舒尼替尼通過抑制Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞自噬

曹　珮，姜學(xué)軍，席志軍△

(1. 北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿外科研究所， 北京　100034; 2. 中國科學(xué)院微生物研究所， 北京　100101)

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·論著·

舒尼替尼通過抑制Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞自噬

曹珮1，姜學(xué)軍2，席志軍1△

(1. 北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿外科研究所， 北京100034; 2. 中國科學(xué)院微生物研究所， 北京100101)

目的：研究舒尼替尼引起的腎癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞自噬的機(jī)制。方法：以腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN細(xì)胞為細(xì)胞模型，利用3-(4，5-二甲基)-5-(3-羧甲基苯環(huán))-2-(4-硫基苯)-2H-四唑鹽復(fù)合物[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，innersalt，MTS]檢測法觀察舒尼替尼對ACHN 細(xì)胞活性的影響；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)敲降自噬相關(guān)蛋白Beclin1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3融合蛋白(microtubule associated protein 1 light chain 3 fusion protein, LC3)檢測自噬與舒尼替尼引起的細(xì)胞凋亡。使用電子顯微鏡和熒光顯微鏡觀察在舒尼替尼作用下自噬體的形成；蛋白質(zhì)免疫印跡檢測舒尼替尼對LC3-Ⅱ的積累，自噬相關(guān)信號通路蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)、哺乳動物雷帕霉素受體( mammalian target of rapamycin, mTOR) 及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶( poly ADP-ribose polymerase，PARP) 切割的變化和過量表達(dá)，以及敲降A(chǔ)kt檢測誘導(dǎo)自噬的變化。結(jié)果: 舒尼替尼能顯著抑制ACHN的細(xì)胞活性，這種作用具有時間和濃度依賴性；敲降自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3減少自噬可改變舒尼替尼引起PARP的切割；透射和熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，舒尼替尼引起細(xì)胞自噬體明顯增加；蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示舒尼替尼增加自噬同時減少了Akt/mTOR的磷酸化。過量表達(dá)持續(xù)活化的Akt抑制了該化合物引起的自噬，而敲降A(chǔ)kt可促進(jìn)自噬發(fā)生。mTOR抑制劑雷帕霉素能上調(diào)舒尼替尼引起的自噬并促進(jìn)細(xì)胞活性的丟失。結(jié)論：舒尼替尼通過抑制Akt/mTOR信號通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞ACHN的自噬，其誘導(dǎo)的自噬與凋亡有關(guān)。

癌,腎細(xì)胞；細(xì)胞自噬；細(xì)胞凋亡；舒尼替尼；信號傳導(dǎo)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，是最常見的泌尿系惡性腫瘤之一，約80%～95%的原發(fā)性腎惡性腫瘤為腎細(xì)胞癌，因具有多耐藥基因等機(jī)制，腎癌對化療和放療均不敏感。2005年，美國食品藥品管理局批準(zhǔn)首個靶向治療藥物索拉非尼(sorafenib)上市，之后又陸續(xù)出現(xiàn)針對包括血管內(nèi)皮生長因子受體在內(nèi)的多種靶向治療藥物，其中舒尼替尼(sunitinib)是最具代表性的藥物，可以有效延長晚期腎細(xì)胞癌患者的腫瘤特異生存時間和總生存時間[1]，作為多靶點受體酪氨酸激酶抑制劑，舒尼替尼通過作用于血管內(nèi)皮生長因子受體、血小板衍生內(nèi)皮生長因子受體等靶點，一方面直接抑制腫瘤生長，一方面通過抑制腫瘤新生血管生成而間接抑制腫瘤生長[2]。

自噬是真核生物中普遍存在的現(xiàn)象，可分為巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬。根據(jù)降解目標(biāo)的不同，自噬又可以分為核自噬、線粒體自噬、過氧化物酶體自噬[3]。自噬作為一種適應(yīng)性機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞在惡性環(huán)境比如營養(yǎng)缺乏時，自噬可以主動降解一些過剩的細(xì)胞器和胞內(nèi)物質(zhì)，從而降低細(xì)胞對能量消耗，同時降解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)用于提供能量和作為其他物質(zhì)合成的底物，維持細(xì)胞生存[4]，但是過度的自噬也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，即自噬性細(xì)胞死亡，隨著對凋亡的研究，自噬性細(xì)胞死亡為腫瘤治療提供了新的思路[5]。自噬的信號通路主要為兩種：腺苷酸活化激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK) 信號通路和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白( phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)信號通路，前者主要受胞內(nèi)能量水平影響，而后者主要感受營養(yǎng)狀況和生長因子等多種胞外影響因素，調(diào)控細(xì)胞周期、翻譯、轉(zhuǎn)錄和代謝[6]，其中PI3K/Akt/mTOR通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有研究表明[7]，在腎癌中PI3K/Akt/mTOR 信號途徑上調(diào)S期激酶相關(guān)蛋白2 蛋白表達(dá)，從而激活mTORC1，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，活化的Akt也可能有助于腎細(xì)胞癌的血管生成[8]。已有實驗表明[9]，在透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌使用PI3K 抑制劑LY294002 或Akt 抑制劑后，基質(zhì)金屬蛋白酶-2水平明顯降低，該酶與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是，目前有關(guān)舒尼替尼對PI3K/Akt /mTOR、腎癌細(xì)胞自噬的影響及二者關(guān)系的報道較少，本研究旨在明確舒尼替尼對自噬和PI3K/Akt /mTOR的影響，進(jìn)而探討舒尼替尼引起ACHN自噬的作用機(jī)制，為腎細(xì)胞癌靶向治療提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和質(zhì)粒

ACHN細(xì)胞購自美國ATCC 公司；質(zhì)粒myrAkt1(9008)、 myrAkt2(9016)購自美國Addgene公司，于中國科學(xué)院微生物研究所姜學(xué)軍實驗室保存。

1.2藥品和抗體

氯喹(chloroquine diphosphate salt, CQ，C6628)、雷帕霉素(R0395)及多克隆LC3-ⅡB抗體購自美國Sigma Aldrich 公司，Z-VAF-FMK(FMK001) 購自美國R&D systems 公司，p-mTOR(Ser2448、2971)、mTOR (2972)、p-Akt (Ser473、9271)、totle-mTOR(4691)、totle-Erk1/2(9102)、PARP抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司，Beclin1 、LC3-Ⅱ、Akt1、Akt2、Akt3特異性siRNA 與對照siRNA 購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，Actin抗體購自北京中杉金橋公司。

1.3儀器設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自日本Panasonic SANYO公司，小型臺式離心機(jī)購自美國Thermo公司，臺式冷凍高速離心機(jī)購自美國Sigma-Aldrich 公司，-20 ℃低溫冰箱購自中國海爾公司，-80 ℃低溫冰箱購自德國Heraeus 公司，AL204 電子天平購自美國Mettler Toledo公司，正置熒光顯微鏡(Axio Imager A1) 購自德國Zeiss 公司，mini Trans-Blot 電轉(zhuǎn)儀購自美國Bio-RAD 公司，AE-6500 型電泳槽購自日本ATTO 公司，JY600C 恒壓恒流電泳儀購自中國北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，MilliQ plus 超純水系統(tǒng)購自美國Millipore 公司，Biospec-nano UV-VIS 分光光度計購自日本島津公司。

1.4試劑耗材

DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國GIBCO 公司，青鏈霉素混合物和胰蛋白酶消化液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，PVDF膜購于美國Amersham公司，發(fā)光液購于美國Thermo公司，Attractene 轉(zhuǎn)染試劑購于德國QIAGEN公司。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)

ACHN細(xì)胞用10%(體積分?jǐn)?shù)) 胎牛血清和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青鏈雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時棄去舊培養(yǎng)基，用PBS 洗1 遍，用胰酶消化貼壁細(xì)胞，然后以1 000 r/min 離心3 min 后收集細(xì)胞，棄去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基重懸。將細(xì)胞分到6孔板內(nèi)，37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞生長至60%～70%，按需要濃度加入舒尼替尼和其他化合物處理指定時間后收集細(xì)胞。

1.6siRNA干擾

在準(zhǔn)備siRNA 干擾實驗12 h前，把所需細(xì)胞以上述方法按30% 密度接種于培養(yǎng)皿中。參考轉(zhuǎn)染試劑說明書將siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑分別加入無血清DMEM 培養(yǎng)基中，靜置5 min 后混合，再次靜置20 min，將混合好的DMEM 培養(yǎng)基加入換為新培養(yǎng)基(含血清) 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，干擾36 h后再次更換新鮮培養(yǎng)基，按需要濃度加入舒尼替尼和其他化合物處理指定時間后收集細(xì)胞。

1.7細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞按上述方法分到6 cm培養(yǎng)皿中，37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞密度達(dá)60%～70%。用Attractene 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染myrAkt1或myrAkt2質(zhì)粒，24 h后將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，加入舒尼替尼(4 μmol/L)處理2 h后收集細(xì)胞。

1.8電子顯微鏡樣品的制備

將ACHN細(xì)胞接種于直徑6 cm 的培養(yǎng)皿中，于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%。換新鮮培養(yǎng)基，按8 μmol/L終濃度加入舒尼替尼和DMSO處理4 h。完成處理時間后立即用胰酶消化細(xì)胞，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min 后收集細(xì)胞，冷PBS 洗滌兩遍。加入3%(體積分?jǐn)?shù)) 戊二醛溶液，4 ℃過夜固定，送樣檢驗。

1.9熒光顯微鏡觀察

所需細(xì)胞以前述方法按80%密度接種于有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)12 h。按8 μmol/L 終濃度加入舒尼替尼處理4 h后取出爬片，用4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液室溫固定15 min，而后用PBS洗3遍，穿透液組成 100 mL PBS, 1%(體積分?jǐn)?shù)) Triton X-100, 0.5%(體積分?jǐn)?shù)) BSA,穿透15 min, 一抗室溫避光孵育1 h，PBS洗3遍，二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗3遍，最后用DAPI 染色并封片。制作好的細(xì)胞爬片以熒光顯微鏡觀察LC3-Ⅱ熒光聚集情況。

1.10蛋白質(zhì)免疫印跡

按指定時間處理細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用冷PBS洗1遍，加入一定量的細(xì)胞裂解液，裂解液組成: 1 mL 母液[1%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100， 10%(體積分?jǐn)?shù))甘油，50 mmol /L Hepes，pH 7.4]，2.5 mol /L NaCl 20 μL，0.5 mol /L EGTA/EDTA 10 μL，0.1 mol /L NaF 10 μL，0.1 mol /L PMSF 20 μL，1 mol/L DTT 2 μL，0.5 mol/L Na3VO42 μL，蛋白酶抑制劑1 μL。然后用細(xì)胞刮鏟均勻收集培養(yǎng)皿所有部位的細(xì)胞移入離心管內(nèi)，加入相當(dāng)于裂解液一半體積的上樣緩沖液，96 ℃ 煮樣30 min后，室溫離心13 000 r /min 15 min，收集上清液。等量樣品經(jīng)過8%或13.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-PAGE 分離蛋白，并上樣跑膠分離蛋白質(zhì)，之后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。將轉(zhuǎn)有蛋白質(zhì)的PVDF膜于5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))奶粉封閉液室溫封膜60 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育60 min，經(jīng)適當(dāng)漂洗后涂抹發(fā)光液，并于暗室曝光洗片，最后將底片掃描并進(jìn)行分析。

1.11MTS檢測細(xì)胞存活率

將5 000～10 000個細(xì)胞消化并均勻接種于96 孔板中，每孔體積為100 μL，培養(yǎng)過夜后換無酚紅DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基。每3 個孔為一組平行對照，未干擾的細(xì)胞按2 μmol/L和8 μmol/L 的終濃度加入舒尼替尼，37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行培養(yǎng)24、48和72 h。每孔加MTS 和PMS(20 ∶1) 混合溶液20 μL，使用酶聯(lián)免疫檢測儀于492 nm 波長測定各孔光密度(D)值。

1.12統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，MTS 實驗結(jié)果以單因素方差分析和Student-Newman-Keuls(S-N-K) 法兩兩比較分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1舒尼替尼引起細(xì)胞活性丟失，該作用與細(xì)胞自噬有關(guān)

舒尼替尼作為腎癌靶向治療藥物，對腎癌細(xì)胞具有殺傷作用，MTS實驗印證了這一點，在不同濃度(2、8 μmol/L)舒尼替尼的作用下，ACHN活性逐漸降低，以8 μmol/L組活性最低，即濃度依賴；同時，對ACHN細(xì)胞處理不同時間(24、48、72 h)發(fā)現(xiàn)舒尼替尼的細(xì)胞毒作用存在時間依賴性(圖1A)。相同處理時間3組(DMSO、舒尼替尼2 μmol/L、舒尼替尼8 μmol/L)活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(24 h：F=705.6，P=7.6×10-8；48 h：F=519.1，P=1.9×10-7；72 h：F=329.8，P=7.3×10-7)，之后使用S-N-K 法兩兩比較發(fā)現(xiàn)，任意兩組間比較差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義。Beclin1和LC3是自噬不可缺少的蛋白質(zhì)，在自噬體的形成過程中起關(guān)鍵作用。敲降Beclin1或LC3導(dǎo)致自噬體不能形成，造成細(xì)胞低自噬水平，用終濃度為8 μmol/L舒尼替尼刺激細(xì)胞，PARP相對于空白對照組切割增多，表明舒尼替尼引起的細(xì)胞凋亡與自噬有關(guān)(圖1B)。

MTS assay was taken as the cells were treated for 24, 48, 72 hours by sunitinib (2, 8 μmol/L). The cell viability loss induced by sunitinib was concentration-dependent and time-dependent. One-way ANOVA was used to test whether there exists the difference among three groups (DMSO, sunitinib 2 μmol/L, sunitinib 8 μmol/L ) in the 24-hour group, 48-hour group and 72-hour group .The result has statistical significance (24-hour group: F=705.6, P=7.6×10; 48-hour group: F=337.3,P=1.9×10； 72-hour group: F=329.8, P =7.3×10). And there are statistical differences between any two groups of DMSO, sunitinib 2 μmol/L, sunitinib 8 μmol/L tested by S-N-K after one-way ANOVA(A). After knocking down Beclin1 or LC3 (siBeclin1, siLC3) the ACHN were treated with sunitinib (8 μmol/L) for 4 hours. Then harvested cells and analyzed the indicating protein by immunobloting. Compared against mock (control siRNA), sunitinib-induced cleavage of PARP increased. c, cleavage(B).
圖1舒尼替尼引起ACHN活性喪失，該作用與自噬有關(guān)
Figure 1Sunitinib (ST) induced cell vialibility loss in ACHN, correlated with autophagy

2.2舒尼替尼誘導(dǎo)ACHN細(xì)胞自噬增強(qiáng)

透射電子顯微鏡是觀察細(xì)胞自噬最可靠的方法之一， 也是首先發(fā)現(xiàn)并報道自噬的方法[10]。 電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)用舒尼替尼(8 μmol/L)處理ACHN細(xì)胞4 h后，細(xì)胞中的自噬體數(shù)量較對照組明顯增加(圖2A)。LC3-Ⅱ被認(rèn)為是自噬的特異性標(biāo)志，細(xì)胞自噬活動較弱時LC3-Ⅱ彌散分布于細(xì)胞中且多位于細(xì)胞核中，當(dāng)自噬活動增強(qiáng)時游離的LC3-Ⅰ聚集到胞質(zhì)自噬體上并經(jīng)蛋白酶水解及脂化作用形成LC3-Ⅱ，呈現(xiàn)點狀聚集[3]。本實驗熒光顯微鏡顯示舒尼替尼(8 μmol/L)刺激ACHN細(xì)胞4 h后，內(nèi)源性LC3-Ⅱ在胞質(zhì)中增多，且熒光聚集程度增高(圖2B)。

前面提到，LC3以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式存在，前者與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合成為LC3-Ⅱ。在自噬增強(qiáng)時，LC3-Ⅰ脂化形成的LC3-Ⅱ增多，從而使LC3-Ⅱ含量增加,因此利用免疫雜交印跡檢測了經(jīng)不同濃度舒尼替尼(1、2、4、8 μmol/L)處理4 h后ACHN細(xì)胞中LC3-Ⅱ與內(nèi)參肌動蛋白Actin，發(fā)現(xiàn)隨著舒尼替尼濃度的增加(1、2、4、8 μmol/L)，LC3-Ⅱ/Actin的比值明顯增加。氯喹阻斷自噬體和溶酶體融合,抑制LC3-Ⅱ的降解，同時應(yīng)用舒尼替尼和氯喹，LC3-Ⅱ/Actin值仍明顯上升，舒尼替尼聯(lián)合應(yīng)用氯喹時LC3-Ⅱ/Actin的值與單獨應(yīng)用舒尼替尼的值之比(fold)大于1，說明LC3-Ⅱ的增加是由舒尼替尼誘導(dǎo)自噬流增強(qiáng)導(dǎo)致的(圖2C)。需要指出的是，在舒尼替尼濃度為8 μmol/L時fold值小于1，可能存在其他機(jī)制參與其中。

Akt/mTOR通路通常認(rèn)為是自噬的重要調(diào)節(jié)通路之一，mTOR可負(fù)向調(diào)節(jié)自噬過程。在ACHN細(xì)胞中可以看到，隨著濃度增加(1、2、4、8 μmol/L), mTOR及其上游調(diào)節(jié)蛋白的AKT的磷酸化逐漸被抑制，說明了舒尼替尼可通過抑制Akt/mTOR通路進(jìn)而激活自噬過程(圖2D)。

2.3舒尼替尼通過抑制Akt/mTOR通路誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞自噬

雷帕霉素是mTOR的特異性抑制劑，通過與細(xì)胞內(nèi)受體FKBP-12結(jié)合形成復(fù)合物后直接作用于mTOR中的FBKP12雷帕霉素結(jié)合位點(FKBP-12-rapamycin binding，F(xiàn)RB)而抑制蛋白活性。舒尼替尼(4 μmol/L)聯(lián)合雷帕霉素處理組LC3-Ⅱ 積累大于舒尼替尼(4 μmol/L)單獨處理組，故雷帕霉素可以增強(qiáng)舒尼替尼的自噬誘導(dǎo)作用(圖3A)。同樣，利用RNA干擾技術(shù)分別敲降A(chǔ)kt各亞基的表達(dá)可以看到，舒尼替尼(4 μmol/L)在敲降A(chǔ)kt2、Akt3的ACHN細(xì)胞中自噬誘導(dǎo)作用強(qiáng)于空白對照組，F(xiàn)old值均為1.5，大于對照組中的1.1；而在敲降A(chǔ)kt1時表現(xiàn)為抑制自噬的作用，說明在自噬中Akt的3個亞基作用可能不同(圖3B)。在Akt1和Akt2亞基過表達(dá)時，同時加入氯喹和舒尼替尼時Fold值小于對照組，說明其自噬減弱(圖3C)，以上結(jié)果說明舒尼替尼誘導(dǎo)自噬的作用是通過抑制AKT/mTOR通路實現(xiàn)的。

ACHN cells were observed by transmission electron microscope to detect the autophagic vacuoles. Compared to control, the group treated by sunitinib(8 μmol/L) for 4 hours showed more autophagosomes (A). LC3-Ⅱ were detected by immunofluorescence and positive dots translocation from nuclear to cytoplasm and more aggregation of LC3 could be observed in cells treated with sunitinib ( 8 μmol/L ) for 4 h (B). ACHN were treated with sunitinib (1, 2, 4, 8 μmol/L) for 4 hours and harvested as mentioned above. The gray value represented the number of protein, and the ratios of LC3-Ⅱ to Actin were presented below the blots. Chloroquine (CQ) combined with sunitinib could verify that increase of LC3-Ⅱ was due to induced autophagic flux (C). Accompanied with accumulation of LC3-Ⅱ, phosphorylation of Akt and mTOR decreased (D). Ctrl, control; ST, sunitinib; CQ, chloroquine diphosphate salt; p, phosphorylation; t, total.
圖2舒尼替尼增強(qiáng)ACHN細(xì)胞自噬并抑制Akt/mTOR的磷酸化
Figure 2Sunitinib strengthened the autophagy in ACHN and suppressed the phosphorylation of Akt and mTOR

3　討論

舒尼替尼作為受體酪氨酸激酶抑制劑，在腎癌靶向治療中有重要的作用，被國內(nèi)外腎癌治療指南中定位為晚期腎癌的一線治療藥物。自噬的發(fā)生可能是一種適應(yīng)性反應(yīng)，在細(xì)胞處于能量缺乏下維持細(xì)胞能量供需平衡，這一作用對于處于高代謝狀態(tài)下的腫瘤細(xì)胞尤為重要。自噬也可作為一種程序性死亡的方式，并且與凋亡存在機(jī)制上許多重疊的部分。

雖然舒尼替尼引起腎癌細(xì)胞自噬的研究尚未見報道，但已有舒尼替尼對其他細(xì)胞自噬、凋亡作用的報道，如在研究舒尼替尼引起的心臟毒性時，發(fā)現(xiàn)舒尼替尼作用于心肌細(xì)胞H9C2時可以引起細(xì)胞自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[11]，在膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可以引起膀胱癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞自噬依賴的細(xì)胞死亡[12]，而另一個基于多種腫瘤細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可以引起這些細(xì)胞的凋亡，而自噬抑制劑氯喹能夠協(xié)同舒尼替尼的細(xì)胞毒作用[13]。本研究設(shè)計抑制自噬的情況，觀察舒尼替尼對腎癌細(xì)胞的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制自噬可以減弱舒尼替尼的細(xì)胞毒性，提示自噬協(xié)同舒尼替尼對腎癌有殺傷作用。PI3K/AKT/MTOR信號通路參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可以作為腫瘤治療的又一靶點。在腎細(xì)胞癌裸鼠模型，PI3K抑制劑LY294002可以抑制Akt磷酸化和腫瘤生長[14]。mTOR抑制劑已在臨床上用于腫瘤的治療， mTOR抑制劑依維莫斯可以用于舒尼替尼治療失敗的晚期腎癌的治療。mTORc1是mTOR抑制劑的主要作用靶點，在抑制劑的作用下抑制促細(xì)胞分裂作用。雷帕霉素是一種研究較多的mTOR 抑制劑，通過抑制mTOR下游的p70s6k 和4E-BP1分子，抑制細(xì)胞由G1進(jìn)入S期的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑制mTOR 的作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在腎癌動物細(xì)胞模型mTOR 抑制劑與血管內(nèi)皮生長因子抑制劑(如舒尼替尼)具有協(xié)同抗腫瘤作用[15]。本研究干預(yù)Akt/mTOR信號通路，顯示舒尼替尼引起腎癌細(xì)胞自噬活動增強(qiáng)，明確了舒尼替尼通過抑制Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬。雖然已有證據(jù)顯示舒尼替尼對Akt/mTOR信號通路的作用，但具體的機(jī)制并不十分清楚，而且自噬對腫瘤的影響非常復(fù)雜，不同的藥物、不同的腫瘤中自噬的作用以及發(fā)生機(jī)制都可能不同[16]，仍需要深入研究。

Combined with mTOR inhibitor rapamycin, the ratios of LC3-Ⅱ to actin raised (A). Knocking down subunits of Akt, the sunitinib-induced autophagy could be enhanced as well (B). Overexpression of Akt subunits surpressed autophagy (C). CQ, chloroquine diphosphate salt.
圖3舒尼替尼通過抑制AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)ACHN自噬
Figure 3Sunitinib (ST) induced autophagy via suppressing Akt/mTOR pathway in ACHN

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)舒尼替尼可以引起腎癌細(xì)胞出現(xiàn)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的自噬增加的現(xiàn)象，并闡明了其作用的部分機(jī)制，一方面補(bǔ)充了舒尼替尼治療腎癌的部分作用機(jī)制，另一方面也為聯(lián)合自噬調(diào)節(jié)藥物與分子靶向藥物的新的治療方式提供了理論

基礎(chǔ)。

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(2016-04-09 收稿)

(本文編輯：王蕾)

Sunitinib induces autophagy via suppressing Akt/mTOR pathway in renal cell carcinoma

CAO Pei1, JIANG Xue-jun2, XI Zhi-jun1△

(1. Department of Urology， Peking University First Hospital; Institute of Urology， Peking University， Beijing 100034，China; 2. Institute of Microbiology， Chinese Academy of Science， Beijing 100101， China)

Objective： To determine the mechanism of sunitinib-induced autophagy in renal cell carcinoma cells. Methods: MTS assay was applied to detect the cell viability alteration under the treatment of sunitinib (2, 8 μmol/L). The sunitinib-induced autophagy as well as cell apoptosis was measured and compared after knocking down autophagy-related protein Beclin1 and microtubule associated protein 1 light chain 3 fusion protein (LC3) by RNA interference. The transmission electron microscope was used to observe the formation of autophagosomes in ACHN cells. The fluorescence microscope was used to monitor distribution and aggregation of endogenous LC3-Ⅱ. The expressions of protein such as LC3-Ⅱ, the autophagic regulation molecules protein kinase B/ mammalian target of rapamycin (Akt/mTOR) and the symbol of apoptosis poly ADP-ribose polymerase (PARP) were capable to be detected by immunoblotting assay. Results: Sunitinib was able to significantly trigger cell viability loss in the renal carcinoma cell ACHN, which was both in a concentration-dependent and time-dependent manner (P<0.05). After reducing the autophagy by knocking down Beclin1 and LC3, the number of cleavage of PARP was increased remarkably, whereas there was nearly not any cleavage in the mock group. By the transmission electron microscope, there were more autophagic vacuoles in ACHN cells after being administrated with sunitininb compared with the control. And the nuclear-to-cytosol translocation as well as aggregation of LC3-Ⅱ was presented after sunitinib treatment by the fluorescence microscope, which was the proof of the enhanced autophagy. According to the immunoblotting, sunitinib was able to increase the accumulation of LC3-Ⅱ. At the same time, the result of sunitinib combined with chloroquine, a drug which blocked the fusion of autophagosomes and lysosomes, demonstrated that the increasing amount of LC3-Ⅱ was due to the enhanced autophagy flux by sunitinib treatment in ACHN cells. However, phosphorylation of Akt as well as mTOR was decreased at the same time. The rapamycin (mTOR inhibitor) or knocking down Akt subunits could change the sunitinib-induced LC3-Ⅱ accumulation, whereas overexpression of Akt subunits decreased the autophagic flux, indicating that Akt/mTOR was the target of sunitinib in autophagy. Conclusion: Sunitinib induced autophagy via suppressing Akt/mTOR pathway, and the auto-phagy was involved in apopotosis.

Carcinoma, renal cell; Autophagy; Apoptosis; Sunitinib; Signal transduction

國家自然科學(xué)基金(81272829)資助Supported by the National Natural Science Foundation of China (81272829)

R737.1

A

1671-167X(2016)04-0584-06

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.04.003

△Corresponding author’s e-mail, xizhijun@hsc.pku.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-7-413：11：08網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160704.1311.002.html