葛根素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡與自噬及其分子機制研究*

胡亞麗，楊杰，龐茜茜

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，張家口 075000）

肝癌是威脅中國人民生命健康的主要惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤第4位、病死率居第3位[1]。手術(shù)切除并輔以放化療是臨床治療肝癌的首選方案，但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率超過60%、5年生存率不足40%[2]。中醫(yī)藥抗腫瘤逐漸得到人們的關(guān)注與認(rèn)可，葛根素（Puerarin）是從中藥葛根中提取的1類具有異黃酮類化合物，包括葛根素、胡蘿卜苷、β-谷甾醇等活性成分，呈白色至微黃色結(jié)晶性粉末、微溶于水，具有抗炎、抗氧化、降血壓、調(diào)節(jié)血脂、抗心律失常等多種藥理學(xué)作用[3]。近年來葛根素抗腫瘤活性很受關(guān)注，對胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌等均具有一定的抑制作用[4]。阻滯腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬是葛根素抗腫瘤的作用機制[5-6]。本實驗以臨床治療肝癌一線化療用藥順鉑為陽性對照，設(shè)葛根素3個劑量組進(jìn)行干預(yù)，研究不同劑量葛根素對人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡、自噬的影響并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人肝癌HepG2細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。HepG2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和雙抗（100 U/mL鏈霉素-青霉素）的DMEM培養(yǎng)基，置細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞匯合度約80%時進(jìn)行傳代。取第3代對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞開展實驗研究，設(shè)空白組、葛根素（50、100、200 μg/mL）組和順鉑 20 μg/mL 組[7-8]。

1.2 藥物與試劑 葛根素購自上海源葉生物科技有限公司（純度≥99%，批號：B21028）；注射用順鉑購自齊魯制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字H37021357，規(guī)格 20 mg/支，批號：1905016）；DMEM 培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO）、胰酶、胎牛血清購自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、山羊抗兔IgG二抗購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、激活型半胱氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān) X蛋白（Bax）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（pmTOR）、酵母 ATG6 同源物（Beclin1）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.3 主要儀器 BB15型細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；LB940型酶標(biāo)儀（德國Berthold公司）；SE300型電泳儀、TE22型轉(zhuǎn)膜儀（美國Hoefer公司）；FACSAria型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；BX53型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 細(xì)胞增殖抑制率檢測 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，消化、重懸并計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，并以 DMSO（空白組）和終濃度（50、100、200 μg/mL）葛根素、20 μg/mL 順鉑進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)10個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔10 μL加入CCK-8溶液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后通過酶標(biāo)儀檢測450nm處吸光度值（A），細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-A藥物組/A空白組）×100%

1.5 細(xì)胞凋亡水平檢測 取濃度1×105個/mL的HepG2細(xì)胞懸液，500 μL/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，分組并分別以相應(yīng)濃度藥物進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)10個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后通過不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化、離心（2 000 r/min，離心半徑 8 cm，5 min）收集細(xì)胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明依次處理，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡水平。

1.6 細(xì)胞自噬溶酶體水平檢測 取濃度1×105個/mL的HepG2細(xì)胞懸液，200 μL/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，分組并分別以相應(yīng)濃度藥物進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)10個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液、PBS洗滌3次，500 μL/孔滴加吖啶橙溶液（1 mg/L）避光孵育15 min，PBS洗滌3次后通過熒光顯微鏡觀察（自噬溶酶體呈紅色熒光）。

1.7 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，消化、重懸并計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，每孔1 mL接種于60 mm培養(yǎng)皿，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，分組并分別以相應(yīng)濃度藥物進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)10個皿，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后消化、離心（2 000 r/min，離心半徑 8 cm，5 min）收集細(xì)胞，冰上裂解30 min，低溫4℃離心（12 000 r/min，離心半徑8 cm，15 min）取上清液，BCA法檢測總蛋白濃度、95℃水浴10 min蛋白變性，取總蛋白30 μg行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上、置5%蛋白免疫印跡封閉液室溫封閉2 h，滴加Akt、p-Akt、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-mTOR、Beclin1、LC3、β-actin抗體4℃孵育過夜，洗膜后滴加二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加DAB顯色，應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參半定量目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法檢測，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HepG2細(xì)胞增殖抑制率比較 與空白組比較，葛根素 50、100、200 μg/mL 組和順鉑 20 μg/mL組HepG2細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P<0.01）；與順鉑20 μg/mL組比較，葛根素200 μg/mL組細(xì)胞增殖抑制率升高（P<0.05）。見表1。

2.2 各組HepG2細(xì)胞凋亡水平比較 與空白組比較，葛根素 50、100、200 μg/mL 組和順鉑 20 μg/mL組HepG2細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，凋亡率顯著升高（P<0.01）；與順鉑20μg/mL組比較，葛根素200μg/mL組HepG2細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。見圖1、表1。

圖1 各組HepG2細(xì)胞凋亡水平比較Fig.1 Comparison of apoptosis levels of HepG2 cells in each group

表1 各組HepG2細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率比較（±s）Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HepG2 cells in each group（±s）

表1 各組HepG2細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率比較（±s）Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HepG2 cells in each group（±s）

注：與空白組比較，*P<0.01；與順鉑 20 μg/mL 組比較，#P<0.05。

組別 樣本數(shù) 增殖抑制率（%） 凋亡率（%）空白組 10 0.00±0.00 3.35±0.90葛根素 50 μg/mL 組 10 26.47±3.91* 19.26±3.28*葛根素100 μg/mL組 10 34.68±4.43* 26.54±5.15*葛根素200 μg/mL組 10 41.37±4.69*# 43.81±7.48*#順鉑 20 μg/mL 組 10 35.92±4.22* 36.53±6.80*

2.3 各組HepG2細(xì)胞自噬水平比較 與空白組比較，葛根素 50、100、200 μg/mL 組和順鉑 20 μg/mL組自噬溶酶體（亮紅色熒光）呈不同程度增多，葛根素作用呈現(xiàn)一定劑量依賴性，葛根素200 μg/mL組自噬溶酶體數(shù)量明顯多于其他組，提示葛根素具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的作用。見圖2。

圖2 各組HepG2細(xì)胞自噬水平比較（吖啶橙染色，×200倍）Fig.2 Comparison of autophagy levels of HepG2 cells in each group(acridine orange staining，×200)

2.4 各組HepG2細(xì)胞Akt、p-Akt、p-mTOR表達(dá)及Akt磷酸化（p-Akt/Akt比值）比較 與空白組比較，葛根素 100、200 μg/mL 組和順 鉑 20 μg/mL 組HepG2 細(xì)胞 p-Akt、p-mTOR 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），Akt表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Akt磷酸化明顯降低（P＜0.01）；與順鉑 20 μg/mL 組比較，葛根素200 μg/mL 組 p-Akt、p-mTOR 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01），Akt磷酸化降低（P<0.01）。見圖 3、表 2。

表2 各組HepG2細(xì)胞Akt、p-Akt、p-mTOR表達(dá)及Akt磷酸化比較（±s）Tab.2 Comparison of Akt，p-Akt，p-mTOR expression and Akt phosphorylation of HepG2 cells in each group（±s）

表2 各組HepG2細(xì)胞Akt、p-Akt、p-mTOR表達(dá)及Akt磷酸化比較（±s）Tab.2 Comparison of Akt，p-Akt，p-mTOR expression and Akt phosphorylation of HepG2 cells in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與順鉑 20 μg/mL 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 樣本數(shù) Akt/β-actin p-AKt/β-actin p-mTOR/β-actin p-Akt/Akt空白組 10 0.89±0.26 0.82±0.23 0.43±0.11 0.91±0.25葛根素 50 μg/mL 組 10 0.91±0.28 0.67±0.19 0.37±0.09 0.74±0.21葛根素 100 μg/mL 組 10 0.92±0.25 0.42±0.15* 0.25±0.06* 0.46±0.12*葛根素 200 μg/mL 組 10 0.89±0.27 0.15±0.04*# 0.19±0.04*## 0.17±0.04*##順鉑 20 μg/mL 組 10 0.88±0.26 0.20±0.05* 0.26±0.05* 0.23±0.05*

圖3 各組HepG2細(xì)胞Akt、p-Akt、p-mTOR表達(dá)比較Fig.3 Comparison of Akt，p-Akt，p-mTOR expression of HepG2 cells in each group

2.5 各組 HepG2細(xì)胞 Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3 表達(dá)及 Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較 與空白組比較，葛根素100、200 μg/mL組和順鉑20 μg/mL組HepG2細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達(dá)明顯上調(diào)而 Bcl-2表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高（P＜0.01）；與順鉑 20 μg/mL 組比較，葛根素 200 μg/mL 組 Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅱ上調(diào)（P＜0.05 或 P＜0.01），兩組間 Bcl-2 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。見圖 4、表 3和表4。

圖4 各組HepG2細(xì)胞Cleaved Caspase-3、bcl-2、Bax、Beclin1、LC3表達(dá)比較Fig.4 Comparison of Cleaved Caspase-3，bcl-2，Bax，Beclin1，LC3 expression of HepG2 cells in each group

表3 各組HepG2細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)及Bax/Bcl-2比值比較（±s）Tab.3 Comparison of Cleaved Caspase-3，Bcl-2，Bax expression and the ratio of Bax/Bcl-2 of HepG2 cells in each group（±s）

表3 各組HepG2細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)及Bax/Bcl-2比值比較（±s）Tab.3 Comparison of Cleaved Caspase-3，Bcl-2，Bax expression and the ratio of Bax/Bcl-2 of HepG2 cells in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑 20 μg/mL 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 樣本數(shù) Cleaved Caspase-3/β-actin bcl-2/β-actin Bax/β-actin Bax/bcl-2空白組 10 0.09±0.03 0.95±0.21 0.14±0.05 0.15±0.06葛根素 50 μg/mL 組 10 0.12±0.03* 0.84±0.18 0.18±0.06 0.21±0.07葛根素 100 μg/mL 組 10 0.28±0.07** 0.67±0.13** 0.47±0.09** 0.72±0.14**葛根素 200 μg/mL 組 10 0.41±0.13**## 0.14±0.05** 1.14±0.27**# 8.13±1.95**##順鉑 20 μg/mL 組 10 0.19±0.06** 0.16±0.06** 0.86±0.21** 5.38±1.20**

表4 各組HepG2細(xì)胞Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達(dá)及LC3-II/LC3-I比值比較（±s）Tab.4 Comparison of Beclin1，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ expression and the ratio of LC3-II/LC3-I of HepG2 cells in each group（±s）

表4 各組HepG2細(xì)胞Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達(dá)及LC3-II/LC3-I比值比較（±s）Tab.4 Comparison of Beclin1，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ expression and the ratio of LC3-II/LC3-I of HepG2 cells in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與順鉑 20 μg/mL 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 樣本數(shù) Beclin1/β-actin LC3-Ⅰ/β-actin LC3-Ⅱ/β-actin LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ空白組 10 0.21±0.06 0.03±0.01 0.05±0.02 1.67±0.49葛根素 50 μg/mL 組 10 0.27±0.08 0.04±0.02 0.08±0.03 2.01±0.57葛根素 100 μg/mL 組 10 0.33±0.07* 0.12±0.05* 0.27±0.06* 2.25±0.54*葛根素 200 μg/mL 組 10 0.48±0.13*## 0.20±0.07* 0.73±0.18*# 3.65±0.79*#順鉑 20 μg/mL 組 10 0.29±0.08* 0.18±0.06* 0.52±0.12* 2.89±0.61*

3 討論

肝癌是世界范圍內(nèi)常見惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例超過100萬，其中40%以上的患者分布在中國，中國肝癌發(fā)病率居惡性腫瘤第四位、病死率居第3位[9]。雖然近年來人民生活條件明顯改善、乙型肝炎疫苗得到普及，但肝癌發(fā)病率并未出現(xiàn)下降趨勢。因此，尋找新型高效的抗肝癌藥物仍是目前醫(yī)藥工作者的研究熱點。

肝癌在中醫(yī)屬“癥瘕”“臌脹”“黃疸”等范疇，中藥葛根以豆科植物野葛的干燥根入藥，收入《中國藥典》，是長期應(yīng)用于臨床的中藥品種，葛根素是提取自葛根的一種異黃酮類化合物，目前臨床上主要用于缺血性心腦血管疾病的治療，近年來葛根素抗腫瘤活性得到廣泛關(guān)注。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根素干預(yù)能夠明顯提高人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率，誘導(dǎo)自噬溶酶體生成；葛根素200μg/mL組效果優(yōu)于順鉑20 μg/mL組，提示葛根素具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬的藥理學(xué)作用。

凋亡和自噬是細(xì)胞程序性自主死亡的兩種主要途徑，均由多種基因調(diào)控[10]。線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑由Bcl-2家族、Caspase家族蛋白等參與調(diào)控[11]。腫瘤發(fā)病過程中，由于腫瘤細(xì)胞過度增殖但新生血管相對缺乏而局部缺氧，引發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、Ca2+超載等而病理性刺激Bcl-2家族蛋白Bax上調(diào)表達(dá)并移位到線粒體膜、導(dǎo)致膜通透性改變，細(xì)胞色素C（Cyt C）釋放，從而啟動細(xì)胞凋亡。Cyt C是Caspase家族蛋白的主要激活因子，其中Cleaved Caspase-3將通過剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白等而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞凋亡最重要的執(zhí)行者；Bcl-2蛋白位于線粒體膜，能夠與Bax形成異源二聚體而抑制Bax促凋亡活性，保護(hù)線粒體膜通透性，表現(xiàn)出抑凋亡活性[12]。LC3蛋白位于于自噬溶酶體膜，能夠與線粒體受體蛋白結(jié)合而誘導(dǎo)期降解，因此LC3可作為細(xì)胞自噬活性的標(biāo)志蛋白[13]。LC3以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種亞型存在，LC3-Ⅱ具有自噬活性，當(dāng)細(xì)胞自噬發(fā)生時無活性的LC3-Ⅰ將轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值能夠反映細(xì)胞自噬水平[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根素干預(yù)能夠明顯上調(diào)人肝癌HepG2細(xì)胞 Cleaved Caspase-3、Bax、LC3-I、LC3-Ⅱ表達(dá)并下調(diào)Bcl-2表達(dá)，提高Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，并且葛根素200 μg/mL組對上述蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于順鉑20 μg/mL組。

Akt是一種原癌基因，被磷酸化（p-Akt）激活后能夠誘導(dǎo)Caspase家族蛋白磷酸化而失活，抑制Bax表達(dá)與轉(zhuǎn)移[15]。mTOR為Akt下游基因，能夠被p-Akt誘導(dǎo)mTOR磷酸化（p-mTOR）而激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期素上調(diào)表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、清除泛素蛋白而抑制細(xì)胞自噬[16]。此外，p-mTOR能夠誘導(dǎo)下游自噬特征蛋白Beclin1磷酸化而失活，Beclin1是介導(dǎo)LC3等自噬蛋白位移至自噬體的關(guān)鍵因子，從而間接促進(jìn)細(xì)胞自噬[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根素干預(yù)能夠明顯下調(diào)p-Akt、p-mTOR表達(dá)并抑制Akt磷酸化，上調(diào)Beclin1表達(dá)，并且葛根素200 μg/mL組對p-Akt、p-mTOR、Beclin1表達(dá)及 Akt磷酸化的調(diào)控作用優(yōu)于順鉑20 μg/mL組，提示葛根素對HepG2細(xì)胞凋亡、自噬的調(diào)控作用可能與抑制Akt/mTOR/Beclin1通路有關(guān)。

綜上所述，葛根素具有誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡與自噬的藥理學(xué)作用，抑制Akt/mTOR/Beclin1通路進(jìn)而誘導(dǎo)促凋亡、促自噬相關(guān)蛋白表達(dá)與活化可能是其重要的分子機制。本研究為體外細(xì)胞實驗，結(jié)果提示葛根素具有較良好的抗肝癌細(xì)胞活性，但肝癌的發(fā)生發(fā)展具有復(fù)雜的病理機制，受多種因素影響，因此葛根素抗肝癌作用及相關(guān)機制仍需體內(nèi)實驗進(jìn)一步研究。