名亞美果、雅美果，屬山欖科（Sapotaceae）多年生常綠喬木，其成熟果實果型飽滿，果皮金黃色，呈革質(zhì)，果肉為奶油白色、半透明狀、似果凍，口感清甜多汁，入口有清涼感，有膠質(zhì)黏液[1]。該水果原產(chǎn)于亞馬遜上游，目前廣泛分布于拉丁美洲、澳大利亞和東南亞等地區(qū)，20 世紀90年代黃晶果作為一種新興水果被引進我國，因其不僅能鮮食，還兼具一定藥用功效，營養(yǎng)價值豐富，深受消費者的喜愛，未來市場前景廣闊、消費潛力巨大[2]。但是，采后的黃晶果因含水量和含糖量高，生長代謝旺盛，極易遭受病原菌的侵染，其引發(fā)的褐變腐爛極大地影響了果實的商品價值，成為阻礙黃晶果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要原因之一。

國內(nèi)外對黃晶果的研究較少，僅有少數(shù)文章報道其引種特性的相關研究，尚無研究關注該水果的采后病害。本研究采用傳統(tǒng)組織分離法對黃晶果采后常溫貯藏過程中的病原菌進行分離純化，并結合形態(tài)學特征和ITS、TUB2 序列對分離純化的病原菌進行分析，旨在明確引起黃晶果采后病害的病原微生物種類，以期為黃晶果采后病害的生物防控及延長其采后貯藏期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

于2020 年8 月15 日，在廣東臺山龍飛生物有限公司黃晶果種植基地采集黃晶果果實（品種“白綿綿”），挑選成熟度一致（8～9 成熟）且健康無病的果實，于室溫下放置，待果實發(fā)病后分離病原菌進行后續(xù)試驗研究。

真菌基因組DNA 提取試劑盒，購自Omega 生物工程有限公司；瓊脂糖、2×MasterMix 等分子試劑，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；瓊脂粉、葡萄糖，購自北京鼎國生物技術有限公司；其他生化試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HV-50 高壓滅菌鍋，日本Hirayama 公司；Gel Dox XR+凝膠成像系統(tǒng)、T100PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；BX53 光學顯微鏡，日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化

取黃晶果果實發(fā)病部位病健交界處的組織，于75%的酒精中浸泡10 s，迅速用無菌濾紙吸出酒精后，移入2%的次氯酸鈉溶液中浸泡1～2 min，而后用無菌水沖洗3 次，用無菌濾紙吸干組織塊，移入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）中，25 ℃培養(yǎng)3～5 d。待組織塊邊緣長出新鮮菌落，用無菌接種針挑取菌絲尖端進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 致病性測定

將分離純化后的菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后，用打孔器打取直徑為5 mm 的菌餅。選取健康的黃晶果果實，用75%的酒精對黃晶果進行表面消毒后再用無菌水沖洗、晾干。采用針刺法接種，即隨機選取6 個果實，用無菌接種針在每個果實上刺破4 個孔，孔徑約為1 mm，其中3 個果實的傷口處接種含有菌絲的菌餅，另外3 個果實的傷口僅接種無菌PDA菌餅作為對照。然后將所有處理過的果實置于接種盒內(nèi)，于25 ℃下培養(yǎng)，定期記錄果實的發(fā)病情況。待果實發(fā)病后進行病原菌分離。

1.2.3 形態(tài)學鑒定

將純化后菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，拍照觀察菌落形態(tài)，待菌產(chǎn)孢后利用光學顯微鏡記錄孢子形態(tài)和結構，并測量孢子大小。

1.2.4 DNA 提取與基因序列擴增

將分離純化的病原菌于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d，刮取菌絲于液氮下研磨均勻，選用真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌絲DNA。選用真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCT CCGCTTATTGATAT GC-3’）和β-微管蛋白基因（β-Tubulin，TUB2）引 物Bt2a（5’-GGTAACCAAATCGG TGCTGCTTTC-3’）和Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGT GAC CCTTGGC-3’）進行PCR擴增。PCR 反應體系總體積為25 μL，DNA 模板1 μL，正反向引物各1 μL（10 μmol/L），2×MasterMix 12.5 μL，加ddH2O 補足至25 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

取5 μL PCR 擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將PCR 產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司測序。將測得的基因序列與GenBank 中的序列進行BLAST 比對，下載同源性高的已知序列，使用MEGA6.0 軟件以最大似然法（Maximum likelihood，ML）構建系統(tǒng)進化樹，以自展法（Bootstrap）進行檢測，共循環(huán)1 000 次。

2 結果與分析

2.1 黃晶果果實貯藏期的發(fā)病癥狀和病原菌致病性測定

綜合分析黃晶果貯藏過程中表現(xiàn)出的病害癥狀，主要有以下幾種：病癥a，果實初期果皮變褐，之后迅速滋生白色霉層，霉層下有液滴浸出，后期果肉迅速軟腐（圖1 A1）；病癥b，果實發(fā)病初期在果蒂處出現(xiàn)褐色輪紋狀暈圈，后期暈圈聯(lián)合成褐色病斑（圖1 B1）；病癥c，發(fā)病初期在果實果蒂處現(xiàn)褐色壞死狀病斑，后期病斑擴展導致果實腐爛（圖1 C1）；病癥d，在果實表面呈現(xiàn)凹陷壞死狀圓斑（圖1 D1）；病癥e，在果實表面呈現(xiàn)為不規(guī)則圓形褐色病斑（圖1 E1）。

依據(jù)柯赫氏法則，分別從具有病癥a、b、c、d、e 的果實組織中分離純化得到病原菌疑似菌株A、B、C、D、E。將得到的5 株菌株回接至健康的黃晶果果實上，依據(jù)發(fā)病癥狀判斷該菌株是否為果實致病菌，結果表明：5 株病原菌疑似菌株接種至黃晶果果實均能引起果實發(fā)病，并呈現(xiàn)與自然發(fā)病類似的病癥（圖1 A2～E2）。進行再分離后，均能從發(fā)病部位分離得到與接種菌相同的菌株，回接后再分離率均為100%。

圖1 黃晶果果實的5 種發(fā)病癥狀及病原菌回接發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of infected and reinoculated with five strains on abiu

2.2 黃晶果果實病原菌菌落形態(tài)特征

黃晶果病癥a 的病原菌A（圖2 A1、A2）生長迅速，氣生菌絲發(fā)達，3 d 后，在PDA 培養(yǎng)基上的菌落直徑即達到90 mm，菌落初期白色，漸變?yōu)闇\灰褐色、鼠灰色至黑色，絨毛狀，菌落反面暗黑色至黑色；病癥b的病原菌B（圖2 B1、B2） 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后，菌落呈近圓形，菌落正面呈白色花瓣式輪紋狀，菌落背面呈黃白色，在接種菌餅處可見油狀黑色黏液，為病原菌的分生孢子；病癥c 的病原菌C（圖2 C1、C2）于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d 后，菌落呈白色，平整，邊緣不規(guī)則，菌落中央有黑褐色的小點，為病原菌的分生孢子器；病癥d 的病原菌D（圖2 D1、D2）在PDA培養(yǎng)基上，菌絲呈白色絨狀，后期菌落顏色變?yōu)殚偌t色，為病原菌產(chǎn)生的色素；病癥e 的病原菌E（圖2 E1、E2）的孢子易飛散，在同一PDA 培養(yǎng)基上形成多個菌落，其菌落生長快，初期為白色，2～3 d 后轉(zhuǎn)為棕黑色，呈粉末狀。

圖2 黃晶果果實5 種病原菌的菌落形態(tài)Fig.2 Colony characteristics of five strains on PDA medium

2.3 黃晶果果實病原菌的顯微形態(tài)特征

由圖3 可見，各菌株在PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)不同時間段后，顯微形態(tài)各異。菌株A（圖3 A1、A2）在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d 后可產(chǎn)生分生孢子，分生孢子橢圓形或卵形，初期單胞無色，老熟后呈褐色，近中部有一個橫隔膜，其大小為（20.73～26.16）μm×（11.94～13.93）μm；菌株B（圖3 B1、B2）在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后可產(chǎn)生分生孢子，分生孢子呈紡錘狀，有5 個細胞，中間3 個細胞呈褐色，頂部細胞無色，有2～3 根頂部附屬絲，尾部細胞無色，有1 根中生式尾毛，其大小為（16.15～23.86）μm×（6.05～8.16）μm；菌株C（圖3 C1、C2）在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d 后可產(chǎn)生β 型分生孢子，未見α 型分生孢子，β 型分生孢子無色、單胞、線形、一端常為鉤狀，大小為（24.54～31.37）μm×（1.30～1.84）μm；菌株D（圖3 D1、D2）在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后可產(chǎn)生分生孢子，其大型分生孢子呈鐮刀型，多細胞無色，一般有3～5 個隔膜，大小為（7.48～11.65）μm×（2.73～4.27）μm，小型分生孢子呈橢圓形或卵形，有0～1 個隔膜，大小為（3.79～6.49）μm×（1.93～2.75）μm；菌株E（圖3 E1～E3）在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后即可產(chǎn)生大量分生孢子，分生孢子呈圓球形，表面粗糙有小刺，可粘附于分生孢子梗上，分生孢子大小為3.52～4.37 μm。

圖3 黃晶果果實5 種病原菌的顯微形態(tài)觀察Fig.3 Morphological characteristics of five strains from abiu

對上述5 株真菌的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)的特征進行綜合分析，菌株A 與毛色二孢屬（Lasiodiplodia）真菌形態(tài)一致[3]，菌株B 與擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）真菌形態(tài)一致[4]，菌株C 與間座殼屬（Diaporthe）真菌形態(tài)一致[5]，菌株D 與鐮孢菌屬（Fusarium）真菌形態(tài)一致[6]，菌株E 與曲霉屬（Aspergillus）真菌形態(tài)一致[7]。

2.4 聯(lián)合基因系統(tǒng)進化樹分析

將從黃晶果果實分離得到的5 株致病型病原菌的ITS 區(qū)域序列和TUB2 基因序列進行Blast 比對，于GeneBank 數(shù)據(jù)庫中搜索同源序列構建系統(tǒng)進化樹，結果見圖4。從圖4 可以看出，5 株病原菌分別屬于5 個不同的屬，由系統(tǒng)發(fā)育樹可看出，菌株A、B、C、D、E 分別與可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）、薔薇擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis rosae）、間座殼真菌（Diaporthe pseudomangiferae）、層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum） 和棘孢曲霉（Aspergillus aculeatinus）聚在一起，各自形成明顯的分支，且每個分支間有很高的支持率，結合各菌株的孢子形態(tài)特征，將菌株A、B、C、D 和E 分別鑒定為可可毛色二孢、薔薇擬盤多毛孢、間座殼真菌、層出鐮孢菌和棘孢曲霉。

圖4 基于最大似然法構建的聯(lián)合基因（ITS 和TUB2）系統(tǒng)進化樹鑒定各病原菌Fig.4 Phylogenetic tree generated by maximum likelihood analysis based on alignment of ITS and TUB2 gene sequences for identification of all tested pathogens

3 討論與結論

結合形態(tài)學特征與聯(lián)合基因（ITS 和TUB2）序列分析以及致病性檢測，將從黃晶果果實上分離得到的5 株病原菌分別鑒定為可可毛色二孢（L. theobromae）、薔薇擬盤多毛孢（N. rosae）、間座殼真菌（D.pseudomangiferae）、層出鐮孢菌（F. proliferatum）和棘孢曲霉（A. aculeatinus）。目前，尚未有黃晶果采后的相關研究，該研究為國際首次報道。

可可毛色二孢是多種植物的潛在病原菌，可引發(fā)整株植物死亡、果實和果蒂腐爛及葉斑等病癥[8]。其中，龍眼果實焦腐病[9]、芋艿采后腐爛[10]、桑樹根腐病[11]、杧果流膠病菌[12]、茶樹葉斑病[13]等病害的病原菌經(jīng)鑒定均為可可毛色二孢。研究發(fā)現(xiàn)可可毛色二孢菌絲生長迅速，回接至健康果實2 d 即可引起果皮變褐腐爛，迅速滋生大量白色霉層，接種3 d 后整個果實滲出大量組織液，果肉迅速軟腐，由此表明，該菌為黃晶果采后的優(yōu)勢致病菌。Zhang 等[14]的研究表明，由可可毛色二孢引起的龍眼褐變腐爛與龍眼果實的膜脂代謝密切相關，研究發(fā)現(xiàn)可可毛色二孢侵染黃晶果果實后迅速造成果實軟腐和組織液外泄，這可能與該菌影響了黃晶果的膜脂代謝相關，尚有待于進一步研究。薔薇擬盤多毛孢和間座殼真菌是內(nèi)生真菌，但亦能引發(fā)宿主植物發(fā)病[15-16]。研究表明，這兩株真菌能造成黃晶果的采后腐爛，這可能是因為黃晶果采后貯藏期間抗性下降，使作為條件致病菌的薔薇擬盤多毛孢和間座殼真菌的活性增強，從而導致采后果實病害爆發(fā)，果實腐爛敗壞，嚴重影響了黃晶果的經(jīng)濟價值。

鐮刀菌屬微生物生長過程中能夠產(chǎn)生真菌毒素，研究結果表明，病原菌D 與層出鐮孢菌親緣關系較近，而該菌已被證明是產(chǎn)生伏馬菌素的主要菌種之一，該類毒素能夠引起人類多種疾病[17-18]。另外，作為一種重要的植物病原菌，層出鐮孢菌能夠引起芒果畸形[19]、番茄葉斑病[20]、百合枯萎病[21]和香蕉[22]、桃子[23]、菠蘿[24]、大蒜[25]等果實采后褐變腐爛。黃晶果被層出鐮孢菌侵染后發(fā)病癥狀較隱蔽，發(fā)病初期僅呈現(xiàn)為凹陷小斑，極易引起消費者誤食而攝入真菌毒素。因此，在貯藏期間控制該類病原菌能夠有效降低食品安全事件發(fā)生的風險。

棘孢曲霉既是一種重要的工程菌株[26]，又是紅毛丹[27]、黃秋葵[28]等宿主植物上的重要病原菌。該研究首次報道上述菌株為黃晶果果實的腐爛致病菌。

研究選用黃晶果果實作為試驗材料，對其采后病原菌進行分離、鑒定，基本明確了黃晶果采后致病菌的種類、致病性及其發(fā)展情況，對黃晶果貯藏保鮮技術的研究具有指導意義。但由于病原菌的生長繁殖受外界環(huán)境影響較大，且不同黃晶果品種的病原菌種類和分離頻率存在一定差異，而現(xiàn)有的商品化黃晶果品種有限，因此，在后期將進一部對黃晶果不同品種開展相關研究，為后期黃晶果采后病害的研究及防控提供理論依據(jù)。