大黃牡丹湯調(diào)控HMGB1/RAGE/NF-κB信號(hào)通路干預(yù)急性胰腺炎模型大鼠的機(jī)制

宋 冰，辜吉秀，汪永鋒，張延英，余四九*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 甘肅省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)技術(shù)中心，蘭州 730000；3.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，蘭州 730000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)作為急腹癥的一種，在臨床診療中較為常見(jiàn)，其特點(diǎn)是可以由多種病因引發(fā)，導(dǎo)致胰酶在胰腺內(nèi)被異常激活，從而引起胰腺組織發(fā)生自身消化、水腫、充血、出血直至進(jìn)一步壞死的局部性炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至能引發(fā)全身炎性反應(yīng)并伴隨多個(gè)臟器損傷，引發(fā)死亡風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。因此，如何有效阻斷炎性反應(yīng)的發(fā)生成為目前研究的重點(diǎn)。本研究復(fù)制AP動(dòng)物模型并使用具有“瀉熱通腑”功效的大黃牡丹湯進(jìn)行干預(yù)，前期研究[4]已經(jīng)表明，大黃牡丹湯可以有效改善大鼠一般生存狀況、肝腎功能以及胰腺組織病理改變，然而，關(guān)于其有效降低炎性反應(yīng)的機(jī)制尚不明晰。大量研究表明[5-6]，腺泡細(xì)胞的損傷致使大量的高遷移族率蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)分泌于細(xì)胞外，進(jìn)而激活下游糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)表達(dá)，放大核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)發(fā)生。目前鮮有基于該信號(hào)通路開(kāi)展大黃牡丹湯有效干預(yù)AP的研究報(bào)道。本文旨在繼續(xù)研究大黃牡丹湯治療對(duì)胰腺組織內(nèi)HMGB1/RAGE/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子基因和蛋白表達(dá)水平以及下游炎性因子含量的影響，以揭示其對(duì)AP的作用機(jī)制，為臨床防治急性胰腺炎提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取2月齡SPF級(jí)Wistar大鼠96只，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：62001000000580(甘肅中醫(yī)藥大學(xué))，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證明號(hào)：00000563(甘肅中醫(yī)藥大學(xué))。飼養(yǎng)條件同文獻(xiàn)[4]。

1.1.2 主要試劑與儀器 大黃牡丹湯組方及來(lái)源同文獻(xiàn)[4]。奧曲肽，批號(hào)：171018，國(guó)藥一心制藥有限公司生產(chǎn)；大鼠TNF-α試劑盒、大鼠IL-6試劑盒、大鼠IL-1β試劑盒均購(gòu)自江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)：1907R；GAPDH抗體、HMGB1抗體購(gòu)自美國(guó)ImmunoWay公司，批號(hào)：B1501、B8301；RAGE抗體、p-NF-κB p65抗體、p-IκBα抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司，批號(hào)：821904538、821904930、821403585；凝膠成像分析系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄儀、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型復(fù)制 采用胰膽管逆行注射?；悄懰徕c溶液建立大鼠急性胰腺炎模型，同文獻(xiàn)[4]，假手術(shù)組采用相同方法注射生理鹽水。

1.2.2 動(dòng)物分組及試驗(yàn)干預(yù) 分組方法同文獻(xiàn)[4]，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、陽(yáng)性藥物對(duì)照組(C組)和大黃牡丹湯高(D組)、中(E組)、低(F組)3個(gè)試驗(yàn)劑量組，每組16只。假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃給予生理鹽水10 mL·kg-1；陽(yáng)性藥物對(duì)照組皮下注射奧曲肽10 μg·kg-1；高、中、低3個(gè)劑量試驗(yàn)組分別灌胃大黃牡丹湯14、7和3.5 g·kg-1，連續(xù)給藥6 d(大黃牡丹湯給藥劑量設(shè)定方法：大黃牡丹湯劑量參考《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[11]，根據(jù)臨床用量的體重折算，大鼠的等效劑量約為7 g·kg-1，即大黃牡丹湯中劑量組；按照等比級(jí)數(shù)分組確定大黃牡丹湯高、低劑量組的給藥劑量分別為14和3.5 g·kg-1)。

1.2.3 形態(tài)指標(biāo)測(cè)試及取材 同文獻(xiàn)[4]記錄大鼠攝食量及體重，藥物干預(yù)6 d后心臟采血分離血清，常規(guī)麻醉后行頸椎脫臼法處死，取胰腺組織。

1.2.4 血清生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)各組大鼠血清中淀粉酶(amylase，AMS)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alamine aminotransferase，ALT)含量，同文獻(xiàn)[4]。

1.2.5 胰腺組織病理學(xué)改變檢查 常規(guī)制備大鼠胰腺組織石蠟切片、HE染色，在顯微鏡下觀察各組大鼠的胰腺病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)胰腺組織中炎癥因子含量 按照ELISA試劑盒隨附的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行嚴(yán)格操作，檢測(cè)胰腺組織中因子IL-1β、TNF-α、IL-6，同文獻(xiàn)[4]。

1.2.7 RT-PCR法檢測(cè)胰腺組織HMGB1、RAGE基因表達(dá)水平 使用TRIzol提取胰腺組織總RNA并測(cè)定其濃度以及OD260 nm/OD280 nm比值，同文獻(xiàn)[4]。嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)加樣并進(jìn)行擴(kuò)增。選取β-actin作為內(nèi)參基因，得到各擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物的合成由寶生物工程(大連)有限公司完成，引物的具體序列見(jiàn)表1。

表1 基因的引物序列

1.2.8 IHC法檢測(cè)胰腺組織HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)水平 取胰腺組織切片行常規(guī)免疫組化操作手法；并使用光學(xué)顯微鏡觀察，分析計(jì)算各組的平均光密度(IOD)值。

1.2.9 Western blot法檢測(cè)胰腺組織NF-κBp65、IκB蛋白磷酸化水平 同文獻(xiàn)[4]提取胰腺組織蛋白提取液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗，洗膜，孵育二抗，洗膜，最后采用ECL發(fā)光液化學(xué)發(fā)光，對(duì)圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 一般狀況觀察[4]

假手術(shù)組(A組)大鼠表現(xiàn)基本正常，模型組(B組)一般生活狀況較差，各治療組(C、D、E、F組)大鼠癥狀不同程度減輕，尤其以大黃牡丹湯高劑量組改善最明顯。

2.2 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響[4]

如表2所示，與假手術(shù)組(A組)比較，模型組(B組)大鼠AMS、ALT、AST含量顯著升高(P<0.05)；與模型組(B組)比較，各治療組(C、D、E、F組)大鼠AMS、ALT、AST均下降，其中尤以大黃牡丹湯高、中劑量組顯著(P<0.05)。

表2 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響

2.3 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠胰腺組織病理改變的影響

各組大鼠胰腺組織病理改變?nèi)鐖D1。假手術(shù)組(A組)大鼠的胰腺組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常；模型組(B組)大鼠的胰腺組織腺泡和小葉導(dǎo)管損傷嚴(yán)重，炎性充血水腫明顯，基本不可見(jiàn)正常形態(tài)；各治療組(C、D、E、F組)均不同程度可見(jiàn)胰腺組織腺泡和小葉導(dǎo)管損傷，炎性充血水腫等，但均較模型組(B組)不同程度減輕，尤以大黃牡丹湯高劑量組最顯著。

A～F.A組～F組

2.4 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠胰腺組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影響

與假手術(shù)組(A組)比較，模型組(B組)大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6含量顯著升高(P<0.05)；與模型組(B組)比較，各治療組(C、D、E、F組)大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6均下降(P<0.05或P>0.05)，其中尤以大黃牡丹湯高劑量組最明顯(P<0.05，圖2)。

圖2 大黃牡丹湯對(duì)炎癥因子的影響

2.5 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠胰腺組織中HMGB1、RAGE基因表達(dá)水平的影響

如圖3所示，與假手術(shù)組(A組)比較，模型組(B組)大鼠HMGB1、RAGE基因表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組(B組)比較，各治療組(C、D、E、F組)大鼠HMGB1、RAGE基因表達(dá)均下降(P<0.05或P>0.05)，其中尤以大黃牡丹湯高劑量組最明顯(P<0.05)。

圖3 大黃牡丹湯對(duì)HMGB1、RAGE基因表達(dá)的影響

2.6 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠胰腺組織HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)水平的影響

如圖4所示，光鏡下可以明顯觀察到組織形態(tài)的改變，黃染顆粒為陽(yáng)性染色，主要表達(dá)于胞核、胞質(zhì)中；各組IOD值統(tǒng)計(jì)表明：與假手術(shù)組(A組)比較，模型組(B組)大鼠HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組(B組)比較，各治療組(C、D、E、F組)大鼠HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)均下降(P<0.05或P>0.05)，其中尤以大黃牡丹湯高劑量組明顯(P<0.05)。

a、b.對(duì)HMGB1蛋白表達(dá)的影響；c、d.對(duì)RAGE蛋白表達(dá)的影響

2.7 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠胰腺組織p-NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)的影響

如圖5、圖6所示，與假手術(shù)組(A組)比較，模型組(B組)大鼠p-NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)顯著升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組(B組)比較，各治療組(C、D、E、F組)大鼠p-NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)均下降(P<0.05或P>0.05)，其中尤以大黃牡丹湯高劑量組最明顯(P<0.05)。

圖5 胰腺組織p-NF-κBp65、p-IκBα蛋白電泳圖

圖6 大黃牡丹湯對(duì)p-NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

?；悄懰徕c的分子式是C26H44NNaO7S，是一種有細(xì)胞毒性的化學(xué)物質(zhì)，能夠通過(guò)誘導(dǎo)方式導(dǎo)致胰腺發(fā)生損傷，但該損傷具有劑量依賴的特點(diǎn)，研究人員通過(guò)注射不同濃度的牛磺膽酸鈉溶液進(jìn)行造模，得到相應(yīng)病理?yè)p害程度的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，經(jīng)胰膽管逆行注射?；悄懰徕c復(fù)制急性胰腺炎動(dòng)物模型是目前國(guó)內(nèi)使用較為廣泛的實(shí)驗(yàn)方法[7-8]。本研究采用該法造模后，取模型組大鼠血清，經(jīng)生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大鼠AMS急劇升高，肝損傷嚴(yán)重(ALT、AST)；取胰腺組織鏡下觀察，胰腺組織腺泡細(xì)胞大量壞死，小葉導(dǎo)管結(jié)構(gòu)模糊，葉間隔明顯增寬，可見(jiàn)大量充血、水腫以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，均提示模型復(fù)制成功。

中藥方劑大黃牡丹湯的功效是瀉熱破瘀、散結(jié)消腫。在此方中，大黃可以清瀉濕熱瘀結(jié)之毒；芒硝能夠助大黃清熱解毒，瀉下通便；桃仁、丹皮有涼血散血、活血化瘀的作用；冬瓜仁有排膿散結(jié)，兼有利濕的功效；五味藥配伍精當(dāng)，共同發(fā)揮瀉熱破瘀、散結(jié)消腫的功效[4]。臨床實(shí)踐表明[9-10]，大黃牡丹湯及加減治療 AP 療效顯著，本課題組前期動(dòng)物試驗(yàn)亦證實(shí)了這一點(diǎn)[4]。

大黃牡丹湯方中牡丹皮的藥效活性成份主要包括芍藥苷和丹皮酚[11]，均具有顯著的抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛等作用，Li等[12]使用溶血磷脂酰膽堿(LPC)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，在應(yīng)用芍藥苷干預(yù)后能使細(xì)胞的存活率提高，降低了HMGB1及其受體RAGE的表達(dá)和釋放，表明芍藥苷通過(guò)抑制HMGB1-RAGE/NF-κB途徑抑制LPC誘導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生；錢哲等[13]發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可以通過(guò)調(diào)控HMGB1/NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)，顯著降低組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量；Qiu等[14]研究表明，丹皮酚通過(guò)抑制HMGB1/NF-κB信號(hào)通路及細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用；Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能夠抑制HMGB1-NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子HMGB1、NF-κB以及下游炎癥因子TNF-α表達(dá)。Ping等[16]在研究丹皮酚干預(yù)晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products,AOPP)導(dǎo)致的THP-1巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷中，發(fā)現(xiàn)其可以顯著降低RAGE的表達(dá)水平，下調(diào)促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的mRNA和蛋白質(zhì)水平，表明丹皮酚具有抗炎和抗氧化活性的功效。大黃同樣具有顯著抗炎效果，鞏博等[17]報(bào)道，在膿毒癥大鼠模型中使用大黃能夠抑制HMGB1、RAGE的蛋白表達(dá)水平，降低NF-κB的活化程度；大黃的活性物質(zhì)主要包括蒽醌類大黃酸和大黃素[18]，田新瑋等[19]采用不完全氟氏佐劑及牛Ⅱ膠原乳化劑建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，在使用大黃素進(jìn)行治療后，發(fā)現(xiàn)血清中HMGB1蛋白表達(dá)，TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著減少，可通過(guò)降低炎癥反應(yīng)緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀；黃慧娜等[20]也通過(guò)細(xì)胞試驗(yàn)證明，大黃酸能有效抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激下RAW264.7 細(xì)胞 HMGB1 的表達(dá)和釋放；夏麗等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可以抑制RAW264.7 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞NF-κB、IL-1、TNF-α的表達(dá)。桃仁的具體成分尚不明晰，而其水煎液或提取物均表現(xiàn)出不同程度的抗炎作用，如吳飛飛和張邢煒[22]使用桃仁提取物干預(yù)冠心病(coronary heart disease，CHD)模型大鼠，發(fā)現(xiàn)心肌組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低，血清中TNF-α、IL-6水平也明顯下降，表明其可以阻斷NF-κB/COX-2通路進(jìn)而抑制炎癥因子表達(dá)，減輕心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用；以敏等[23]使用桃仁提取物干預(yù)血瘀證大鼠模型，發(fā)現(xiàn)可以降低血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB的表達(dá)，抑制損傷性細(xì)胞因子的合成和表達(dá)，使組織細(xì)胞不易損傷，預(yù)防微循環(huán)障礙性損傷。冬瓜子的相關(guān)研究相對(duì)較少，但亦有關(guān)于其抗炎作用的報(bào)道，如姜文等[24]研究發(fā)現(xiàn)，使用冬瓜子干預(yù)肺纖維化大鼠模型，血清中TNF-α等炎性因子出現(xiàn)了明顯的降低，提示其在抑炎作用方面具有顯著效果。

高遷移族率蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)是一種高度保守的核蛋白，生理?xiàng)l件下其參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)以及細(xì)胞自噬等多種生物學(xué)事件[25]。研究表明，發(fā)生損傷的腺泡細(xì)胞可以向細(xì)胞外分泌大量的HMGB1，而釋放到細(xì)胞外的HMGB1可通過(guò)糖基化終產(chǎn)物受體刺激NF-κB信號(hào)通路的激活來(lái)介導(dǎo)大量促炎介質(zhì)如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等的釋放，進(jìn)而級(jí)聯(lián)式放大炎性反應(yīng)[5-6]。RAGE是第一個(gè)被證明能與HMGB1結(jié)合的受體，研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1通過(guò)RAGE介導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞的趨化、增殖等功能[26-28]。已經(jīng)有臨床研究證實(shí)，HMGB1的異常升高能夠反映AP患者病情嚴(yán)重程度,同時(shí)其異常釋放對(duì)AP患者肝功能以及預(yù)后關(guān)系密切[29]。此外，動(dòng)物試驗(yàn)表明，在重癥急性胰腺炎小鼠模型的胰腺組織中，HMGB1、NF-κB p65有顯著升高，而藥物干預(yù)后緩解重癥急性胰腺炎小鼠胰腺損傷與降低HMGB1、NF-κB p65蛋白表達(dá)有關(guān)[30]。

本研究中，和假手術(shù)組進(jìn)行比較，模型組大鼠胰腺組織中HMGB1、RAGE基因蛋白表達(dá)，下游蛋白NF-κBp65、IκBα磷酸化水平，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高(P<0.05)；和模型組進(jìn)行比較，各治療組大鼠胰腺組織中HMGB1、RAGE基因及蛋白表達(dá)，下游蛋白NF-κBp65、IκBα磷酸化水平，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量不同程度降低，各組中尤其是大黃牡丹湯高劑量組的情況改善最為明顯(P<0.05)。說(shuō)明大劑量大黃牡丹湯有效抑制了HMGB1/RAGE/NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而調(diào)控炎性因子的分泌，減輕由此產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)式炎性放大反應(yīng)，促進(jìn)胰腺組織細(xì)胞的修復(fù)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

大黃牡丹湯能夠顯著緩解大鼠急性胰腺炎疾病進(jìn)展，其機(jī)制與大黃牡丹湯能夠抑制HMGB1/RAGE/NF-κB通路激活，進(jìn)而阻斷炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。