改良人牙齦上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法

余婧婷， 孟煥新， 劉凱寧

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院1.牙周科，2.綜合科　口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室　口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京　100081)

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·技術(shù)方法·

改良人牙齦上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法

余婧婷1,2， 孟煥新1△， 劉凱寧1

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院1.牙周科，2.綜合科口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100081)

目的：建立穩(wěn)定的人牙齦上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，為牙周組織的細(xì)胞學(xué)研究提供可靠的細(xì)胞來(lái)源，對(duì)原有的原代培養(yǎng)方法進(jìn)行了改良，期望達(dá)到培養(yǎng)成功率高、原代培養(yǎng)時(shí)間短且操作簡(jiǎn)便的效果。方法： 選擇行“冠延長(zhǎng)術(shù)”的牙周相對(duì)健康者9人，取冠延長(zhǎng)術(shù)切除的領(lǐng)圈牙齦組織進(jìn)行牙齦上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，培養(yǎng)方法包括改良酶消化法和組織塊法。改良酶消化法使用2.5g/LDispaseⅡ酶(Ⅱ型分離酶)浸泡組織塊過(guò)夜，將上皮與結(jié)締組織分離，再用0.025%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不含EDTA(乙二胺四乙酸)的胰蛋白酶靜置消化上皮碎片10min，不棄去上皮碎片直接離心并重懸細(xì)胞，不僅降低了酶的消化濃度，減少了消化時(shí)間，還簡(jiǎn)化了重懸細(xì)胞的過(guò)程；組織塊法相對(duì)以往方法并無(wú)改良。觀察兩種方法所培養(yǎng)原代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程，在培養(yǎng)成功后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，并比較兩種方法的成功率和培養(yǎng)時(shí)間。結(jié)果： 改良后的酶消化法能夠比較快地培養(yǎng)出細(xì)胞特征明確的人牙齦上皮細(xì)胞，成功率達(dá)88.9%，且細(xì)胞成片狀生長(zhǎng)，10～14d后可傳代，傳至3代后細(xì)胞形態(tài)逐漸不規(guī)則直至凋亡，而組織塊法原代培養(yǎng)成功率雖然相同，但時(shí)間更長(zhǎng)，17～22d后才可傳代。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，角蛋白染色陽(yáng)性。結(jié)論： 改良酶消化法能夠快速培養(yǎng)出原代人牙齦上皮細(xì)胞并傳代，可作為細(xì)胞學(xué)研究的穩(wěn)定細(xì)胞來(lái)源。

牙齦；上皮細(xì)胞；原代細(xì)胞培養(yǎng)

牙齦上皮作為牙周組織的第一道屏障，在抵御牙周炎細(xì)菌入侵的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，建立正常人牙齦上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，將為各種牙齦上皮相關(guān)的研究提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｄ壳叭搜例l上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法主要有3種，即滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法、酶消化法和組織塊法，其中滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法易引入滋養(yǎng)層細(xì)胞DNA從而干擾實(shí)驗(yàn)[1]，而組織塊法貼壁時(shí)所用的含血清培養(yǎng)基含有高濃度的鈣離子會(huì)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分化，形成角化物，從而抑制上皮細(xì)胞分裂和增殖，使得上皮細(xì)胞生長(zhǎng)較慢[2-4]，酶消化法可以獲得較為單純優(yōu)良的細(xì)胞，但因?yàn)楦鞣N酶的消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞存活率不高(僅為11.8%)[5]。本研究擬尋求一種成功率較高的人牙齦上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，同時(shí)較快獲得單一體系的牙齦上皮細(xì)胞，為進(jìn)行牙齦上皮的細(xì)胞學(xué)研究提供穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象

本研究選取在北京大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科就診并行“冠延長(zhǎng)術(shù)”的牙周相對(duì)健康患者為研究對(duì)象。牙周相對(duì)健康定義為術(shù)區(qū)牙周探診深度不超過(guò)4mm，牙齦色粉紅，無(wú)紅腫或僅有輕度水腫，探診出血指數(shù)0～2。本研究開(kāi)始前經(jīng)過(guò)北京大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求，所有參與研究的患者均簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1牙齦上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)經(jīng)患者書面知情同意后，取冠延長(zhǎng)術(shù)中切取下來(lái)的“領(lǐng)圈”牙齦組織，立即放入含3～4倍雙抗的D-Hank’s液(平衡鹽溶液)中37 ℃約1h。酶消化法：傳統(tǒng)的酶消化法如Oda等[5]所述，將牙齦組織置于4g/LDispaseⅡ酶(Ⅱ型分離酶)1mL中37 ℃ 4h，上皮與結(jié)締組織可輕松用鑷子分離，將上皮剪成約0.5mm3碎塊，置于0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))含EDTA(乙二胺四乙酸)的胰蛋白酶2mL中搖床振蕩消化30min，至消化物成絮。加入含10%(體積分?jǐn)?shù))血清的DMEM培養(yǎng)基2mL中止消化，700r/min離心5min，棄去上清及組織塊，加適量無(wú)血清培養(yǎng)基再次重懸細(xì)胞沉淀并計(jì)數(shù)，以5×105/mL細(xì)胞密度接種于六孔板或6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每2天換液1次。本課題組對(duì)上述傳統(tǒng)方法進(jìn)行了改良：將牙齦組織置于2.5g/LDispaseⅡ酶(美國(guó)Sigma公司)中4 ℃過(guò)夜(約8h)，上皮與結(jié)締組織分離剪碎后，置于0.025%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不含EDTA的胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司1 ∶250胰蛋白酶配制)2mL中輕輕搖晃混勻，靜置消化10min， 加入含10%(體積分?jǐn)?shù))血清DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)中止消化，1 000r/min離心5min并棄去上清液，保留組織塊，加適量DefinedK-SFM含添加物無(wú)血清培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)重懸組織塊及細(xì)胞沉淀并計(jì)數(shù)接種，每2天換液1次。組織塊法[6]：剪去所有結(jié)締組織，將剩余上皮組織剪碎成的0.5mm3碎塊，平鋪于60mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，塊與塊之間均勻間隔5mm。將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，加入含10%(體積分?jǐn)?shù))血清的DMEM培養(yǎng)基，倒置于37 ℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中2h。待組織貼壁后，再次緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊浸沒(méi)于培養(yǎng)液中而不移動(dòng)。3d后觀察，若牙齦上皮細(xì)胞從組織塊爬出并貼壁于瓶底，視為細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，7d后棄去培養(yǎng)基，組織塊可隨換液棄去，D-Hank’s液沖洗3遍，加入DefinedK-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基(含添加物)，每2天換液1次。

1.2.2牙齦上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)原代牙齦上皮細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶底80%后，此時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，可開(kāi)始傳代。棄去培養(yǎng)液，用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))含EDTA胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)消化細(xì)胞，置于37 ℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱孵育3～5min，至細(xì)胞縮為圓形但仍貼壁，加入含10%(體積分?jǐn)?shù))血清的培養(yǎng)基DMEM中止消化，吹打細(xì)胞制成懸液，1 000r/min離心5min，棄去上清，加適量DefinedK-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基(含添加物)重懸細(xì)胞沉淀并計(jì)數(shù)接種于新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。

1.2.3牙齦上皮細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定將消化后的牙齦上皮細(xì)胞接種于玻璃爬片上，培養(yǎng)24h后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，經(jīng)丙酮固定，0.1%(體積分?jǐn)?shù)) 聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)滲透，3%(體積分?jǐn)?shù)) 過(guò)氧化氫(H2O2)處理，血清封閉后加入鼠抗人角蛋白單克隆抗體AE1/AE3(北京中杉金橋公司)，4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗后再依次加入生物素標(biāo)記的二抗(體積比1 ∶50稀釋)、辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫各孵育30min，DAB顯色，鏡下觀察，蘇木素復(fù)染，封片。

2　結(jié)果

2.1研究對(duì)象基本信息

納入本研究的患者共9人，年齡28～35歲，其中男性4人，女性5人(表1)。

利用改良酶消化法和組織塊法分別培養(yǎng)原代牙齦上皮細(xì)胞，除4號(hào)患者外，兩種方法均成功培養(yǎng)出牙齦上皮細(xì)胞，成功率為88.9%。

表1　納入研究的9名患者臨床資料

2.2牙齦上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)

傳統(tǒng)的酶消化法由于各種酶的作用時(shí)間和濃度較高，導(dǎo)致原代細(xì)胞培養(yǎng)成功率不高，本課題組對(duì)該方法進(jìn)行了一定改進(jìn)(表2)，成功率明顯提高。

表2　傳統(tǒng)酶消化法與改良后酶消化法的區(qū)別

本課題組利用改進(jìn)后的酶消化法培養(yǎng)的原代牙齦上皮細(xì)胞，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)滿80%以上(圖1)：貼壁的牙齦上皮細(xì)胞如“荷包蛋”樣，居中為圓形或橢圓形細(xì)胞核，透光性較差，周圍為胞漿，邊界不規(guī)則，透光性好。細(xì)胞分布均勻，融和成片，呈不規(guī)則多邊形，細(xì)胞間接觸緊密，呈典型的鋪路石狀。

組織塊法培養(yǎng)的原代牙齦上皮細(xì)胞形態(tài)類似，但由于細(xì)胞是以組織塊為中心向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)，可見(jiàn)原組織塊附近細(xì)胞較密集，周邊細(xì)胞較分散，分布不均勻(圖2)。

2.3牙齦上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和傳代

改良酶消化法培養(yǎng)的原代細(xì)胞貼壁10～14d后即長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部的80%并傳代，而組織塊法培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，7d后牙齦上皮細(xì)胞才開(kāi)始快速增殖，一般約17～22d才可傳代。二者成功率近似，除4號(hào)患者外其余均成功培養(yǎng)出牙齦上皮細(xì)胞，成功率為88.9%。

細(xì)胞傳代發(fā)現(xiàn)兩種方法培養(yǎng)的牙齦上皮細(xì)胞貼壁都較緊密，僅能消化30%的原代細(xì)胞。傳至二代上皮細(xì)胞形態(tài)均無(wú)明顯變化，但三代以后細(xì)胞開(kāi)始逐漸生長(zhǎng)緩慢，分化出現(xiàn)體積較大、形態(tài)不規(guī)則的“巨細(xì)胞”(圖3)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)數(shù)量不斷增加，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡和黑色顆粒，最終細(xì)胞逐漸凋亡。

改良酶消化法與組織塊法的比較見(jiàn)表3。

2.4細(xì)胞鑒定

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，鼠抗人角蛋白單克隆抗體AE1/AE3染色陽(yáng)性，胞漿棕黃色，核染色為陰性，經(jīng)蘇木素復(fù)染后呈藍(lán)色(圖4)，證明原代培養(yǎng)細(xì)胞為人牙齦上皮細(xì)胞。

A, ×10; B, ×20.
圖1患者8牙齦原代上皮細(xì)胞
Figure 1Primary gingival epithelial cells of patient case 8

圖2組織塊法培養(yǎng)原代上皮細(xì)胞分布不均勻，組織塊附近細(xì)胞密集，周邊細(xì)胞分散
Figure 2The cells cultured by the tissue explant method distribute unequally, with more cells concentrated around the tissue piece, and less cells peripherally

圖3巨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積較大，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡
Figure 3Giant cells are irregular, larger, with vacuoles in the cellular plasma

圖4免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定角蛋白染色陽(yáng)性
Figure 4Indirect immunocytochemical staining of cells, with positive cytokeratin staining

3　討論

本研究對(duì)經(jīng)典的牙齦上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法(酶消化法)的過(guò)程進(jìn)行了改進(jìn)，比較了該改進(jìn)的方法與傳統(tǒng)的組織塊法這兩種方法的成功率和生長(zhǎng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)酶消化法可以更加快速地培養(yǎng)出原代牙齦上皮細(xì)胞，平均約10～14d即可傳代，而組織塊法需要17～22d才可傳代，二者均未見(jiàn)牙齦成纖維細(xì)胞混雜，成功率都較高，可達(dá)88.9%，其中4號(hào)患者可能由于年齡較大，未能培養(yǎng)出原代牙齦上皮細(xì)胞。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，角蛋白染色呈陽(yáng)性，說(shuō)明原代培養(yǎng)出的細(xì)胞均為牙齦上皮細(xì)胞。

酶消化法在培養(yǎng)原代牙齦上皮細(xì)胞時(shí)具有一定的局限性，主要是由于各種消化酶的工作濃度和作用時(shí)間存在差異，很容易造成細(xì)胞消化過(guò)度導(dǎo)致細(xì)胞死亡，本研究對(duì)消化方法[5]進(jìn)行了一定的改進(jìn)。DispaseⅡ酶是作用于上皮及結(jié)締組織間連接基質(zhì)的一種蛋白酶，雖然作用溫和，但在37 ℃的培養(yǎng)箱中若作用時(shí)間過(guò)短則上皮與結(jié)締組織不易分離，作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使細(xì)胞活性降低，較難控制準(zhǔn)確的作用時(shí)間，所以采用4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，且降低工作濃度[7-9]，作用更加溫和，對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，最終上皮與結(jié)締組織能夠輕松分離。胰蛋白酶在消化上皮碎片的過(guò)程中，以往方法采用的工作濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為0.05%，改良法采用0.025%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不含EDTA的胰蛋白酶，濃度較常用方法減半，輕輕搖晃混勻后直接靜置于37 ℃的培養(yǎng)箱中，避免搖床振蕩過(guò)程對(duì)細(xì)胞造成的損傷。消化完成后組織塊與大量細(xì)胞粘連成絮狀，故并未將組織塊去除，而是改良為離心一次后將組織塊與細(xì)胞一同重懸沉淀，這樣既避免丟棄粘連于組織塊上的細(xì)胞，又減少了二次離心對(duì)細(xì)胞造成的損傷。組織塊在換液時(shí)即可丟棄，但培養(yǎng)出的原代牙齦上皮細(xì)胞僅能傳至二代，三代以后細(xì)胞逐漸變形凋亡，所以傳代消化的條件還需進(jìn)一步摸索[10]。

表3　改良酶消化法和組織塊法培養(yǎng)牙齦上皮細(xì)胞的比較

綜上所述，本研究改良的酶消化法方法在DispaseⅡ酶和胰蛋白酶的濃度、作用時(shí)間和方式上均采取了一定改進(jìn)，雖然消化后所得的細(xì)胞數(shù)量可能減少，但大大降低了酶消化過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性的影響，同時(shí)對(duì)離心過(guò)程也進(jìn)行了精簡(jiǎn)，從而保證了培養(yǎng)細(xì)胞最終的成活率得到提高。本實(shí)驗(yàn)采用的改良酶消化法克服了現(xiàn)有牙齦上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)，不存在滋養(yǎng)層細(xì)胞的污染，不會(huì)有牙齦成纖維細(xì)胞的混雜，成功率較高，原代至傳代培養(yǎng)時(shí)間短，二代以前都具有和原代細(xì)胞相似的形態(tài)，可以為牙齦上皮細(xì)胞的相關(guān)研究提供穩(wěn)定、可靠的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源。

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(2015-10-18收稿)

(本文編輯：王蕾)

Anmodifiedculturemethodofprimaryhumangingivalepithelialcells

YUJing-ting1,2,MENGHuan-xin1△,LIUKai-ning1

(1.DepartmentofPeriodontology, 2.DepartmentofGeneralDentistry,PekingUniversitySchoolandHospitalofStomato-logy&NationalEngineeringLaboratoryforDigitalandMaterialTechnologyofStomatology&BeijingKeyLaboratoryofDi-gitalStomatology,Beijing100081,China)

Objective：Toestablishastableprimaryculturemethodofhumangingivalepithelialcells,withahighersuccessfulrateandshorterculturetime.Methods:Ninepatientswhoreceived“crown-lengtheningsurgery”withrelativelyhealthyperiodontalconditionswereselected(n=9).Gingivalsampleswerecollectedfromthe9donorsduringgingivectomy.Gingivalepithelialcellswereisolatedandculturedbybothanadvancedenzymedigestionmethodandatissueexplantmethod.Intheadvancedenzymedigestioncultureprocess, 2.5g/LDispaseⅡwasusedtoseparatetheepithelialtissuepartfromtheconnectivetissuepart,whichlastedforonenight.Thentheepithelialtissuesweredigestedby0.025%trypsinwithoutEDTAfor10minutes,andcentrifugedbykeepingthedigestedepithelialtissuesthatremained.Thisadvancedmethodnotonlydecreasedtheconcentrationanddigestingtimeofthetwoabove-mentionedenzymes,butalsosimplifiedthecentrifugelprocess.Thetissueexplantmethodwasnotchangedtoomuchcomparedwiththeoriginalmethod.Growingprocessesoftheprimarycellsculturedbythetwomethodswereobservedandrecordedrespectively,andindirectimmunocytochemicalstainingwasusedtoidentifythetypeofculturedcells.Atthesametime,successfulratesandcellculturetimewerealsocomparedbetweenthetwomethods.Results:Humangingivalepithelialcellswithtypicalmorphologycouldbeculturedwithinashorterperiodbytheadvancedenzymedigestionmethodwithasuccessfulrateof88.9%,andproliferatedrapidlyassheets.After10-14dcellscouldbepassaged,graduallyturnedtobelikefibroblastswhenpassagedtothethirdgeneration,andeventuallywenttoapoptosis.Theprimaryculturetimewaslongerbyusingthetissueexplantmethod,andapproximatelyafter17-22dcellscouldbepassaged,althoughthesuccessfulratewasthesameastheenzymedigestionmethod.Cytokeratinstainingwasbothpositivebyindirectimmunocytochemicalstainingofcells.Conclusion:Primaryhumangingivalepithelialcellsculturedbytheadvancedenzymedigestionmethodcouldgrowfasterandbepassagedtothesecondgenerationsuccessfully,whichcouldsupplyastableoriginforcellularexperiments.

Gingiva；Epithelialcells;Primarycellculture

R781.4

A

1671-167X(2016)04-0733-05

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.04.033

△Correspondingauthor’se-mail,kqhxmeng@bjmu.edu.cn

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